核桃球蛋白的分離純化、鑒定及抗氧化性分析

徐 倩，陳洲，王青華，韓盼盼，李思霆，馬愛進(jìn)，賈英民，展遠(yuǎn)蓉

（北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

核桃（L.）屬斗科目胡桃科胡桃屬植物,是世界四大堅(jiān)果之一。我國核桃栽培歷史悠久，種植面積及總產(chǎn)量已遠(yuǎn)超美國，截至2018 年底，我國核桃種植面積為816.57 萬m，核桃年產(chǎn)量383 萬t。核桃仁營養(yǎng)價(jià)值很高，其蛋白質(zhì)含量達(dá)15%～20%，核桃經(jīng)壓榨制油后會(huì)產(chǎn)生大量的餅粕，其蛋白質(zhì)含量更是可達(dá)50%，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。然而，目前核桃粕大多只被用作動(dòng)物飼料、植物肥料，甚至直接丟棄，其附加值利用率較低。因此，如何研究開發(fā)核桃粕蛋白的應(yīng)用價(jià)值對(duì)實(shí)現(xiàn)核桃粕的綜合利用、提高其附加值具有重要意義。

國內(nèi)外對(duì)核桃蛋白的研究集中在蛋白的提取、理化性質(zhì)及其活性多肽方面的研究。根據(jù)溶解性的不同，核桃蛋白可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中，清蛋白和球蛋白的溶解性最佳，其中清蛋白的溶解度61.23%、球蛋白的溶解度可達(dá)近25%，目前相關(guān)研究也最多。清蛋白約占核桃總蛋白6.81%，它也是核桃蛋白研究熱點(diǎn)的最主要對(duì)象，包括清蛋白的提取、酶解制備多肽的工藝條件以及清蛋白和酶解肽生物活性的探究等。相比之下，球蛋白的含量更高，約占17.57%，但針對(duì)球蛋白的科學(xué)研究卻較少?，F(xiàn)有研究中，關(guān)于球蛋白的報(bào)道主要集中在蛋白提取、功能特性和過敏性測定等方面，韓海濤等利用Osborne 法制備冷榨核桃球蛋白，并對(duì)其功能性質(zhì)進(jìn)行研究。Blankestijn 等純化得到核桃11S 球蛋白Jug r4，并對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE 印跡分析，以鑒定其是否為核桃過敏原蛋白；Downs 等鑒定和表征了來自核桃7S 種子儲(chǔ)存球蛋白原蛋白N 末端區(qū)域的一系列肽，表明成熟的7S 球蛋白和新表征的7S 球蛋白N 端肽是兩種不同類型的過敏原。而對(duì)球蛋白的組成信息、生物活性的探究等方面的研究卻很少，這一定程度上限制了它的開發(fā)與應(yīng)用。

本研究即以榨油后核桃粕為對(duì)象，提取其中球蛋白組分，通過純化獲得球蛋白主要組分，進(jìn)一步探究球蛋白及其純組分的功能活性，以期為脫脂核桃粕的深度開發(fā)以及核桃蛋白的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考，具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃粕（北方香玲核桃）由河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司提供；乙腈（質(zhì)譜級(jí)）、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺（分析純）Fisher Chemical 公司；測序級(jí)胰蛋白酶（酶活力14742 U/mg）Promega 公司；HiTrapCaptoQ、SephacrylS-100 High Resolution 柱料美國GE 公司；丙烯酰胺（純度≥99.9%）、甲叉雙丙烯酰胺（純度≥98%）北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；ABTS（純度≥98%）北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

Ultimate 3000 毛細(xì)管高效液相色譜儀、Q Exactive? Hybrid Quadrupole-Orbitrap? Mass Spectrometer 電噴霧-組合型離子阱、Orbitrap 質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司；Allegra X-30R 型高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；Alpha 2-4 LD Plus 型冷凍干燥機(jī) 德國Christ 公司；INFINITE Spark 10M 型多功能酶標(biāo)儀 瑞士TECAN 公司；Cary 60 型紫外可見分光光度儀 Agilent 公司；BS-100A 型自動(dòng)部分收集器、BT-100 型恒流泵、TH-500梯度混合器 上海瀘西分析儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 核桃粕經(jīng)粉碎后過80 目篩，在4 ℃條件下，用正己烷（m:V=5:1）處理1 h后抽濾得到濾餅，濾餅用正己烷再次處理，直至濾液呈無色為止，收集濾餅，于通風(fēng)櫥中揮干剩余溶劑，在4 ℃貯存。

