超濾膜分級(jí)玉米糖肽的抗氧化和乙醇脫氫酶激活活性

叢萬(wàn)鎖，王曉杰

（1.齊齊哈爾大學(xué)研究生部，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase），全稱為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺--谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，依據(jù)?；w的不同，可以催化三種類(lèi)型反應(yīng)：交聯(lián)（蛋白質(zhì)/肽分子中的賴氨酸殘基）、?；D(zhuǎn)移（即酶法糖基化，含有伯氨基團(tuán)的糖）和脫酰胺（水分子），這三種反應(yīng)均可以用于改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。與美拉德反應(yīng)相比，TGase 途徑的酶法糖基化反應(yīng)條件更溫和，產(chǎn)物更安全，因此，TGase 催化的酶法糖基化反應(yīng)已經(jīng)應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)/多肽的改性中，接糖量（即糖基化反應(yīng)的效率）一般在1.01～371.86 mg D-氨基葡萄糖/g蛋白范圍內(nèi)。

玉米醇溶蛋白含有高比例的谷氨酰胺、缺少賴氨酸的氨基酸特點(diǎn)，導(dǎo)致其是TGase 催化的酶法糖基化反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)原料。但是，當(dāng)采用D-氨基葡萄糖對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行糖基化修飾時(shí)，D-氨基葡萄糖的接入量?jī)H為11.34±0.21 mg/g 蛋白。玉米醇溶蛋白質(zhì)在水相中的溶解度低，且一些反應(yīng)基團(tuán)深埋在蛋白分子內(nèi)部，影響了底物蛋白與氨基糖之間的相互作用，導(dǎo)致氨基糖的導(dǎo)入量較低。玉米糖肽是玉米醇溶蛋白先經(jīng)蛋白酶水解獲得的低分子量玉米肽，再在TGase 催化下與氨基糖共價(jià)結(jié)合的產(chǎn)物。與玉米醇溶蛋白相比，玉米糖肽的糖基化效率顯著增加，且具有更高的抗氧化活性及乙醇脫氫酶激活活性，是具有開(kāi)發(fā)潛力的生物功能因子。

食源性蛋白肽的分子質(zhì)量大小與其生物活性有關(guān)，且大多數(shù)功能性活性肽存在于復(fù)雜的基質(zhì)混合物中，該混合物含有大量不同大小、構(gòu)象和凈電荷的水解蛋白質(zhì)組分且濃度低，因此，有必要在工業(yè)規(guī)模上分離和濃縮特定肽，并明確肽的基本性質(zhì)如分子量大小與其生物活性之間的關(guān)系，為肽的制備和富集指明方向。超濾是一種膜過(guò)濾法，其借助壓力或濃度梯度使樣品通過(guò)半透膜進(jìn)行分離，這種分離方法已在實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用于從粗蛋白水解物中純化和濃縮低分子量活性肽。

