豬血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 的分離純化及性質(zhì)研究

劉維維，張凌晶，紀(jì)夢(mèng)雅，翁凌，張志剛，劉光明，曹敏杰,

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361100）

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2，EC 3.4.17.23）是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE，EC 3.4.15.1）的同源酶，兩者共同參與血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)的穩(wěn)定平衡。ACE2 對(duì)多種生物活性肽具有水解活性，并優(yōu)先裂解以Pro-X 結(jié)尾的肽段的末端氨基酸殘基（X 為疏水性氨基酸），如Ang II（DRVYIHPF）、Apelin-13（QRPRLSHKGPMPF）等。Ang II 是高血壓系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，ACE2 可水解Ang II 生成Ang（1-7），進(jìn)而作用于G 蛋白偶聯(lián)受體Mas 受體，從而發(fā)揮舒張血壓、抗氧化損傷、抗炎等作用，對(duì)抗平衡由ACE-Ang Ⅱ-AT1 受體系統(tǒng)介導(dǎo)的升壓效應(yīng)，并發(fā)揮減緩腸道內(nèi)的炎癥反應(yīng)及氧化損傷等功能。除此之外，ACE2 還可協(xié)調(diào)腸道內(nèi)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。

近年來，隨著對(duì)ACE2 在高血壓系統(tǒng)中作用研究的深入，關(guān)于食源性降壓產(chǎn)品的研究不再局限于ACE 抑制肽，ACE2 激活肽的研究日益受到關(guān)注。Liao 等發(fā)現(xiàn)，蛋清蛋白中提取的一種可顯著降低原發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHRs）血壓的三肽IRW，其降壓途徑并非抑制ACE，而是通過上調(diào)ACE2 發(fā)揮降壓作用。這表明以激活A(yù)CE2 為目的開發(fā)降壓產(chǎn)品有望成為高血壓防治的新靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，ACE2 激動(dòng)劑氧雜蒽酮類化合物（Xanthenone，XNT）可與ACE2 結(jié)合，打開其相對(duì)封閉的構(gòu)象使更多的底物進(jìn)入，且能顯著降低原發(fā)性高血壓大鼠（SHRs）的血壓。這表明以激活A(yù)CE2 為靶點(diǎn)制備新型降血壓產(chǎn)品是一種新途徑，而食源性肽是ACE2 激活產(chǎn)品的良好來源。

ACE2 的組織分布廣泛，在腎臟、心臟、睪丸、腸道等組織均有表達(dá)，主要分布于冠狀動(dòng)脈、腎血管內(nèi)皮和腎小管內(nèi)皮。前期的研究者通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆并表達(dá)了人源、豬源以及牛源等動(dòng)物的ACE2，而天然ACE2 由于含量低、純化難度大等問題，其分離純化以及性質(zhì)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究擬優(yōu)化天然ACE 的純化方法，以豬腎實(shí)質(zhì)為原材料分離純化豬ACE2 并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為以ACE2 活性為靶點(diǎn)的食源性功能食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬腎臟、胰、脾、大腸、小腸、胃、心、腦及肺組織 廈門銀祥食品有限公司，為排除個(gè)體差異，每個(gè)組織取樣三份，分別來源于三頭豬；DEAESepharose、HiTrap Phenyl Sepharose、HiTrap Q-Sepharose 層析柱 GE Healthcare 公司；熒光底物Mca-Ala-Pro-Lys（Dnp）-OH（MCA-APK）GLPBIO 公司；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）Peptide Institute 公司；兔抗人ACE2 單克隆抗體 ABclonal 公司；兔抗-actin 單克隆抗體Cell Signaling Technology 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體 Pierce 公司；SDS 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Fermentas 公司；PAS 染色試劑盒 Solarbio 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Avanti J-26SXP 高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；G:BOX 凝膠成像儀 英國(guó)Synegene 公司；Fluor ChemQ 化學(xué)發(fā)光成像儀 美國(guó)Alpha Innotech公司；Chirascan 圓二色譜儀 英國(guó)Applied Photophysics；M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司；AKTA 蛋白及多肽純化裝置 美國(guó)GE Healthcare 公司；Nanodrop 100 微量蛋白核酸測(cè)定儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；JS-Power 600 電泳儀 中國(guó)培清科技。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬不同組織前處理 豬的腎、心、肝、脾、肺等組織在?18 ℃下預(yù)凍24 h 后常溫流水解凍。每個(gè)組織共取15 g，洗去血水，用3 倍體積（w/v）的緩沖液A（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）勻漿，而后加入0.7% Triton X-100（w/v）攪拌1 h，差速離心（0～8000×g，4 ℃，30 min）后取上清液，四層紗布過濾后的透過液即為樣液。

