玉露香梨采后病原菌分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

侯亞茹，高振峰，楊志國，陳恬，張陽，關(guān)軍鋒，張立新，張曉宇,

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太原 030031；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所，河北石家莊 050051）

“玉露香”梨（‘Yuluxiang’）是以庫爾勒香梨為母本，雪花梨為父本雜交育成的優(yōu)質(zhì)中熟梨新品種，富含多種糖類、礦物質(zhì)及其它營養(yǎng)元素。但玉露香梨屬于呼吸躍變型果實，水分含量高，采后貯運過程中易受到機械損傷，導(dǎo)致病原菌從傷口處侵入誘發(fā)病害。據(jù)統(tǒng)計，玉露香梨每年采后損失約20%～25%，而真菌侵染導(dǎo)致的腐爛是造成梨果采后損失重要因素之一。有研究表明，引起梨果采后腐爛的病原微生物主要有和等；牛佳佳等分離到酥梨貯藏期間病原菌主要有和，其中是生長最快和傳染性較強的致病菌；對金刺梨黑斑病則主要是由真菌引起；而庫爾勒香梨黑斑病則主要是由交鏈孢（）和細極鏈隔孢（）導(dǎo)致。關(guān)于玉露香梨貯藏期間病原菌的研究少有報道，因此，本研究對玉露香梨貯藏期間病原菌進行分離鑒定，并初步研究其生物學(xué)特性，旨在為玉露香梨貯藏過程中病害的侵染規(guī)律和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉露香梨 在2020 年9 月份采于山西省臨汾市隰縣寨子鄉(xiāng)，采后24 h 內(nèi)運回實驗室。挑選大小均一、無病蟲害、無機械損傷的果實，存放于0±1 ℃貯藏庫中備用；Tris 緩沖劑 北京索萊寶科技有限公司；葡糖糖 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉 分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；引物1、引物4 華大基因；PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蒸餾水1 L，葡萄糖20 g，瓊脂18 g）；PDB 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蒸餾水1 L，葡萄糖20 g）；查氏培養(yǎng)基（NaNO3 g，KHPO1 g，MgSO·7HO 0.5 g，KCI 0.5 g；FeSO·7HO 0.01 g；蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L）。

SW-CJ-1FD 單人超凈工作臺 浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；DH 電熱恒溫箱 天津市通利信達儀器廠；DYY-6C 電泳儀 北京市六一儀器廠；WFH-202 紫外透射分析儀 上海精科實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌的分離鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離純化 取自然發(fā)病梨果感染組織病健交界處的小塊組織（約 5 mm×5 mm）放入75%的酒精中浸泡30 s，用無菌水沖洗3 次，移入3%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，再用無菌水清洗3 次，取出后用濾紙吸干組織塊，接入PDA 平板中，28 ℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)出的菌落直徑生長至1 cm時，挑取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接入PDA 培養(yǎng)基平板中，28 ℃恒溫培養(yǎng)；重復(fù)上述操作2～3 次得到純化的病原菌，移入試管低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 病原菌的致病性檢測 根據(jù)柯赫氏法則，選取健康大小、成熟度一致的玉露香梨，75%的酒精表面消毒后用無菌水沖洗，晾干后進行接種處理：在果肩部切下約5 mm 深、5 mm 直徑的圓形傷口，用打孔器取PDA 平板培養(yǎng)3～5 d 的5 mm 病原菌餅，接至傷口位置，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。以接PDA 培養(yǎng)基為對照，重復(fù)3 次。觀察是否與自然發(fā)病的病原菌特征相一致。

1.2.1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察 將純化的病原菌培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落外觀形態(tài)。待產(chǎn)孢后，挑取少量孢子或菌絲，在顯微鏡下觀察菌株的組織結(jié)構(gòu)：分生孢子及孢子梗的形狀，有無分枝狀態(tài)等。參照魏啟超和葛啟新等的方法，對病原菌進行初步鑒定。

1.2.1.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 總DNA 的提取：將純化的病原菌接種到100 mL PDA 培養(yǎng)基中,在室溫下振蕩培養(yǎng)7 d，然后對菌絲進行過濾和收集。液氮冷凍研磨成細粉，用CTAB 法提取純化基因組DNA，將提取獲得的DNA 樣品放于?60 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

病原菌rDNA-ITS 擴增與序列分析：按照上述方法提取真菌DNA 后，采用真菌通用引物（ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增rDNA-ITS區(qū)段。PCR 反應(yīng)體系為（50 μL）：模板DNA 4 μL，引物1、引物4 各2 μL，Premix Tap 25 μL，ddHO 17 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性55 s；50 ℃退火 50 s；72 ℃ 延伸 55 s；循環(huán)32 次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送去北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