本實(shí)驗(yàn)采用截?cái)喾肿恿繛?、3 和1 ku 的超濾膜對(duì)玉米糖肽進(jìn)行順次分級(jí)分離，獲得分子量為>5、5～3、3～1 和<1 ku 四個(gè)組分，通過(guò)測(cè)定各分子量組分的抗氧化和乙醇脫氫酶激活活性，表征分子量對(duì)玉米糖肽生物活性的影響，為玉米糖肽作為功能性食品應(yīng)用于食品工業(yè)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫代巴比妥酸、菲洛嗪、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽上海生工生物工程有限公司；堿性蛋白酶Alcalase酶活力6.28×10U/mL，丹麥諾維信公司；DPPH自由基、2-脫氧-D-核糖、玉米醇溶蛋白 Sigma 公司；Tgase 酶活力1000 U/g，泰興市一鳴生物制品有限公司；乙醇脫氫酶、氧化型輔酶Ⅰ（NAD）上海寶曼生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DF-I 集熱式磁力加熱攪拌器 常州榮華儀器制造有限公司；SHZ-A 恒溫水浴振蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；TU1901 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PB-10 pH 計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；NDA701 杜馬斯定氮儀 意大利VELP 公司；LD-53 真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)MILLROCk 公司；AKTAFWXS 膜過(guò)濾系統(tǒng)、5000、3000 和1000 nmwc Hollow Fiber Cartridge，美國(guó)GE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米糖肽的制備 采用前期實(shí)驗(yàn)確定的工藝條件制備玉米糖肽，在該工藝條件下制備的玉米糖肽，采用紅外光譜測(cè)定確認(rèn)D-氨基葡萄糖與玉米肽之間發(fā)生酶法糖基化反應(yīng)。玉米醇溶蛋白用蒸餾水配成底物質(zhì)量濃度為5%（w/v）的懸浮液，按酶與底物的質(zhì)量比3%加入堿性蛋白酶Alcalase，在初始pH8.5、溫度60 ℃條件下酶解2 h。在酶解過(guò)程中，不斷加入1.0 mol/L NaOH 使pH 保持在8.5。酶解結(jié)束后，反應(yīng)液放入沸水浴中滅酶15 min，冷卻至室溫后將pH 調(diào)至7.0，4000 r/min 離心10 min，收集上清液經(jīng)冷凍干燥后獲得玉米肽。將制備的玉米肽配成質(zhì)量濃度為3%（w/v）的溶液，按玉米肽與D-氨基葡萄糖的質(zhì)量比1:3 加入D-氨基葡萄糖，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.7，按加酶量55 U/g 蛋白加入TGase，在44 ℃恒溫水浴振蕩器中糖基化反應(yīng)7 h后，將反應(yīng)物立即放入85 ℃水浴中滅酶5 min。冷卻至室溫，4000 r/min 離心10 min，收集上清液過(guò)截?cái)喾肿淤|(zhì)量300 Da 的納濾膜，透過(guò)液經(jīng)冷凍干燥后獲得玉米糖肽混合物。

1.2.2 玉米糖肽的超濾分級(jí)分離 將一定體積的玉米糖肽溶液注入超濾分離裝置的儲(chǔ)槽中，在泵提供的動(dòng)力下，樣品溶液經(jīng)微濾后進(jìn)入截?cái)喾肿恿繛? ku的超濾膜中，樣品溶液中分子量<5 ku 的小分子物質(zhì)經(jīng)中空纖維膜的內(nèi)壁滲透出來(lái)成為滲透液，分子量>5 ku 的大分子物質(zhì)得以保留并得到濃縮，返回到儲(chǔ)槽中，如此反復(fù)循環(huán)，收集分子量>5 和<5 ku 的分子量組分。將分子量<5 ku 的滲透液再順次通過(guò)3 和1 ku 的超濾膜，共獲得分子量為>5、5～3、3～1 和<1 ku四個(gè)組分。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 總蛋白質(zhì)含量參照NY/T 2007-2011 杜馬斯燃燒法進(jìn)行測(cè)定，可溶性蛋白含量采用Folin-酚法測(cè)定，并按公式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。在空白管中加入0.5 mL 蒸餾水，在樣品管中加入0.1 mL 樣液和0.4 mL 蒸餾水，分別加入2.5 mL Folin-酚甲液，混勻后靜置10 min，再分別加入0.25 mL Folin-酚乙液，迅速搖勻并靜置30 min，最后在640 nm下測(cè)定吸光值，根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.0044x+0.0026,=0.999）計(jì)算出可溶性蛋白含量（mg/mL）。

1.2.4 抗氧化活性的測(cè)定 用DPPH、羥基和超氧陰離子自由基清除活性，以及亞鐵離子螯合能力和還原力表征玉米糖肽的抗氧化活性，參照Wang 等描述的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.1 DPPH 自由基清除活性 將空白組、對(duì)照組和樣品組的相應(yīng)反應(yīng)液加入到試管中，搖勻后避光反應(yīng)30 min，分別測(cè)量517 nm 處的吸光度值A(chǔ)、A和A，根據(jù)公式（2）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