1.2.2 免疫印跡（Western blot）分析ACE2 在不同組織中的存在 取上述樣液，參考李婉玉等的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。選擇兔抗人ACE2 單克隆抗體（1:2000 稀釋）作為一抗，內(nèi)參蛋白以兔抗-actin 單克隆抗體（1:10000 稀釋）作為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:20000 稀釋）作為二抗。用Image J 軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.2.3 豬腎實(shí)質(zhì)ACE2 的分離純化

1.2.3.1 豬腎實(shí)質(zhì)前處理 使用400 g 豬腎用于ACE2的分離純化，處理過程均在4 ℃下進(jìn)行。具體方法參考1.2.1。

1.2.3.2 酸沉淀及硫酸銨鹽析 1.2.3.1 所得粗酶液用1 mol/L 鹽酸緩慢調(diào)pH 至4.2，于50 ℃水浴加熱20 min 后轉(zhuǎn)移至37 ℃水浴2 h，冰水冷卻后，離心（12000×g，4 ℃，30 min），四層紗布過濾后取透過液。透過液經(jīng)終濃度2.1～2.7 mol/L（NH）SO鹽析，所得沉淀立即用少量的緩沖液A 溶解后置于透析袋中，以同緩沖液A 在4 ℃充分透析以除去（NH）SO，透析期間更換3 次相同緩沖液。

1.2.3.3 柱層析分離純化 透析后的粗酶液上樣于預(yù)先以緩沖液A 平衡的DEAE-Sepharose 陰離子交換柱，采用含0～0.4 mol/L NaCl（800 mL）的緩沖液A作線性梯度洗脫，柱層析期間保持流速為1 mL/min。收集酶活力高且雜蛋白相對(duì)較少的組分在緩沖液B（50 mmol/L Tris-HCl，pH8.5）中充分透析。透析后上樣于以緩沖液B 預(yù)先平衡的Q-HP（Q-High Performance）柱，依次用含0.125 mol/L（200 mL）、0.25 mol/L（220 mL）和0.5 mol/L NaCl（125 mL）的緩沖液B 進(jìn)行梯度洗脫，柱層析期間保持流速為2 mL/min。收集酶活力較高的部分，選用30 kDa 濃縮管置換至緩沖液A 中，預(yù)先加入（NH）SO至終濃度為1.4 mol/L，上樣于Phenyl-HP（Phenyl-High Performance）柱，依次用含1.05 mol/L（20 mL）、0.70 mol/L（NH）SO（35 mL）的緩沖液A 進(jìn)行洗脫，柱層析期間保持流速為2 mL/min。將活性組分收集進(jìn)行SDS-PAGE 驗(yàn)證純度，并使用Western blot 進(jìn)行驗(yàn)證，而后立即用于酶學(xué)性質(zhì)分析。

1.2.4 ACE2 的活性測(cè)定 酶活力測(cè)定以MCAAPK 為底物，參照Sriramula 等的方法并略作修改，具體方法如下：在黑色酶標(biāo)板中，將17.5 μL 待測(cè)酶液加入到80 μL 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.0，含0.3 mol/L NaCl，10 μmol/L ZnCl）中并混勻，立即加入2.5 μL 底物MCA-APK 使其終濃度為10 μmol/L。在酶標(biāo)儀中37 ℃下避光反應(yīng)30 min 后，立即在激發(fā)波長(zhǎng)320 nm，發(fā)射波長(zhǎng)405 nm 下測(cè)定反應(yīng)所釋放產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，以7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量。

一個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘釋放1 nmol AMC 所需的酶量。

1.2.5 蛋白含量測(cè)定 使用微量蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定蛋白樣品在280 nm 的吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清白蛋白為對(duì)照。

