油茶粕膳食纖維的超聲輔助酶法提取工藝優(yōu)化及理化性質(zhì)分析

張 智，宋偉，閆建英，薛紅洋

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

膳食纖維（Dietary Fiber，DF）作為第七大營(yíng)養(yǎng)素，有著突出的應(yīng)用前景。IDF 在自然界中的占比為90%以上，而SDF 的生理特性要優(yōu)于IDF，SDF含量在10%以上更好。油茶（）廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是世界四大木本油料樹種之一。油茶粕（meal）為油茶籽制油后的副產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，然而由于開發(fā)強(qiáng)度不足而造成了資源浪費(fèi)。從油茶粕中提取膳食纖維，不僅提高了油茶粕的附加價(jià)值，帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益，還可以避免資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

目前提高SDF 含量的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。李怡杰等使用微波法提取油茶粕SDF 的得率為12.55%，低于盧忠英等用微波輔助酶法提取SDF 的得率，陳曉媛用突變菌株發(fā)酵提取油茶粕SDF 得率為3.81%，持水力和膨脹力分別為2.50 g/g 和0.88 mL/g，均低于李怡杰等提取得到的IDF。馬力等提取得到的油茶粕膳食纖維溶脹性與持水力最高，但都未對(duì)提取的油茶粕膳食纖維理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行綜合分析。

酶法提取DF 條件溫和環(huán)保，纖維素酶可降低DF 分子量，增加SDF 含量。超聲波處理操作簡(jiǎn)單，可破壞多糖的化學(xué)鍵，影響聚合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，使組織疏松，活性成分更好的溶解。在適當(dāng)?shù)臈l件下使用超聲波處理可提高酶的活性，研究發(fā)現(xiàn)在17.33 W/cm的超聲條件下處理30 min 后，纖維素酶活性比原來(lái)提高約25%。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助酶法對(duì)油茶粕進(jìn)行處理來(lái)提高SDF 得率，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得高品質(zhì)膳食纖維，之后對(duì)TDF 的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行綜合分析。本實(shí)驗(yàn)酶用量少，提取時(shí)間較短，可減少經(jīng)濟(jì)與時(shí)間成本，為油茶粕的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶粕 重慶秀山提供（由實(shí)驗(yàn)室經(jīng)脫茶皂素處理）；纖維素酶（1×10U/g）和氏璧生物科技有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、葡萄糖、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品、-淀粉酶（150 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；石油醚（沸程為30～60 ℃）天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JSM-7500F 掃描電鏡 日本JEOL公司；Spectrum 400 傅里葉紅外光譜 美國(guó)Thermo Nicolet 公司；Zetapals 激光粒度儀 美國(guó)布魯克海文儀器有限公司；UV-5500PC 型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；SJ-3F 型pH 計(jì) 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；HY-200 標(biāo)準(zhǔn)篩（60 目）北京祥宇偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；JA2003 分析天平上海良平儀器儀表有限公司；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器公司；RT-6000 型酶標(biāo)儀 深圳雷杜生命科學(xué)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將油茶籽粕脫脂（浸泡于石油醚中24 h）并蒸干溶劑，脫蛋白（料液比1:10 g/mL；堿性蛋白酶1.0 %；pH9；1.5 h；60 ℃）脫淀粉（-淀粉酶1.0%；pH6；1.5 h；60 ℃），濃縮后加入四倍95%乙醇醇沉2 h 抽濾，將預(yù)處理后得到的固體烘干粉碎并過60 目篩，儲(chǔ)存在干燥器中備用。

1.2.2 膳食纖維制備工藝 將一定比例的纖維素酶加入經(jīng)過預(yù)處理后的油茶粕粉，用蒸餾水調(diào)節(jié)超聲酶解料液比，選擇適宜的酶解條件進(jìn)行超聲酶解處理。處理一段時(shí)間后高溫滅酶并離心，上清液加入4 倍體積的乙醇醇沉2 h 過濾干燥可得SDF，沉淀用乙醇和丙酮洗滌并干燥可得IDF，兩者混合則為TDF。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 酶添加量的影響 在pH5.5、溫度55 ℃、超聲時(shí)間30 min、超聲功率240 W、料液比1∶25 g/mL的條件下探究不同酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對(duì)SDF 得率的影響。