1.2.4.2 羥基自由基清除活性 采用2-脫氧-D-核糖法測(cè)定。將相應(yīng)反應(yīng)液加入到試管中，搖勻后將所有試管置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)1 h。水浴后向各試管中分別加入1 mL 2.0%硫代巴比妥酸溶液，1 mL 2.0%三氯乙酸溶液，振蕩搖勻后再將所有試管放入沸水中處理30 min，取出后立即流水冷卻至室溫，最后在532 nm 處分別測(cè)定空白組、對(duì)照組和樣品組的吸光度值A(chǔ)、A和A，根據(jù)公式（3）計(jì)算羥基自由基清除率。

1.2.4.3 還原力 在10 mL 離心管中分別加入2 mL 待測(cè)樣品溶液、2 mL 磷酸鹽緩沖液（pH6.6，0.2 mol/L）和2 mL 鐵氰化鉀溶液（1%，w/v），振蕩均勻，50 ℃水浴20 min；加入2 mL 10%（w/v）三氯乙酸溶液，振蕩均勻后4000 r/min 離心10 min；取上清液2 mL，加入2 mL 蒸餾水和0.4 mL 0.1%（w/v）FeCl溶液，振蕩均勻，50 ℃水浴10 min，最后在700 nm 處進(jìn)行比色。

1.2.4.4 亞鐵離子螯合能力 將相應(yīng)反應(yīng)液加入到試管中，振蕩均勻后室溫下靜置10 min，此時(shí)樣品中的抗氧化成分與亞鐵離子螯合，減少563 nm 處有強(qiáng)吸收的鮮紅色菲洛嗪亞鐵化合物的形成量。最后在563 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定對(duì)照組和樣品組的吸光度值A(chǔ)、A，根據(jù)公式（4）計(jì)算亞鐵離子螯合率。

1.2.4.5 超氧陰離子自由基清除活性 采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。將對(duì)照組和樣品組的相應(yīng)反應(yīng)液加入到試管中，反應(yīng)30 s 后于325 nm 處作時(shí)間掃描，反應(yīng)4 min，記反應(yīng)速率分別為OD（A/min）和OD（A/min），根據(jù)公式（5）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

1.2.5 乙醇脫氫酶激活能力的測(cè)定 采用瓦勒-霍赫的酶法進(jìn)行測(cè)定，略有修改。按表1 加入各種相應(yīng)反應(yīng)液到10 mL 帶蓋離心管中，振蕩混合均勻后放入25 ℃水浴鍋中，蓋蓋溫浴5 min 后立即加入0.1 mL、0.25 U/mL 乙醇脫氫酶，搖勻后于340 nm處進(jìn)行時(shí)間掃描，反應(yīng)時(shí)間5 min，取反應(yīng)最初的線性部分作圖，斜率記為K。對(duì)于對(duì)照組，用0.1 mL 蒸餾水代替樣品，斜率記為K。對(duì)于空白組，以0.5 mL蒸餾水代替11.5%乙醇溶液。按公式（6）計(jì)算待測(cè)樣品的乙醇脫氫酶激活率。

表1 乙醇脫氫酶激活率測(cè)定時(shí)的反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for determining alcohol dehydrogenase activation rate

1.3 數(shù)據(jù)處理

除超濾膜分級(jí)實(shí)驗(yàn)外，所有實(shí)驗(yàn)均平行3 次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD 法進(jìn)行組間多重比較，<0.05 為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽蛋白質(zhì)回收率的影響

通過(guò)Folin-酚法測(cè)定玉米糖肽各超濾分級(jí)組分的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白質(zhì)回收率，結(jié)果如表2 所示。由表2 可以看出，玉米糖肽經(jīng)3 種超濾膜順次分級(jí)分離后，蛋白質(zhì)的總回收率為81.37%，說(shuō)明經(jīng)超濾膜順次分級(jí)時(shí)玉米糖肽和膜之間發(fā)生相互作用，玉米糖肽在超濾膜表面形成沉積物，導(dǎo)致總蛋白質(zhì)損失18.63%，這與Vallee 等研究結(jié)果一致。在四個(gè)分子量組分中，分子量<3 ku 的組分占44.57%，而分子量>5 ku 的組分占17.29%，比糖基化修飾前增加9.33%（玉米肽中分子量>5 ku 的組分占7.96%），其原因可能是在TGase 的催化下，玉米肽與D-氨基葡萄糖發(fā)生共價(jià)結(jié)合以及玉米肽分子之間發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)生成大分子物質(zhì)而導(dǎo)致的。