1.2.6 ACE2 的LC-MS/MS 分析 純化過程中，對(duì)ACE2 的純度進(jìn)行SDS-PAGE 分析。用考馬斯亮藍(lán)染液對(duì)最終純化的ACE2 凝膠進(jìn)行染色，充分脫色后切膠回收目的蛋白條帶，用LC-MS/MS 進(jìn)行氨基酸序列鑒定，該工作委托深圳市微納菲生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.7 豬腎ACE2 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.7.1 溫度對(duì)ACE2 活性的影響 ACE2 最適溫度的測(cè)定：將適量的酶液在不同的溫度下（15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）進(jìn)行酶促反應(yīng)，按照酶活檢測(cè)方法，測(cè)定酶活。

ACE2 熱穩(wěn)定性的測(cè)定：將適量的酶液與50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH7.0，含0.3 mol/L NaCl，10 μmol/L ZnCl）混合后，置于不同溫度下（0～70 ℃）孵育20 min，立即在冰水中冷卻，按照酶活檢測(cè)方法在37 ℃下測(cè)定ACE2 的剩余酶活力。

1.2.7.2 pH 對(duì)ACE2 活性的影響 ACE2 最適pH的測(cè)定：將適量的酶液在不同的pH 條件下（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）進(jìn)行酶促反應(yīng)，按照酶活檢測(cè)方法，在37 ℃下測(cè)定酶活。

ACE2 的pH 穩(wěn)定性測(cè)定：將適量的酶液與不同pH 的緩沖液混合后，置于4 ℃孵育30 min，按照酶活檢測(cè)方法，在37 ℃，pH7.0 下測(cè)定ACE2 的剩余酶活力。

1.2.7.3 ACE2 的熱變性溫度分析 采用圓二色譜法（Circular dichroism，CD）分析熱變性和冷卻復(fù)性過程中ACE2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。操作前將ACE2 酶液置換至不含鹽的緩沖液中，蛋白濃度為0.3 mg/mL，掃描溫度范圍為20～90 ℃，速率為0.5 ℃/min，以1 nm的光譜間隔從190～260 nm 對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。通過Global3 軟件對(duì)ACE2 的熱變性溫度Tm 進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.7.4 金屬離子對(duì)ACE2 活力的影響 在ACE2酶液中，加入不同金屬離子（Zn、Fe、Ca、Ba、Cu、Cd、Na、Co、Mn）至終濃度為1 mmol/L。在4 ℃下孵育30 min 后，立即按照酶活檢測(cè)方法測(cè)定剩余酶活力。其中，對(duì)照組以50 mmol/L Tris-HCl（pH7.0）代替金屬離子溶液。

1.2.7.5 抑制劑對(duì)ACE2 活力的影響 將ACE2 與不同蛋白酶抑制劑（EDTA，1,10-Phenanthroline，Pepstatin A，AEBSF，Leupeptin，E-64，Benzamidine）在常溫下孵育30 min，然后測(cè)定其剩余酶活力。對(duì)照組不添加蛋白酶抑制。

1.2.7.6 PAS 染色法鑒定糖蛋白 將純化的ACE2上樣于10% 的SDS-PAGE，電泳后，按照PAS 染色試劑盒的說明對(duì)凝膠進(jìn)行染色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行繪圖，使用Adobe Illustrator CS5 處理圖像，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次進(jìn)行測(cè)定，并取其平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE2 在豬不同組織中的分布

利用Western blot 法分析ACE2 在豬不同組織中的分布。如圖1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE2 按蛋白表達(dá)水平從多到少依次為腎，小腸，肝，胃；在腦、肺、大腸、胰臟中幾乎沒有ACE2 的存在。王珊珊等通過RT-PCR 和免疫組化方法對(duì)仔豬不同組織中ACE2分布進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ACE2 mRNA 在仔豬腎臟、小腸及胃底中顯著表達(dá)，另外在十二指腸、空腸及結(jié)腸中表達(dá)量較高，與本研究從蛋白水平分析的結(jié)果相似。