1.2.2 核桃球蛋白提取 球蛋白根據(jù)改進(jìn)的Osborne法制備：將脫脂粉與蒸餾水按1:10（w/v）的比例混合，然后在恒溫水浴搖床中保溫振蕩，離心棄上清液。對(duì)沉淀進(jìn)行兩次上述操作，收集沉淀加入一定體積1 mol/L NaCl 溶液，充分混勻，在37 ℃保溫振蕩提取1 h 后，4 ℃、8000 r/min 離心30 min 取上清液，再重復(fù)提取2 次。收集上清液于4 ℃條件下用濾紙濾去不溶物后用蒸餾水透析，冷凍干燥獲得球蛋白粗提物。蛋白含量依據(jù)GB 5009.5-2016測定,氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為6.25。球蛋白提取率，公式（1）：

1.2.3 球蛋白等電點(diǎn)測定 參照李婷等的方法進(jìn)行改進(jìn)，取4 mL 核桃球蛋白提取液6 份，初步調(diào)節(jié)pH 分別為3、4、5、6、7、8，靜置后10000 r/min 離心5 min，在280 nm 下測定上清液吸光度。根據(jù)上述結(jié)果，參考訾艷等的方法，再在吸光度最低時(shí)的pH 附近均衡選擇5 個(gè)點(diǎn)，間隔為0.2，重新準(zhǔn)備5 份蛋白提取液，按此條件分別調(diào)節(jié)每管的pH。靜置后10000 r/min 離心5 min，測定上清液中蛋白質(zhì)含量，蛋白含量測定采用BCA 試劑盒法，蛋白含量最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH 即為球蛋白的等電點(diǎn)。

1.2.4 球蛋白純化

1.2.4.1 HiTrapCaptoQ 離子交換層析 采用HiTrapCaptoQ 作為固定相，純化的色譜條件為：先用平衡緩沖液（25 mmol/L pH8.5 的Tris-HCl溶液）平衡離子交換柱后，步驟1.2.2 提取得到球蛋白粗提物用平衡緩沖液溶解，經(jīng)4 ℃、8000 r/min 離心5 min 后取上清液，上清液過0.45 μm 濾膜后上柱，再用初始濃度0 mol/L、最高濃度2 mol/L 氯化鈉的25 mmol/L pH8.5 的Tris-HCl 緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，1 mL/管分管收集。收集后測定每管溶液的A值，繪制洗脫曲線，分別將各峰收集后用SDS-PAGE 電泳分析，然后分別于4 ℃截留分子質(zhì)量為3500 Da 的透析袋中透析72 h。透析完畢后收集蛋白溶液，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?，以待進(jìn)一步純化。

1.2.4.2 SephacrylS 100HR 凝膠過濾層析 用含有0.3 mol/L NaCl 的PBS（50 mmol/L，pH7.4）平衡SephacrylS 100HR 柱（1.6 cm×120 cm），上一步離子交換層析純化得到峰1 蛋白樣品經(jīng)過3 kDa 濾膜超濾濃縮后過0.45 μm 濾膜后上柱，再用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為1 mL/3 min，采用自動(dòng)部份收集器收集洗脫液測定A值，繪制洗脫曲線。分別將各峰收集后用SDS-PAGE 電泳分析，收集得到各峰的蛋白溶液分別于4 ℃截留分子質(zhì)量為3500 Da的透析袋中透析72 h 后收集蛋白溶液，?80 ℃冷凍過夜后真空冷凍干燥，收集凍干粉于?20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 蛋白表征