表2 超濾膜分級(jí)后玉米糖肽的蛋白質(zhì)回收率Table 2 Protein recovery rate of corn glycopeptides after ultrafiltration membrane classification

2.2 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽抗氧化活性的影響

2.2.1 DPPH 自由基清除活性 在不同濃度條件下，研究分子量對(duì)玉米糖肽DPPH 自由基清除活性的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effect of ultrafiltration membrane fractionation on DPPH radical scavenging rate of corn glycopeptides

如圖1 所示，各分子量組分的DPPH 自由基清除能力均具有劑量依賴性。經(jīng)超濾膜分級(jí)后，與對(duì)照組相比，分子量>5 ku 的組分對(duì)DPPH 自由基的清除能力顯著降低（<0.05），而分子量3～5 和1～3 ku 組分的DPPH 自由基清除能力顯著增加（<0.05），且顯著高于分子量<1 ku 組分，說(shuō)明超濾膜分級(jí)對(duì)具有清除DPPH 自由基能力的玉米糖肽組分起到富集的作用，且在玉米糖肽分子中，具有清除DPPH 自由基能力的組分的分子量集中在1～5 ku 范圍內(nèi)。Bamdad等研究了大麥醇溶蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)中等大小的肽可能在抗氧化活性中起重要作用。Sabeena-Farvin 等發(fā)現(xiàn)，與較低分子量組分相比，分子量>30 和10～30 ku 高分子量水解物顯示出更顯著的DPPH 自由基清除活性。Xia 等也發(fā)現(xiàn)大分子量肽具有比小分子量肽更好的DPPH 自由基清除活性。在本研究中，分子量為1～5 ku 的玉米糖肽組分可能具有最佳的擴(kuò)散性和供電子能力，有利于玉米糖肽與DPPH 自由基結(jié)合并將其清除。分子量>5 ku的組分，主要由大分子量肽段組成，其反應(yīng)擴(kuò)散率低可能會(huì)限制DPPH 自由基的清除，而分子量<1 ku 的組分由于其親水性的積累不利于與脂溶性DPPH 自由基結(jié)合，導(dǎo)致DPPH 自由基清除活性較低。因此，具有清除DPPH 自由基活性的玉米糖肽組分的分子量主要集中在1～5 ku 范圍內(nèi)。

2.2.2 亞鐵離子螯合能力 在不同濃度條件下，研究分子量對(duì)玉米糖肽亞鐵離子螯合能力的影響，結(jié)果如圖2 所示。在0.5～2.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，在四個(gè)分子量組分中，1～3 ku 組分具有最強(qiáng)的亞鐵離子螯合能力，在濃度為2 mg/mL 時(shí)，螯合率為83.22%，比對(duì)照組和分子量>5、3～5 和<1 ku 的組分分別高4.71%、12.68%、14.35%和9.91%，說(shuō)明玉米糖肽分子中具有亞鐵離子螯合能力的多肽組分的分子量主要集中在1～3 ku 范圍內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，肽類(lèi)螯合亞鐵離子是通過(guò)其氨基酸的電荷性質(zhì)和形成的捕獲亞鐵離子的結(jié)構(gòu)完成。與其他分子量段組分相比，分子量1～3 ku 的玉米糖肽組分中可能具有更多的亞鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，包括玉米肽分子上共價(jià)結(jié)合的D-氨基葡萄糖的多羥基結(jié)構(gòu)、以及Asp、Glu、His 和Arg 等殘基等，同時(shí)，較大分子量的玉米糖肽還可能通過(guò)形成“籠子”似的結(jié)構(gòu)以捕獲金屬離子，故亞鐵離子螯合能力最強(qiáng)；而分子量>5 ku 組分由于其分子較大，螯合亞鐵離子的活性位點(diǎn)可能埋藏存在于其分子內(nèi)部，且反應(yīng)擴(kuò)散率低等因素均會(huì)限制其對(duì)亞鐵離子的螯合作用。