圖1 ACE2 在豬不同組織中分布的免疫印跡分析Fig.1 Western blot analysis of ACE2 distribution in different tissues of porcine

2.2 ACE2 的分離純化與免疫印跡

在純化時(shí)選用Triton-X100 增加ACE2 溶解性，經(jīng)酸沉淀和硫酸銨鹽析去除部分雜蛋白后得到ACE2 粗酶液。ACE2 粗酶液經(jīng)DEAE-Sepharose陰離子交換柱初步純化，收集活性較高且雜蛋白較少的組分，經(jīng)透析后上樣于Q-Sepharose 強(qiáng)陰離子交換柱，在0.25 mol/L NaCl 時(shí)目的蛋白被洗脫下來（圖2）?；钚越M份繼續(xù)上樣于Phenyl Sepharose 疏水柱，最終在0.7 mol/L（NH4）SO的洗脫部分酶活峰與蛋白峰重疊，獲得目的蛋白（圖2C）。SDS-PAGE 分析顯示，純化蛋白分子量為98 kDa（圖2D），Western blot表明抗ACE2 單克隆抗體能與該蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)（圖2E）。對(duì)ACE2 的純化結(jié)果如表1 所示，從400 g 豬腎實(shí)質(zhì)中純化得到0.6 mg ACE2，得率為0.1%，純化倍數(shù)為149.8 倍（表1）。

表1 豬腎ACE2 純化結(jié)果Table 1 Purification of angiotensin converting enzyme 2 from porcine kidney

圖2 ACE2 的柱層析純化、SDS-PAGE 及免疫印跡分析Fig.2 Column chromatography purification,SDS-PAGE and Western blot analysis of ACE2

2.3 ACE2 的質(zhì)譜鑒定

將純化得到的ACE2 蛋白條帶切膠回收，經(jīng)胰蛋白酶酶切后得到的多肽樣品上樣于LC-MS/MS，共得到41 個(gè)肽段，含386 個(gè)氨基酸殘基。通過Uniprot 下載的Sus scrofa 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，得到的結(jié)果如圖3 所示，酶解后得到的41 個(gè)肽片段與豬的ACE2（NP_001116542.1）序列高度一致，表明純化的蛋白為豬ACE2。

圖3 純化ACE2 的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析Fig.3 LC-MS/MS analysis of the purified ACE2

2.4 ACE2 的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適溫度與熱穩(wěn)定性 ACE2 的最適溫度為40 ℃（圖4A），該結(jié)果與多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的溫度為35～40 ℃相對(duì)應(yīng)，表明ACE2 在該溫度附近能夠發(fā)揮其最高的酶活力。

當(dāng)溫度在15～50 ℃時(shí)，ACE2 的酶活力較為穩(wěn)定，相對(duì)酶活在90%以上，而當(dāng)溫度升高至55 ℃時(shí)，ACE2 的相對(duì)酶活開始下降，到60 ℃時(shí)下降至15%左右，到70 ℃時(shí)幾乎完全喪失酶活，表明ACE2 的耐熱性較差（圖4A）。

2.4.2 最適pH 與pH 穩(wěn)定性 ACE2 在pH7.0 時(shí)的活性最高，當(dāng)pH 高于或低于7.0，ACE2 的相對(duì)酶活明顯下降，在pH10.0 時(shí)酶活基本喪失，表明ACE2在中性偏酸的環(huán)境中更宜發(fā)揮其活性（圖4B）。該結(jié)果與報(bào)道的在Sf9 昆蟲細(xì)胞中表達(dá)純化的重組人ACE2 的最適pH 為6.5 相似。

對(duì)ACE2 的pH 穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 在5.0～7.0 的范圍內(nèi)，ACE2 的穩(wěn)定性較好，相對(duì)酶活保持在80%以上，pH 為6.0 時(shí)ACE2 的活性最高。而當(dāng)pH 上升至10.0 時(shí)ACE2 的相對(duì)酶活僅有50%左右，表明其在中性偏酸的環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定（圖4B）。

圖4 溫度（A）和pH（B）對(duì)豬腎ACE2 活性的影響Fig.4 Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of ACE2