1.2.5.1 SDS-PAGE 分析 制備12.5%分離膠、4.5%濃縮膠，電極緩沖液為0.025 mol/L Tris-HCl、0.1%SDS、0.192 mol/L 甘氨酸的緩沖溶液。樣品在濃縮膠中電壓為80 V，進(jìn)入分離膠之后將其增至110 V。電泳完畢后染色30 min，最后脫色至背景透明。（Maker：雞蛋清溶菌酶14.4 kDa、人生長素22.0 kDa、牛碳酸酐31.0 kDa、兔肌動(dòng)蛋白43.0 kDa、牛血清白蛋白66.2 kDa、兔磷酸化酶97.4 kDa，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?1.1608x+2.0666，=0.9807）。

制備15.5%分離膠、10%夾層膠、4%濃縮膠，陽極緩沖液為pH8.9、2 mol/L Tris-HCl 溶液、陰極緩沖液為0.1 mol/L Tris-HCl、0.1% SDS、0.239 mol/L甘氨酸的緩沖溶液。樣品在濃縮及夾層膠中電壓為30 V，進(jìn)入分離膠之后將其增至110 V。電泳完畢后考馬斯亮藍(lán)染色30 min，最后脫色至背景透明（Maker：3.3、5.8、7.8、14.4、20.1 kDa，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?1.8612x+2.4，=0.9574）。

1.2.5.2 Native-PAGE 分析 1.2.4.2 步驟中得到峰1 蛋白用水溶解，然后與緩沖溶液按體積比為1:2混合，緩沖溶液中含有30%甘油、12.5%Tris-HC1（0.5 mol/L，pH6.8）和2%質(zhì)量濃度為0.5%溴酚蘭，充分混合后參照文獻(xiàn)[28]方法進(jìn)行Native-PAGE檢測。

1.2.6 蛋白分析與鑒定

1.2.6.1 胰蛋白酶酶解 將Native-PAGE 上的目的條帶切成1 mm的膠粒，分別裝入1.5 mL 塑料離心管中，加入含有50%乙腈-50% 50 mmol/L NHHCO的脫色液進(jìn)行脫色，靜置10～30 min 后除去脫色液，重復(fù)此操作至膠粒無色。每管各加入100 μL 純乙腈溶液，放置30 min，待膠粒呈白色索至團(tuán)狀，棄去乙腈，室溫放置干燥。然后每管各加入100 μL 10 mmol/L的DTT，于56 ℃水浴條件下還原1 h 后，除去DTT，之后再按照100 μL/管的比例加入55 mmol/L 的IAA，室溫避光反應(yīng)1 h，除去溶劑。之后再加脫色液（50%乙腈-50% 50 mmoL/L NHHCO）洗一遍，除去溶劑后，加入100 μL 純乙腈，放置30 min，待膠粒呈白色索至團(tuán)狀，棄去乙腈，室溫放置干燥。用50 mmol/L NHHCO溶液配制得到濃度為0.22113 U/μL 的酶液，按照7～10 μL/管的量加入酶液，于4 ℃條件下孵育40 min 后取出，每管補(bǔ)加5～10 μL 50 mmol/L NHHCO溶液，密封于37 ℃水浴條件下反應(yīng)16 h。然后每管加100 μL 提取液（5%甲酸-50%乙腈-45%水，于37 ℃條件下水浴1 h后，超聲5 min，離心5 min，將提取液移入另一新離心管中，重復(fù)提取一次，將提取液合并，真空離心干燥。酶切后的肽段使用自填脫鹽柱脫鹽，于45 ℃真空離心濃縮儀中揮干溶劑備用以待下一步質(zhì)譜檢測。

1.2.6.2 LC-MS/MS 檢測 將上述處理好的樣品在流動(dòng)相A（0.1%甲酸，2%乙腈/水）中溶解后使用自填脫鹽柱脫鹽，在線LC-MS/MS 分析。LC-MS/MS過程參數(shù)設(shè)置為：

毛細(xì)管液相色譜分離條件：流動(dòng)相A 為含有體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，2%乙腈的超純水，流動(dòng)相B 為含有體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，19.9%超純水的乙腈溶液，預(yù)柱為packed with Acclaim PepMap RPLC C（100 ?，5 μm，300 μm×5 mm），流速為600 nL/min。經(jīng)過反復(fù)多次的試驗(yàn)，最終采用線性梯度洗脫程序?yàn)椋洪_始0 min，4% B；0～2 min，4%～8% B；2～45 min，8%～28%；45～55 min，28%～40% B；55～56 min，45%～95% B；56～66 min，95% B。