圖2 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽亞鐵離子螯合率的影響Fig.2 Effect of ultrafiltration membrane fractionation on the ferrous ion chelating capacity of corn glycopeptides

2.2.3 還原力 在不同濃度條件下，研究分子量對(duì)玉米糖肽還原力的影響，結(jié)果如圖3 所示。除0.5 mg/mL濃度外，經(jīng)超濾膜分級(jí)后，玉米糖肽的還原力均顯著降低（<0.05），分析可能是因?yàn)橛衩滋请膶?duì)Fe的還原能力是各分子量組分的協(xié)同效果。在0.5～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，在四個(gè)分子量組分中，分子量1～3 ku 組分具有最強(qiáng)的還原能力，在濃度為2 mg/mL 時(shí)，還原力為2.248，分別比分子量>5、3～5 和<1～3 ku 的組分高0.288、0.396 和0.387。孫常雁等研究了乳清蛋白肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)分子量為0.8～5 ku 的中分子量組分具有最高的還原能力，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在不同分子量組分中，玉米糖肽發(fā)揮還原能力的組分主要集中在1～3 ku 分子量范圍內(nèi)，可能是由于該分子量組分具有較小的空間位阻，從而具有較好的供電子能力，可將Fe還原為Fe，F(xiàn)e進(jìn)一步發(fā)生Perl’s Prussian 反應(yīng)從而表現(xiàn)出還原能力。

圖3 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽還原力的影響Fig.3 Effect of ultrafiltration membrane fractionation on the reducting ability of corn glycopeptides

2.2.4 羥基自由基清除活性 在不同濃度下，研究分子量對(duì)玉米糖肽羥基自由基清除活性的影響，結(jié)果如圖4 所示。在濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，分子量對(duì)玉米糖肽的羥基自由基清除能力影響較大，隨著分子量的減小，玉米糖肽對(duì)羥基自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，即小分子質(zhì)量的玉米糖肽具有最高的羥基自由基清除能力；當(dāng)濃度逐漸增大時(shí)，分子量對(duì)玉米糖肽羥基自由基清除能力的影響逐漸減弱，在濃度為1～2 mg/mL時(shí)，分子量3～5、1～3 和<1 ku 三個(gè)組分的羥基自由基清除率間差異不顯著（>0.05）。在濃度低時(shí)，小分子量樣品的擴(kuò)散系數(shù)較大，易于向羥基自由基供氫而將其清除，而大分子量樣品由于其較大的空間位阻，不利于向羥基自由基供氫，進(jìn)而清除能力降低；在樣品濃度高時(shí)，樣品的擴(kuò)散系數(shù)降低，不同分子量樣品間的空間位阻差異被抵消，進(jìn)而導(dǎo)致不同分子量樣品清除羥基自由基的能力間無(wú)顯著性差異，這些結(jié)果也表明玉米糖肽的抗氧化活性不僅取決于其分子量，還取決于糖肽組分的疏水性等特性。

圖4 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽羥基自由基清除率的影響Fig.4 Effect of ultrafiltration membrane fractionation on the hydroxyl radical scavenging rate of corn glycopeptides

另一方面，高分子質(zhì)量分子通常具有較大的分子體積，這使得它們難以穿透細(xì)胞膜。酪蛋白或膠原蛋白水解物通過(guò)Caco-2 細(xì)胞時(shí)也已經(jīng)證明具有分子量依賴性的滲透性，即小分子量肽可以優(yōu)先通過(guò)肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或細(xì)胞旁途徑路滲透。因此，小分子量玉米糖肽能夠更好地穿透細(xì)胞膜，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中以結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子，即比大分子量玉米糖肽更具有在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化活性的潛力。