1.2.3.2 超聲時(shí)間的影響 確定酶添加量為0.2%，其他條件同上，探究不同超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)SDF 得率的影響。

1.2.3.3 超聲功率的影響 確定酶添加量為0.2%，超聲時(shí)間為30 min，其他條件同上，探究不同超聲功率（150、180、210、240、270 W）對(duì)SDF 得率的影響。

1.2.3.4 料液比的影響 確定酶添加量為0.2%，超聲時(shí)間為30 min，超聲功率為210 W，其他條件同上，探究不同料液比（1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL）對(duì)SDF 得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 以酶添加量（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）、料液比（D）四個(gè)因素，SDF 得率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，采用 Design Expert 2018 軟件建立四因素三水平試驗(yàn)，因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面條件優(yōu)化試驗(yàn)因素水平Table 1 Response surface condition optimization test factor level

1.2.5 得率測(cè)定

1.2.5.1 SDF 得率計(jì)算

式中：M表示SDF 干重，g；M表示樣品干重，g。

1.2.5.2 IDF 得率計(jì)算

式中：M表示IDF 干重，g；M表示樣品干重，g。

1.2.6 理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.6.1 持水力測(cè)定 按料液比1:25 g/mL 將TDF樣品與水加入離心管中，37 ℃攪拌1h 后于4000 r/min的條件下離心15 min，棄上清液并將離心管壁上多余水分吸干后稱量其重量。

式中：WHC 表示持水力，g/g；M表示吸水后樣品及離心管質(zhì)量，g；M表示離心管質(zhì)量，g；M表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.6.2 持油力測(cè)定 按TDF 樣品質(zhì)量與油的體積1:25 的比例加入離心管中，37 ℃攪拌1 h 后于4000 r/min 的條件下離心15 min，棄上層油后用吸干管壁多余油后稱重。

式中：OHC 表示持油力，g/g；M表示吸油后樣品及離心管質(zhì)量，g；M表示離心管質(zhì)量，g；M表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.6.3 膨脹力測(cè)定 將0.40 g TDF 樣品加入10 mL量筒中并記錄干樣體積，在量筒中加入8 mL 蒸餾水并攪拌均勻，于室溫條件下靜置24 h，記錄膨脹后的體積。

式中：SC 表示持油力，mL/g；V表示膳食纖維干樣體積，mL；V表示膳食纖維膨脹后體積，mL；M 表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.6.4 膽固醇吸附率測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]中的方法繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。取市售雞蛋蛋黃加九倍體積去離子水后混合均勻，在離心管中加入50 mg 的TDF 及15 mL 蛋黃液，使用NaOH 和HCl 溶液將pH分別調(diào)至2.0 及7.0 來(lái)分別模擬胃和腸道環(huán)境，37 ℃攪拌2 h 后 4000 r/min 離心20 min，取上清液檢測(cè)并計(jì)算膽固醇含量，實(shí)驗(yàn)做空白對(duì)照，按式（6）計(jì)算膽固醇吸附率。

式中：A表示膳食纖維吸附后膽固醇含量，mg；A表示膳食纖維吸附前膽固醇含量，mg；M 表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.6.5 葡萄糖吸附率測(cè)定 用DNS 法制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制濃度為0.1 mmol/mL，pH 為7 的葡萄糖溶液，取0.10 g TDF 樣品加入10 mL 葡萄糖溶液中，37 ℃攪拌6 h，此后在4000 r/min 的條件下離心20 min，取上清液按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法檢測(cè)并計(jì)算葡萄糖溶液濃度，實(shí)驗(yàn)做空白對(duì)照，按式（7）計(jì)算葡萄糖吸附率。