將所得rDNA-ITS 區(qū)段序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 同源性檢索，采用MEGA version 7.0.14 軟件對同源序列與目的序列進行比對，以Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析親緣關(guān)系。

1.2.2 生物學(xué)特性

1.2.2.1 最適溫度的篩選 將直徑5 mm 的菌餅接入PDA 培養(yǎng)基中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)5 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，10 d 后，用血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量，處理3 次重復(fù)。

1.2.2.2 最適pH 的篩選 用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 調(diào)配PDA 培養(yǎng)基，使其pH 分別為4、5、6、7、8、9、10、11，將菌餅接入不同pH 培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，10 d 后，用血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量，處理3 次重復(fù)。

1.2.2.3 最適碳源和氮源的篩選 以查氏培養(yǎng)基（Czapek）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按等量的碳源（麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉）替換Czapek 培養(yǎng)基中的蔗糖，以缺碳作對照，研究不同碳源對菌絲體生長和產(chǎn)孢量的影響。同樣，按等量氮源（蛋白胨、牛肉膏、甘氨酸、尿素、硝酸銨、硫酸銨）替換Czapek 培養(yǎng)基中的硝酸鈉，以缺氮作對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d 后用十字交叉法測量菌落直徑。10 d 后，用血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量，處理3 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007 和SPSS 23.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和Origin2021 軟件作圖，并應(yīng)用Duncan 氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

2.1.1 病原菌的分離純化 從玉露香梨病健交界處組織中共分離純化出6 種形態(tài)、顏色和生長速度差異較為明顯的純培養(yǎng)物，命名為YL1～6。YL1 菌落初期為灰白色，后期為灰褐色；YL2 菌落初期為黃白色，后期為黃綠色；YL3 菌落初期為白色，后期長出許多灰藍色孢子；YL4、YL5、YL6 菌落顏色略有一些差異，菌絲體形態(tài)極為接近，可能為同一種病原菌。

2.1.2 病原菌致病性 純化后的病原菌接種到梨果傷口3 d 后，病斑從傷口處開始擴散，這表明所分離的菌株均具有致病性（圖1），在玉露香梨果實上均表現(xiàn)出發(fā)病癥狀。YL1 發(fā)病癥狀：近圓形病斑，初為褐色，后漸變?yōu)榛液稚砻嫔园枷?，四周黑褐色；YL2 病果迅速軟腐，貯藏時間長會流水，表面布滿青綠色霉堆；YL3 病果病斑近圓形，淡褐色，軟腐，略凹陷；YL4、YL5 和YL6 發(fā)病癥狀相近，傷口中央有菌絲附著，略凹陷，輕微軟腐。其發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀一致。對照不發(fā)病。對回接后的病原菌再次進行分離培養(yǎng)，經(jīng)鑒定仍為最初接種的菌株。

圖1 病原菌回接發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of natural and artificial inoculation

2.1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定分析 純化的病原菌從菌落特征和顯微形態(tài)觀察研究發(fā)現(xiàn)（圖2），病原菌YL1 菌絲生長迅速、菌落均勻，有明顯的基內(nèi)菌絲，菌落逐漸從灰白色加深變?yōu)樯罨疑z絨狀致密；顯微鏡觀察分生孢子梗呈黃褐色，近橢圓形，具橫隔，孢身中部的隔膜較粗，呈褐色；根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)方面YL1 同較相似，與已報道的番蓮果果腐病原菌和奉新獼猴桃黑斑病病原菌極為接近。

圖2 病原菌在培養(yǎng)基的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.2 Colony morphology and micromorphology of pathogen in culture medium

YL2 菌落生長較快、結(jié)構(gòu)疏松，呈黃綠色；顯微鏡下觀察，菌絲體無色，分生孢子初為球形，后呈輻射型，無色；根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)方面YL2 同較為相似。

YL3 菌落呈灰藍色，密氈狀，生長較為緩慢；顯微鏡下觀察分生孢子鏈狀著生，菌絲有分枝、分隔，有橫膈膜；根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)方面YL3 同較為相似，與已報道的柑橘采后腐爛病原菌較為相似。