2.4.3 ACE2 熱變性分析 為了研究溫度對(duì)豬ACE2二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)純化ACE2 進(jìn)行圓二色譜掃描分析，掃描波長(zhǎng)范圍為190～260 nm。如圖5 所示，通過Global 3 軟件對(duì)ACE2 的熱變性溫度（Tm）進(jìn)行預(yù)測(cè)，其Tm 值為（67.5±0.1）℃，即當(dāng)環(huán)境溫度在67.5 ℃附近時(shí)，ACE2 的氫鍵和范德華力會(huì)受到破壞，從而導(dǎo)致其構(gòu)象開始發(fā)生變化（圖5A）。圖5B顯示了加熱前后以及回溫后ACE2 的結(jié)構(gòu)變化，當(dāng)溫度升高至90 ℃時(shí)，與天然狀態(tài)下即30 ℃時(shí)的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比有較大的差異，此時(shí)ACE2 的二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，當(dāng)溫度回復(fù)至30 ℃時(shí)無法恢復(fù)至天然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，表明90 ℃加熱可導(dǎo)致ACE2 的不可逆變性。

圖5 圓二色譜法檢測(cè)溫度對(duì)ACE2 結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of temperature on the structure of ACE2 as detected by CD spectrum

2.4.4 金屬離子對(duì)ACE2 相對(duì)酶活的影響 金屬離子對(duì)于酶的表達(dá)和調(diào)控具有重要的作用，某些金屬離子對(duì)酶有催化作用，而一些金屬離子，如重金屬離子Cu、Pb等，在低濃度時(shí)會(huì)對(duì)某些酶產(chǎn)生抑制作用，高濃度時(shí)會(huì)使酶變性失活。表2 總結(jié)了不同金屬離子在同一濃度（1.0 mmol/L）下對(duì)ACE2 酶活的影響，其中Zn、Na、Co及Mn對(duì)ACE2 的酶活有一定的激活作用，Zn的激活作用最強(qiáng)。Cd對(duì)ACE2 的酶活有一定的抑制作用，Cu和Fe幾乎能完全抑制ACE2 的活性。

表2 金屬離子對(duì)ACE2 活性的影響Table 2 Effect of metal ions on the activity of ACE2

2.4.5 抑制劑對(duì)ACE2 活性的影響 如表3，金屬蛋白酶抑制劑EDTA，1,10-Phenanthroline 幾乎能完全抑制ACE2 的活力，而其他抑制劑如絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF、Leupeptin 及Benzamidine，胃蛋白酶抑制劑Pepstatin A，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64 對(duì)ACE2 的活力無明顯影響。這些結(jié)果反映了ACE2具備金屬蛋白酶特性，與Donoghue 等發(fā)現(xiàn)ACE2有潛在金屬蛋白酶鋅結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)果類似。

表3 抑制劑對(duì)ACE2 活力的影響Table 3 Effect of inhibitors on ACE2 activity

2.4.6 糖蛋白鑒定 目前對(duì)于糖蛋白的鑒定通常采用PAS 染色法，即通過高碘酸與Schiff 堿的氧化還原反應(yīng)形成明顯的紅色復(fù)合物進(jìn)行鑒別。對(duì)ACE2進(jìn)行PAS 染色鑒定是否為糖蛋白，結(jié)果如圖6 所示。ACE2（泳道3）與陽性對(duì)照二肽基肽酶（Dipeptidyl Peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）（泳道1）同顯示為一條紅色條帶，而陰性對(duì)照牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）（泳道2）則不顯示紅色條帶，表明ACE2 是糖蛋白。蛋白質(zhì)的糖基化，除了結(jié)構(gòu)特征不明顯的O-糖基化外，還有結(jié)構(gòu)特征為N-X-S（T）（X 代表任何一種氨基酸）的N-糖基化，而ACE2 中具有該結(jié)構(gòu)特征的位點(diǎn)有多個(gè)（圖3）。