式中：A表示膳食纖維吸附后葡萄糖含量，mg；A表示膳食纖維吸附前葡萄糖含量，mg；M 表示樣品質(zhì)量，g。

1.2.7 結(jié)構(gòu)表征分析

1.2.7.1 紅外光譜（FT-IR）的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15]的方法略作修改，按干燥膳食纖維樣品與溴化鉀粉末1:100 的比例充分研磨并進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描波數(shù)400～4000 cm，掃描分辨率4 cm。

1.2.7.2 顯微結(jié)構(gòu)分析 將膳食纖維粉處理后進(jìn)行電鏡觀察，放大100、500 與1000 倍，拍照得到電鏡圖并進(jìn)行分析。

1.2.7.3 粒徑測(cè)定 參考文獻(xiàn)[17]的方法略作修改，將樣品與水 1:20 使用超聲混勻，并用激光粒度儀對(duì)油茶粕膳食纖維的粒徑分布情況進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)采用Excel 處理，響應(yīng)面試驗(yàn)由Design Expert8.0.6 進(jìn)行設(shè)計(jì)分析，作圖采用Origin2018 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)SDF 得率的影響 由圖1可知，隨酶添加量的增加，SDF 的得率呈先增加后減小的趨勢(shì)，在酶添加量為0.2%時(shí)所得的SDF 達(dá)到最高。這是因?yàn)槔w維素酶可將IDF 水解，因此部分IDF 轉(zhuǎn)化為SDF，SDF 得率增加，而酶用量過高時(shí)酶達(dá)到飽和，SDF 可能會(huì)被水解為小分子多糖、低聚糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)不能被乙醇沉淀，從而引起SDF 的得率下降。因此確定0.2%為纖維素酶最佳添加量。

圖1 酶添加量對(duì)SDF 得率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition amount on SDF yield

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)SDF 得率的影響 由圖2 可知，超聲時(shí)間在10～30 min 期間SDF 得率隨時(shí)間的增加而增大，超過30 min 后SDF 的得率開始迅速降低。這是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械震動(dòng)可加快其內(nèi)部分子運(yùn)動(dòng)，提高了酶解效率，當(dāng)時(shí)間超過30 min 后膳食纖維的結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，纖維素酶活性也隨著時(shí)間的增加及超聲導(dǎo)致的升溫而降低，故確定超聲酶解的最適時(shí)間為30 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)SDF 得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on SDF yield

2.1.3 超聲功率對(duì)SDF 得率的影響 由圖3 可知，超聲功率在150～210 W 范圍內(nèi)，SDF 的得率隨超聲功率的增大而增大，到210 W 時(shí)達(dá)到最高值，此后開始有所下降。超聲可能會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，隨著超聲功率增大，超聲波的機(jī)械效應(yīng)與空化效應(yīng)也會(huì)增強(qiáng)，IDF 中的化學(xué)鍵斷裂形成小分子物質(zhì)，超聲功率過大時(shí)可能會(huì)引起纖維素酶活性的降低，破壞膳食纖維結(jié)構(gòu)；超聲導(dǎo)致升溫，超聲功率大，溫度上升快，因此SDF 得率迅速下降。綜合考慮最適超聲功率為210 W。

圖3 超聲功率對(duì)SDF 得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on SDF yield

2.1.4 料液比對(duì)SDF 得率的影響 由圖4 可知，當(dāng)料液比為1:25 g/mL 時(shí)SDF 得率達(dá)到最高值，當(dāng)溶劑較少時(shí)，原料在溶液中得率較高，酶與底物不能充分接觸，SDF 溶出受限。當(dāng)溶劑升高，原料也在溶液中充分?jǐn)U散，酶與底物接觸充分，因此SDF 得率會(huì)有所升高。當(dāng)溶劑過多時(shí)，酶濃度降低，此時(shí)SDF 的得率也會(huì)降低。因此可得出最佳料液比為1:25 g/mL。

圖4 料液比對(duì)SDF 得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on SDF yield

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以SDF 得率（Y）為響應(yīng)值，考察酶添加量（A）、超聲酶解時(shí)間（B）、超聲功率（C）、料液比（D）4 個(gè)因素對(duì)SDF 得率的影響，試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2 所示。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Central combination experiment design scheme and results