質(zhì)譜條件：一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：Resolution：70000；AGCtarget：3e6；MaximumIT：40ms；Scanrange：300 to 1800 m/z；二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：Resolution：17500；AGCtarget：1e5；MaximumIT：60ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：27。

質(zhì)譜原始文件使用Maxquant（1.6.2.10）分別檢索目標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫，檢索參數(shù)如下：固定修飾：脲基（C）；可變修飾：氧化（M），乙?；≒rotein N-term）；酶：胰蛋白酶；肽段/碎片離子質(zhì)量數(shù)：單同位素；顯著性閾值：0.01。

1.2.7 核桃球蛋白抗氧化能力測定 ABTS 法參考汪小玉等的方法：先制備ABTS 工作液，測定時(shí)將球蛋白和純化得到蛋白主要組分加水制成質(zhì)量濃度為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的待溶液，吸取待測溶液各20 μL，置于96 孔板中，每孔加入工作液200 μL，混勻，靜置10 min，于734 nm 波長處測定吸光度。以維生素C 為陽性對(duì)照，按下式計(jì)算ABTS自由基清除率，利用SPSS 軟件分別計(jì)算IC、IC，并計(jì)算其抗壞血酸當(dāng)量，用AEAC 表示，ABTS自由基清除率按式（2）進(jìn)行計(jì)算，樣品的抗壞血酸當(dāng)量按式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：A 為樣品溶液+ABTS 的吸光度；A為水+ABTS 的吸光度；A為樣品溶液+水的吸光度。

式中：IC為維生素C 對(duì)ABTS 陽離子自由基的半數(shù)抑制濃度，IC為樣品對(duì)ABTS 陽離子自由基的半數(shù)抑制濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均重復(fù)三次，結(jié)果用±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)利用Excel 2019、Origin 來繪制圖形，SPSS軟件進(jìn)行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃球蛋白的提取制備

本研究以冷榨脫油后的核桃粕為原料，經(jīng)二次脫脂處理后核桃粕的蛋白含量從39.90%提高至47.10%（表1）。韓海濤等研究表明冷榨的“清香”核桃餅中蛋白含量為48.64%，脫脂后蛋白含量提高至60.05%，略高于本研究的結(jié)果，可能是因?yàn)樵洗嬖诓町惡吞崛」に嚨牟煌?/p>

表1 不同物質(zhì)的蛋白含量Table 1 Protein contents of different substances

脫脂核桃粕進(jìn)一步提取獲得了球蛋白粗提物，其蛋白含量可達(dá)51.53%，占核桃總蛋白的15.3%，此結(jié)果與毛曉英等研究新疆和田核桃的結(jié)果基本一致。而王曉飛等制備得到蛋白含量為80.71%的球蛋白，高于本研究的結(jié)果，一方面可能是提取液種類不同；另一方面可能是考慮到硫酸銨鹽析純化蛋白時(shí)，蛋白溶液中引入硫酸銨不利于后續(xù)處理，所以本研究在制備球蛋白時(shí)沒有進(jìn)行硫酸銨鹽析這一操作步驟所致。

2.2 核桃球蛋白等電點(diǎn)測定結(jié)果

如圖1 所示，pH 為4 時(shí)，上清液吸光度最小，因此，初步確定核桃球蛋白等電點(diǎn)在4 左右。繼續(xù)研究pH4 左右的核桃球蛋白等電點(diǎn)（圖2），發(fā)現(xiàn)該蛋白在pH3.8 時(shí)上清液中的蛋白含量最少，而隨著pH 低于或者高于3.8 時(shí)蛋白含量又呈現(xiàn)明顯的上升，這表明其等電點(diǎn)為pH3.8。核桃球蛋白的等電點(diǎn)與其他植物來源的球蛋白的等電點(diǎn)值相近，如花生粕、米糠、谷子中球蛋白的等電點(diǎn)分別為4.6、4.0 和3.6，他們也與大多數(shù)食品蛋白質(zhì)一樣屬于典型的酸性蛋白質(zhì)，而對(duì)于核桃蛋白等電點(diǎn)的解析也是為后續(xù)該蛋白的純化提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖1 不同pH 下離心后上清液蛋白吸光度Fig.1 Protein absorbance of supernatant after centrifugation at different pH