YL4、YL5 和YL6 除PDA 平板菌落顏色略有一些不同之外，菌絲和孢子形態(tài)極為接近。菌落突起白色絨毛狀，淺粉色，菌絲白色質(zhì)密；顯微鏡下觀察小型分生孢子著生于單生瓶梗上，大型分生孢子無色、多胞，鐮刀形，兩端細胞稍尖；根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)方面YL4 同較為相似；YL4、YL5 和YL6 菌絲和孢子形態(tài)很接近，其形態(tài)特征與已報道的黃連根腐病鐮刀菌（）較為接近。

2.1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 測序結(jié)果表明，菌株YL1、YL2、YL3、YL4、YL5、YL6 的PCR 擴增長度分別為500 bp 左右（圖3），符合真菌ITS 區(qū)序列長度范圍，表明ITS 區(qū)通用引物成功的擴增了玉露香梨采后腐爛病原菌的ITS 基因序列。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知（圖4～圖7），YL1 的ITS 序列與的ITS 序列（登錄號：MZ951051.1、MZ298823.1、OL514181.1、MW474904.1、OM0498 21.1）緊密地聚在同一分枝，同源性達100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征綜合分析，病原菌YL1 為；YL2 的ITS 序列與sp.的ITS 序列（登錄號MT645617.1、MT645322.1、MT584825.1、MT497446.1、OK235450.1、OK217263.1、MW788 477.1、NR171607.1、NR171606.1 ）同源性達100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征綜合分析，病原菌YL2 為sp.；YL3 的ITS 序列與的ITS 序列（登錄號MF979522.1、MT158684.1、MG228408.1 ）同源性達100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征綜合分析，病原菌YL3 為；YL4～6的ITS 序列與的ITS 序列（登錄號：MT482502.1、LC500064.1、OM017211.1、MW791 922.1、MT463390.1、MK250655.1、MK407333.1、AB 470855.1、MK407347.1、MK407211.1、MW067648.1）同源性達99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征綜合分析，病原菌YL4～6 為sp.。

圖3 病原菌 PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測Fig.3 Detection of pathogenic fungi PCR amplification products by gel electrophor

圖4 基于ITS 基因序列構(gòu)建的病原菌YL1 系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of pathogenic bacteria YL1 based on ITS gene sequences

圖5 基于ITS 基因序列構(gòu)建的病原菌YL2 系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of pathogenic bacteria YL2 based on ITS gene sequences

圖6 基于ITS 基因序列構(gòu)建的病原菌YL3 系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of pathogenic bacteria YL3 based on ITS gene sequences

圖7 基于ITS 基因序列構(gòu)建的病原菌YL4～6 系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of pathogenic bacteria YL1～6 based on ITS gene sequences

2.2 生物學(xué)特性研究結(jié)果

2.2.1 最適溫度 溫度對病原菌、和菌絲體生長和產(chǎn)孢量有顯著（<0.05）影響（圖8）。該些菌株在10～35 ℃均可生長，不同溫度下菌絲體生長和產(chǎn)孢量不同，不同病原菌的最適溫度也不同。其中，和最適生長溫度為25～30 ℃，在此溫度下，菌落直徑達5.9 和6.2 cm，產(chǎn)孢量達3.89 和3.21 lg（CFU/mL），菌落直徑達6.2 和6.1 cm，產(chǎn)孢量達4.39和3.48 lg（CFU/mL），顯著（<0.05）高于其余溫度；最適溫度為25～35 ℃，其菌落直徑分別為5.23、6.11 和6.21 cm，產(chǎn)孢量達7.9、6.5 和6.8 lg（CFU/mL）；最適生長溫度為20 ℃～25 ℃，菌落直徑達3.6 和2.7 cm，25 ℃時產(chǎn)孢量最高，可達8.4 lg（CFU/mL）。菌株、和培養(yǎng)5 和10 d 后，在5 ℃條件下不生長且不產(chǎn)孢，和在溫度≥35 ℃下生長緩慢，說明菌株不耐高溫。而和在40 ℃仍可生長，說明菌株耐高溫。四株菌株均在25 ℃時產(chǎn)孢量最高。因此，推測玉露香梨采后病原菌的發(fā)生多在25 ℃左右，在這個溫度對應(yīng)的季節(jié)之前應(yīng)做好該病害的防控工作。

圖8 溫度對病原菌菌絲體生長和產(chǎn)孢量的影響Fig.8 Effects of temperature on mycelial growth and sporulation of pathogenic bacteria