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 由表3 可知，該回歸模型<0.0001，說(shuō)明此模型回歸效果達(dá)到極顯著，失擬項(xiàng)=0.1093>0.05 不顯著，=0.9505 線性關(guān)系較好，能夠反應(yīng)酶添加量、超聲酶解時(shí)間、超聲功率、料液比對(duì)SDF 得率的影響，可用于確定其最佳工藝。其回歸方程為：

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression model

Y=12.28+0.24A+0.33B+0.76C?0.66D+0.61AB?0.23AC+0.54AD?0.11BC+0.22BD+0.80CD?0.66A?1.08B?1.48C?0.75D

經(jīng)軟件分析可得三維響應(yīng)面及等高線圖（圖5～圖7）。圖5～圖6 說(shuō)明AD等高線比較圓潤(rùn)，響應(yīng)面坡度平緩，C（超聲功率）與D（料液比）之間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響比A（酶添加量）與D（料液比）之間的交互作用顯著，A（酶添加量）與B（超聲時(shí)間）的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響（<0.01）與A（酶添加量）與D（料液比）的交互作用（<0.05）相比更為顯著。圖7可根據(jù)等高線及響應(yīng)面坡度可直觀得出C（超聲功率）與D（料液比）之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響最為顯著（<0.01）。

圖5 酶添加量與超聲時(shí)間交互作用Fig.5 Interaction between the amount of enzyme and ultrasonic time

圖6 酶添加量與料液比交互作用Fig.6 Interaction between the amount of enzyme and solid-liquid ratio

圖7 超聲功率與料液比交互作用Fig.7 Interaction between ultrasonic power and solid-liquid ratio

2.2.2 最佳工藝參數(shù)及驗(yàn)證 通過Design Expert8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，得出最佳工藝條件為酶添加量0.21%，超聲時(shí)間31.42 min，超聲功率214.86 W，料液比1:23.49 g/mL，此時(shí)SDF 得率可達(dá)12.4732%。與實(shí)際結(jié)合將工藝條件修改為酶添加量0.2%，超聲酶解時(shí)間31 min，超聲功率210 W，料液比1:23 g/mL，在此條件下做3 次平行實(shí)驗(yàn)，得到SDF 得率為12.43%±0.14%，此結(jié)果與理論值相近，說(shuō)明基于響應(yīng)面優(yōu)化所得到的模型參數(shù)真實(shí)可靠。當(dāng)按最佳工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，IDF 得率為68.39%±0.27%。

2.3 理化性質(zhì)分析

由1.2.6 的方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.3555x+0.0843，=0.9991，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=38.614x+0.2315，=0.9993。由表4 所示，油茶粕TDF 的持水力為4.36 g/g，持油力為3.67 g/g，膨脹力為6.83 mL/g，由于TDF 含有較多親水集團(tuán)，可以與水分子結(jié)合，從而膨脹，可以有效減少腸炎及便秘的風(fēng)險(xiǎn)。TDF 在pH 為2 的條件下膽固醇吸附率為5.79 mg/g，小于pH 為7 時(shí)的膽固醇吸附率，這與小米麩皮所得到的結(jié)論相似，而滇橄欖果渣總膳食纖維的膽固醇吸附率pH 為2 時(shí)更高，這可能是由于原料不同，性質(zhì)有所不同。油茶粕 TDF 的葡萄糖吸附率為11.49 mg/g，TDF 可通過吸附膽固醇、葡萄糖等物質(zhì)來(lái)預(yù)防高血糖、高血脂等疾病。

表4 油茶粕TDF 理化性質(zhì)Table 4 Physicochemical properties of TDF of Camellia oleifera meal