圖2 不同pH 下離心后上清液蛋白含量Fig.2 Protein content of supernatant after centrifugation at different pH

2.3 核桃球蛋白純化結(jié)果

球蛋白粗提物先經(jīng)離子交換層析色譜純化，獲得兩部分蛋白分離物（圖3），采SDS-PAGE 分析各部分的蛋白條帶分布情況（圖4），其中峰1 的分離效果更好，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)純化。采用凝膠過濾層析進(jìn)一步分離峰1 中的蛋白，共得到2 個(gè)峰（圖5）。其中，首先收集到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分析后證實(shí)為球蛋白中10.1 kDa 大小的主要蛋白（圖6），其純度可達(dá)電泳級(jí)純。再經(jīng)Native-PAGE 電泳分析該組分，它由兩個(gè)活性蛋白條帶組成，后續(xù)分別對(duì)兩個(gè)蛋白條帶進(jìn)行蛋白鑒定。

圖3 脫脂核桃粕球蛋白離子交換層析Fig.3 Ion exchange chromatography of globulin from degreased walnut meal

圖4 脫脂核桃粕球蛋白SDS-PAGE 電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electropherogram of defatted walnut meal globulin

圖5 脫脂核桃粕球蛋白凝膠過濾層析Fig.5 Gel filtration chromatography of degreased walnut meal globulin

圖6 球蛋白SDS-PAGE 電泳（A）和純化得到主要蛋白Native-PAGE（B）電泳分析Fig.6 Globulin SDS-PAGE electrophoresis (A) and purification of the main protein Native-PAGE (B)electrophoresis analysis

脫脂核桃粕球蛋白粗提物由多種蛋白組成，其中含有2 個(gè)主要條帶（圖6），其分子量分別為7.8 和10.1 kDa（圖6）。而Mao 等研究發(fā)現(xiàn)新疆核桃的球蛋白顯示出九個(gè)條帶，其中兩個(gè)主要條帶的分子量為20.1 和35.0 kDa，這可能是由于核桃品種不同而造成的差異。

2.4 蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.4.1 條帶1 蛋白的鑒定結(jié)果 LC-MS/MS 檢測結(jié)果顯示，Native-PAGE 電泳圖上的條帶1 蛋白經(jīng)液相色譜分離后，在質(zhì)譜中檢測到的肽段數(shù)量與豐度較高（圖7），共檢測到145 條肽段，其中的98 條肽段均在其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)組中是唯一的。質(zhì)譜采集結(jié)果經(jīng)軟件MaxQuant（1.6.2.10）數(shù)據(jù)庫檢索，得到鑒定蛋白的比對(duì)結(jié)果，僅列出得分較高的前5 個(gè)蛋白比對(duì)結(jié)果（表2）。綜合蛋白的得分和含量結(jié)果表明該蛋白為vicilin Car i 2.0101，屬于7S 種子儲(chǔ)存蛋白家族，是一種7S 球蛋白。這也與Regina 等報(bào)道的結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)7S 球蛋白通常由大量多肽組成，其分子質(zhì)量范圍在10～70 kDa，不存在二硫鍵。

表2 條帶1 蛋白的鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of band 1 protein