2.2.2 最適pH pH 對菌株的生長也有一定的影響（圖9）。其中，最適生長pH 在6～10，其菌落直徑達6、6.1、6.4、6.3 和5.7 cm，產(chǎn)孢量為5.3、4.8、4.5、4.3 和4.1 lg（CFU/mL）；在pH 小于6 時生長緩慢，說明該菌株在偏堿性環(huán)境中均可生長；最適生長pH為7，菌落直徑達7.2 cm，產(chǎn)孢量為7.8 lg（CFU/mL），在pH 大于7 時生長逐漸下降，說明該菌株在偏中性環(huán)境中生長較好；和最適生長范圍在5～7，菌落直徑分別為6.5、5.9 和6.7 cm、菌落直徑為6.7、7 和7.4 cm，產(chǎn)孢量4.7、4.8 和4.7 lg（CFU/mL）。最適產(chǎn)孢量在7，產(chǎn)孢量為4.21 lg（CFU/mL），適合在偏酸中性環(huán)境中生長。

圖9 pH 對病原菌菌絲體生長和產(chǎn)孢量的影響Fig.9 Effects of pH on mycelial growth and sporulation of pathogenic bacteria

2.2.3 最適碳源 病原菌、和可利用多種碳源（圖10）其中，最適碳源為葡萄糖，菌落直徑達6.5 cm、產(chǎn)孢量為5.42 lg（CFU/mL），顯然葡萄糖對該菌株有促進生長的作用，碳源為果糖時生長較緩慢，菌落直徑3.01 cm、產(chǎn)孢量為2.33 lg（CFU/mL）；最適碳源為麥芽糖，直徑達4.51 cm、產(chǎn)孢量4.2 lg（CFU/mL）。其次是甘露醇和乳糖，碳源為果糖和可溶性淀粉時生長較緩慢；最適碳源為甘露醇，直徑達4.5 cm、產(chǎn)孢量為6.52 lg（CFU/mL），碳源為葡萄糖和可溶性淀粉時生長較為緩慢，可見該菌對葡萄糖和可溶性淀粉的適應(yīng)能力較差；最適生長碳源為麥芽糖，直徑6.75 cm，碳源是乳糖時產(chǎn)孢量最大，產(chǎn)孢量為4.31 lg（CFU/mL）。

圖10 碳源對病原菌菌絲體生長和產(chǎn)孢量的影響Fig.10 Effects of carbon sources on mycelial growth and sporulation of pathogenic bacteria

2.2.4 最適氮源 病原菌、和在6 種供試氮源均可生長，同一菌株在不同氮源的生長不同，相同氮源培養(yǎng)基上各菌株生長和產(chǎn)孢也略有不同（圖11），其中和最適生長氮源為牛肉膏，其菌落直徑為6.8 和6.52 cm，產(chǎn)孢量最大氮源為蛋白胨，達4.7 lg（CFU/mL），最適生長氮源為蛋白胨，直徑4.7 cm、產(chǎn)孢量4.75 lg（CFU/mL）；最適生長氮源為牛肉膏，菌落直徑達7.8 cm，其次是硝酸銨7.3 cm，氮源是甘氨酸時產(chǎn)孢量最大，可達3.8 lg（CFU/mL）。當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時，菌株、和生長速度和產(chǎn)孢量明顯低于CK值，由此可見，硫酸銨對該些病原菌有明顯的抑制作用。根據(jù)這一研究結(jié)果可以考慮在玉露香梨種植過程中避免施加硝態(tài)類肥料，可適量施加硫酸銨以抑制病原菌生長，降低腐爛病的發(fā)生。

圖11 氮源對病原菌菌絲體生長和產(chǎn)孢量的影響Fig.11 Effects of nitrogen sources on mycelial growth and sporulation of pathogenic bacteria

3 結(jié)論

本研究通過分離鑒定得到玉露香梨采后病原菌主要有、、和。對玉露香梨采后腐爛病原菌生長溫度、pH 和最適碳氮源研究發(fā)現(xiàn)，最適生長溫度為25～30 ℃，最適生長pH為6～10最適生長碳氮源分別為葡萄糖和牛肉膏；最適生長溫度為25～35 ℃，最適生長pH 為6～10，最適生長碳氮源為麥芽糖和牛肉膏最適生長溫度為20～25 ℃最適生長pH 為5～7，最適生長碳氮源為甘露醇和蛋白胨；最適生長溫度為25～30 ℃，最適生長pH 為5～7，最適生長碳氮源為麥芽糖和牛肉膏。這一結(jié)論為探究玉露香梨貯期病原微生物多樣性和采后貯藏特性提供理論基礎(chǔ)。