2.4 結(jié)構(gòu)表征分析

2.4.1 紅外光譜（FT-IR）的測(cè)定 TDF 的紅外分析如圖8 所示，TDF 在3458 cm處有圓潤(rùn)且寬的吸收峰，此處為O-H 伸縮振動(dòng)峰，此處有處于締合狀態(tài)的氫鍵，可推測(cè)油茶粕TDF 含有纖維素與半纖維素。在2928 cm左右處的吸收峰證明有C-H基團(tuán)，證明有糖類物質(zhì)的存在。1615 cm處的吸收峰是由木質(zhì)素中芳香苯基團(tuán)產(chǎn)生的。1354 cm處的吸收峰證明有C-H 的變角振動(dòng)峰的存在，1000～1200 cm處有糖類C-O 吸收峰的存在，這些吸收峰表明油茶粕TDF 符合膳食纖維的結(jié)構(gòu)特征。

圖8 油茶粕TDF 紅外光譜Fig.8 TDF infrared spectrum of Camellia oleifera meal

2.4.2 顯微結(jié)構(gòu)分析 采用電子掃描顯微鏡觀察TDF 的表面特征，如圖9 所示，膳食纖維的孔隙特征與有效表面特征有關(guān)，當(dāng)放大倍數(shù)為100 倍時(shí)，TDF具有空腔且形狀不規(guī)則的塊狀結(jié)構(gòu)，顆粒大小不均勻，表面有孔狀結(jié)構(gòu)且凹凸不平。當(dāng)放大倍數(shù)為500、1000 倍時(shí)可觀察到疏松的孔狀結(jié)構(gòu)，有蜂巢型的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)特征，表面粗糙且凹凸不平，空間結(jié)構(gòu)比較均勻，由于蜂巢狀的小孔使得TDF 表面積更大，造就了良好的親水性，因此有著更好的持水力和持油力。

圖9 油茶粕TDF 掃描電鏡Fig.9 TDF scanning electron microscopy of Camellia oleifera meal

2.4.3 粒徑測(cè)定 油茶粕TDF 的粒度分布如圖10所示，其平均粒徑為50.699 nm，由圖可知膳食纖維呈現(xiàn)單峰分布的狀態(tài)，近似正態(tài)分布，且峰波較窄，膳食纖維顆粒尺寸比較均勻。這與李鵬沖等提取的可溶性膳食纖維結(jié)果相似，均為單峰且近似正態(tài)分布。

圖10 油茶粕TDF 粒徑分布Fig.10 Particle size distribution of camellia oleifera mealdietary fiber

3 結(jié)論

以油茶粕為原料進(jìn)行前處理后以SDF 的得率為指標(biāo)進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，確定最佳工藝條件為酶添加量0.2%、超聲酶解時(shí)間31 min、超聲功率210 W、料液比1:23 g/mL，此時(shí)SDF 得率為12.43%，IDF得率為68.39%。此工藝條件用酶量少，提取時(shí)間短，減少了經(jīng)濟(jì)與時(shí)間成本。

對(duì)TDF 的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)表明油茶粕TDF 的持水力為4.36 g/g、持油力為3.67 g/g、膨脹力為6.83 mL/g、膽固醇吸附率在pH2 時(shí)為5.79 mg/g，pH7 時(shí)為8.38 mg/g，葡萄糖吸附率為11.49 mg/g。油茶粕TDF 理化性質(zhì)良好。在不同條件下膽固醇吸附率不同，油茶粕TDF 在腸道環(huán)境下更容易吸附膽固醇。通過對(duì)TDF 的結(jié)構(gòu)表征研究可知，油茶粕TDF 具有蜂巢型多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且顆粒均勻，含有糖類、木質(zhì)素、纖維素及半纖維素，結(jié)構(gòu)表征結(jié)果表明油茶粕TDF 具有膳食纖維的結(jié)構(gòu)特征。

本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助酶法對(duì)油茶粕SDF 進(jìn)行工藝優(yōu)化，并對(duì)油茶粕TDF 進(jìn)行了理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征分析，為今后油茶粕膳食纖維的提取提供理論基礎(chǔ)，并對(duì)油茶粕的有效開發(fā)利用提供了理論參考。在今后的實(shí)驗(yàn)中可以對(duì)多種提取方法對(duì)比，獲得更加優(yōu)質(zhì)的油茶粕膳食纖維。