圖7 條帶1 蛋白的LC-MS/MS 總離子流圖Fig.7 LC-MS/MS total ion chromatogram of band 1 protein

2.4.2 條帶2 蛋白的鑒定結(jié)果 LC-MS/MS 檢測結(jié)果顯示，Native-PAGE 電泳圖上條帶2 蛋白經(jīng)液相色譜分離后，在質(zhì)譜中檢測到的肽段數(shù)量與豐度較高（圖8），共檢測到177 條肽段，其中的127 條均在其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)組中是唯一的。質(zhì)譜采集結(jié)果經(jīng)過軟件MaxQuant（1.6.2.10）數(shù)據(jù)庫檢索，得到鑒定蛋白的對(duì)比結(jié)果，僅列出得分較高的前5 個(gè)蛋白對(duì)比結(jié)果（表3）。綜合蛋白的得分和含量結(jié)果表明該蛋白為2S 清蛋白。這也與Downs 等報(bào)道的結(jié)果一致，他們表明2S 清蛋白是一類結(jié)構(gòu)緊湊，半胱氨酸殘基結(jié)構(gòu)保守的低分子量蛋白，其分子質(zhì)量范圍在10～15 kDa 之間。另有，Spiric 等從山核桃中提純得到由5 和12 kDa 的主要條帶及16 kDa 蛋白條帶共同組成的天然的2S 清蛋白，與本研究得到的結(jié)果有所不同。本文通過Osborne 法制得核桃球蛋白，在對(duì)其進(jìn)行純化后得到2S 清蛋白，這與郭彥飛報(bào)道結(jié)果不同，他們證明苦蕎中屬于2S 清蛋白家族的16 kDa 過敏原僅存于苦蕎種子清蛋白中，推測這可能是由于采用此方法提取核桃清蛋白和球蛋白時(shí)，兩種蛋白很難絕對(duì)分開，導(dǎo)致出現(xiàn)交叉的現(xiàn)象。

表3 條帶2 蛋白的鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of the band 2 protein

圖8 條帶2 蛋白的LC-MS/MS 總離子流圖Fig.8 LC-MS/MS total ion chromatogram of Band 2 protein

2.5 核桃球蛋白抗氧化效果

ABTS被廣泛應(yīng)用于測定抗氧化劑的總抗氧化能力（圖9，表4）。核桃球蛋白、球蛋白純化得到主要蛋白組分蛋白以及維生素C 對(duì)ABTS自由基的清除能力均與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，其強(qiáng)弱依次為維生素C>純化得到主要蛋白組分>核桃球蛋白，同濃度下球蛋白純化得到蛋白組分對(duì) ABTS自由基的清除率顯著高于核桃球蛋白。核桃球蛋白和球蛋白純化得到主要蛋白組分的IC值分別為0.302、0.075 mg/mL，兩者之間存在顯著性差異，后者IC值僅為前者的1/4。同時(shí)球蛋白純化得到主要蛋白組分的抗氧化能力弱于對(duì)照品維生素C，但與之相比也是具有較好的清除ABTS自由基的能力。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，球蛋白及從球蛋白中純化得到主要蛋白組分均具有較高的總抗氧化能力，可以利用這一性質(zhì)，將其添加到肉湯、火腿等食品中，提高產(chǎn)品的貨架期。

表4 不同蛋白對(duì)ABTS+自由基的IC50、AEACTable 4 IC50,AEAC of different proteins to ABTS+ free radicals

圖9 不同質(zhì)量濃度蛋白對(duì)ABTS+自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of ABTS+ free radicals by protein at different mass concentrations

3 結(jié)論

本文以改進(jìn)的Osborne 法制備脫脂核桃粕球蛋白粗提物，球蛋白粗提物蛋白含量達(dá)51.53%，占核桃總蛋白的15.3%，其等電點(diǎn)為3.8；經(jīng)離子交換層析和凝膠過濾層析兩步純化獲得大小為10.1 kDa 的球蛋白；該蛋白在活性狀態(tài)下呈現(xiàn)出兩條條帶，經(jīng)HPLCMS 分析表明條帶1 為vicilin Car i 2.0101，是一種7S 球蛋白，條帶2 為2S 清蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，核桃球蛋白粗提物和純化的球蛋白均具有良好的抗氧化能力，而純化后球蛋白的抗氧化效果是粗提蛋白的4 倍，其IC值可低至0.075 mg/mL。通過以上研究，可為深入了解與開發(fā)核桃球蛋白組分與功能提供一定的理論基礎(chǔ)。