2.2.5 超氧陰離子自由基清除活性 在不同濃度下，研究分子量對(duì)玉米糖肽超氧陰離子自由基清除活性的影響，結(jié)果如圖5 所示。分子量對(duì)玉米糖肽的超氧陰離子自由基清除能力影響較大，與對(duì)照組相比，分子量<5 和3～5 ku 組分的超氧陰離子自由基的清除能力顯著降低，分子量1～3 ku 組分的清除率顯著增加（<0.05），而分子量<1 ku 組分的清除能力對(duì)照組相當(dāng)（除0.5 mg/mL 濃度外），說(shuō)明玉米糖肽中清除超氧陰離子自由基的組分主要集中在分子量1～3 ku。Yu 等研究了不同分子量豆粕水解產(chǎn)物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)分子量1～3 ku 組分具有最高的抗氧化活性。其原因可能是肽的抗氧化活性和其氨基酸的序列、組成、結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。超濾分級(jí)將玉米糖肽分成不同量級(jí)的組分，而分子量1～3 ku玉米糖肽組分中含有對(duì)鄰苯三酚自氧化速率具有較好抑制作用的組分最多，具有最佳的供電子能力，進(jìn)而對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最強(qiáng)，這與王靜等研究結(jié)果一致。

圖5 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.5 Effect of ultrafiltration membrane fractionation on the superoxide anion radicals scavenging rate of corn glycopeptides

2.3 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽乙醇脫氫酶激活活性的影響

在不同濃度下，研究分子量對(duì)玉米糖肽乙醇脫氫酶激活率的影響，結(jié)果如圖6 所示。在濃度0.5 mg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比，不同的分子量對(duì)玉米糖肽的乙醇脫氫酶激活率沒(méi)有顯著性影響（>0.05），在濃度1.0～2.0 mg/mL 范圍內(nèi)，除分子量1～3 ku 組分的乙醇脫氫酶激活率顯著增加外，其余三個(gè)分子量組分與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（>0.05，除1.5 mg/mL濃度下<1 ku 組分外），說(shuō)明玉米糖肽分子中具有乙醇脫氫酶激活的活性組分主要集中在分子量1～3 ku范圍內(nèi)，原因可能有以下兩個(gè)方面：一是分子量1～3 ku組分中含有高比例的丙氨酸和亮氨酸，能夠穩(wěn)定反應(yīng)體系中的NAD，從而增強(qiáng)了乙醇脫氫酶的活性；二是乙醇脫氫酶激活活性與肽段的分子量大小、反應(yīng)體系的抗氧化能力有關(guān)，分子量1～3 ku 玉米糖肽的抗氧化能力最強(qiáng)（圖1～圖5），可以保持乙醇脫氫酶的穩(wěn)定性，故對(duì)乙醇脫氫酶具有最高的激活活性。

圖6 超濾膜分級(jí)對(duì)玉米糖肽乙醇脫氫酶激活率的影響Fig.6 Effect of ultrafiltration membrane fractionation on the alcohol dehydrogenase activation rate of corn glycopeptides

3 結(jié)論

食源性蛋白肽的分子質(zhì)量大小與其生物活性有關(guān)。玉米肽酶法糖基化修飾的產(chǎn)物-玉米糖肽經(jīng)過(guò)截?cái)喾肿淤|(zhì)量為5、3 和1 ku 的超濾膜順次分級(jí)分離，獲得分子量>5、5～3、3～1 和<1 ku 四個(gè)組分。經(jīng)超濾膜順次分離后，玉米糖肽的抗氧化和乙醇脫氫酶激活活性主要集中1～3 ku 范圍內(nèi)，且呈劑量依賴性。因此，在制備玉米糖肽時(shí)，可以選用超濾膜對(duì)活性組分進(jìn)行分離和富集。在此基礎(chǔ)上，還需要從分子結(jié)構(gòu)和疏水性方面探索玉米糖肽的生物活性，為玉米糖肽的生產(chǎn)及工業(yè)應(yīng)用提供參考。