圖6 PAS 染色結(jié)果Fig.6 Result of PAS staining

3 討論

前期對(duì)ACE2 的研究工作中，Lin 等通過硫酸銨鹽析，Q-Sepharose，Phenyl-Sepharose，DEAESepharose，SP-Sepharose 和Superose HR 等多種柱層析結(jié)合的方法從人心臟左心室膜中分離純化出了ACE2 與整合素1 的復(fù)合物，分子量為130 kDa，但得率僅為0.0006%。該方法存在流程繁瑣、得率低等問題。為了建立更加有效的天然ACE2 純化方法，本研究利用免疫印跡法從蛋白水平探究了豬不同組織中ACE2 的分布差異。以ACE2 蛋白水平最高的腎臟為原材料優(yōu)化條件，采用Triton-X100 增加ACE2溶解性，簡(jiǎn)化了柱層析步驟，最終實(shí)現(xiàn)了ACE2 的高度純化。純化ACE2 的分子量約為98 kDa，得率為0.1%。

不同物種的ACE2 分子量在60～130 kDa 不等，其分子量的差異可歸因于不同程度的糖基化。糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式之一，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)超過50%的蛋白質(zhì)都會(huì)發(fā)生糖基化。本研究純化的豬ACE2 在SDS-PAGE（圖2D）及免疫印跡（圖2E）中顯示其分子量約為98 kDa，比重組豬ACE2（92 kDa）略高，提示天然ACE2 在合成及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能發(fā)生了糖基化、磷酸化等翻譯后修飾。PAS 染色結(jié)果證實(shí)了豬ACE2 是一種糖蛋白（圖6）。實(shí)際上，蛋白質(zhì)糖基化具有識(shí)別定位、穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象和信息傳遞等作用。

金屬離子作為蛋白酶結(jié)構(gòu)的一部分或作為酶激活因子，對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性有重要的影響。ACE2 是鋅離子蛋白酶家族成員，含有一段高保守的鋅結(jié)合序列，本研究結(jié)果也表明Zn能顯著激活其酶活性。質(zhì)譜結(jié)果同樣顯示，ACE2 的第374～378位氨基酸殘基為HEMGH，該片段為ACE2 的鋅結(jié)合序列，與其功能和活性相關(guān)。另外，第402 位的谷氨酸高度保守，與第374 位的組氨酸同為ACE2的鋅離子配體，Zn與ACE2 的這些殘基位點(diǎn)形成配位鍵，對(duì)ACE2 的催化起重要作用。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性在決定其生理功能方面起著至關(guān)重要的作用，影響其結(jié)構(gòu)的外在因素主要有pH、溫度、鹽濃度等。豬ACE2 與ACE 的熱變性溫度分別為67.5 與58.5 ℃。當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，ACE 的活性急劇下降，而ACE2 仍能保持90%的活性，表明ACE2 的熱穩(wěn)定性更好。蛋白酶的穩(wěn)定性通常與自身的結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)，酶的活性位點(diǎn)是決定溫度對(duì)酶的重要影響因素之一。Towler等對(duì)重組人ACE2 胞外區(qū)域的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，結(jié)果表明除了一些活性氨基酸被ACE2 的某些氨基酸替代外，ACE 的S2 活性口袋被ACE2 的Arg覆蓋，導(dǎo)致ACE2 的活性區(qū)域比ACE 狹小，這些區(qū)別使得兩者在水解底物及其他性質(zhì)方面有差異。作為與高血壓密切相關(guān)的2 種酶，分析ACE2與ACE 在結(jié)構(gòu)上的差異以及糖基化程度等，對(duì)于了解它們的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)而開發(fā)降血壓產(chǎn)品具有重要意義。

4 結(jié)論

對(duì)豬不同組織比較發(fā)現(xiàn)，豬腎中ACE2 含量最高，其分子量約為98 kDa，是一種典型的金屬蛋白酶。ACE2 的最適pH 為7.0，最適溫度為40 ℃，變性溫度為67.5 ℃。ACE2 含一個(gè)HEMGH 鋅離子結(jié)合域和第402 位的谷氨酸鋅離子結(jié)合配體。在鋅離子存在下，其活性增加62%。部分金屬離子如Cu、Fe和Cd對(duì)ACE2 的活性有抑制作用。ACE2 是糖基化蛋白，這也是其穩(wěn)定性較好的一個(gè)因素。本研究為高效純化天然ACE2 提供了技術(shù)參考，為開發(fā)以ACE2 為靶標(biāo)的功能性食品提供了思路。