三味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠藥效及作用機(jī)制研究

秦華珍 黃煥迪 陳俊其 戴慶玲 何瑞坤 鐘 貴 黃燕瓊 柳俊輝

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧，530200；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧，530023)

高良姜、大高良姜、紅豆蔻3味中藥同屬于山姜屬中藥，它們的藥性與功效具有相似性，都是性味辛溫，歸脾胃經(jīng)，具有溫中散寒、溫胃止痛等功效，臨床常用于脘腹冷痛、傷食吐瀉等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明高良姜、大高良姜、紅豆蔻3味中藥具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌等藥理活性，其中以高良姜素、小豆蔻明、山姜素等構(gòu)成的黃酮類(lèi)成分為其主要活性成分之一[2-5]。

本課題前期研究表明，山姜屬中藥有抗胃潰瘍寒證的藥效，其中主要活性成分黃酮類(lèi)在體外有良好的抗氧化作用[6-7]。為了觀察黃酮類(lèi)成分在體內(nèi)的藥效，本研究提取3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分，以大鼠復(fù)制胃潰瘍寒證模型，觀察大鼠行為體征變化，測(cè)定血清中一氧化氮(Nitric Oxide,NO)、內(nèi)皮肽(Endothelin，ET)、血小板活化因子(Platelet-activating Factor,PAF)、血栓素B2(Thromboxane B2,TXB2)、血清皮質(zhì)素(Cortisone,COR)含量，探討3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分溫中散寒的藥效及作用機(jī)制，為闡釋中藥“親緣關(guān)系-活性成分-效用”的相互關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。在屏障系統(tǒng)SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為(20±2)℃，相對(duì)濕度為40%～70%。動(dòng)物倫理委員會(huì)審批號(hào)：DW20210311-021。

1.1.2 藥物 高良姜、大高良姜、紅豆蔻、知母均購(gòu)自安國(guó)市冷背藥材有限公司，批號(hào)：20181018，經(jīng)我校中藥鑒定學(xué)教研室田慧教授鑒定，高良姜為姜科植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根；大高良姜為姜科植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的干燥根；紅豆蔻為姜科植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的果實(shí)。知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖。

1.1.3 試劑與儀器 干姜姜辣素(西安寶益豐生物科技有限公司，批號(hào)：20190912)；95%乙醇(AR，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：20190316)；氫氧化鈉(AR，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10492126)；鹽酸(AR，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：20190507)；冰乙酸(AR，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：20190507)；羧甲基纖維素鈉(AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180110)。NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190716)；ET、PAF、TXB2、COR試劑盒(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)：201908)。

粉碎機(jī)(上海頂佳工貿(mào)，型號(hào)：DJ-1500)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：RE-6000A)；低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TDL-5-A)；冰箱(青島海爾股份股份有限公司，型號(hào)：BCD-210DCM)；酶標(biāo)儀(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：ST-360)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取SPF級(jí)SD大鼠90只，隨機(jī)取10只為空白組，其余大鼠進(jìn)行胃潰瘍寒證造模，每天早上灌服冰知母(4 ℃)水煎液(劑量10.44 g/kg，生藥量0.5 g/mL，給藥量2 mL/100 g)，下午灌服15%冰乙酸水溶液1 mL，1次/d，連續(xù)4 d[5]。末次造模結(jié)束后隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性組、高良姜高低劑量組、大高良姜高低劑量組、紅豆蔻高低劑量組，共9組。

1.2.2 給藥方法 造模藥物制備：取知母8 kg，加10倍量的純水浸泡1 h，煮沸后保持微沸1 h，過(guò)濾，再加8倍量水煎40 min，過(guò)濾，合并2次濾液，加熱濃縮至0.5 g/mL生藥濃度，靜置冷卻，保存于4 ℃冰箱備用。冰乙酸溶液制備：取99.5%冰乙酸適量，加純水稀釋成15%冰乙酸溶液。

受試藥物制備：取適量高良姜、大高良姜、紅豆蔻飲片分別粉碎成粗粉，加入適量石油醚浸泡脫脂12 h，過(guò)濾，揮干石油醚，脫脂后粗粉依次加入40倍量95%、60%乙醇回流提取，每次提取時(shí)間4 h，提取液過(guò)濾，合并所得濾液，減壓濃縮，回收乙醇至無(wú)醇味。將粗提物加適量的水混勻，煮沸，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10～11，煮沸1 h，過(guò)濾，重復(fù)2次，合并濾液，濾液加入1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1～2，水浴保溫30 min，放置24 h，析出沉淀，離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水抽洗2～3次，40 ℃真空干燥，得到3味山姜屬中藥黃酮提取物[8-9]，備用，用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成相應(yīng)濃度。

陽(yáng)性藥物制備：以0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液將干姜姜辣素配置成濃度4.5 mg/mL，備用。造模結(jié)束后第2天開(kāi)始給藥，空白組和模型組灌服0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液，陽(yáng)性組灌服干姜姜辣素溶液，受試藥物給藥劑量參考前期研究，以黃酮得率為依據(jù)(高良姜、大高良姜、紅豆蔻黃酮得率分別為124.1 g/kg、98.1 g/kg、118.5 g/kg)確定[6]。高低劑量分別為臨床用量的4倍與16倍，給藥體積均為1 mL/100 g，每隔12 h給藥1次，共給藥4次。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 大鼠行為體征觀察：造模及給藥期間，觀察大鼠毛發(fā)、精神狀態(tài)，按表1評(píng)分并計(jì)算平均值；采用電子天平對(duì)大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量進(jìn)行稱(chēng)量統(tǒng)計(jì)；采用量筒測(cè)量統(tǒng)計(jì)各組大鼠飲水量；采用電子體溫計(jì)測(cè)定大鼠肛溫3次，取3次平均值作為最終測(cè)量值。

表1 大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)評(píng)分

大鼠血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量測(cè)定：末次給藥后禁食不禁水12 h，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，常溫放置析出血清，3 000 r/min，離心15 min，分離血清，放入-20 ℃冰箱儲(chǔ)存，備用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法按試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)胃潰瘍寒證大鼠行為體征指標(biāo)的影響 模型組大鼠毛發(fā)臟亂，精神狀態(tài)較差，體質(zhì)量顯著減輕，肛溫顯著降低，日均進(jìn)食量、飲水量顯著減少，與正常組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高良姜、大高良姜、紅豆蔻高劑量組能顯著改善大鼠的毛發(fā)與精神狀態(tài)，升高肛溫，與模型組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組作用不顯著。見(jiàn)表2。高良姜、大高良姜高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著增加，與模型組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組體質(zhì)量變化不明顯。大高良姜高劑量組、紅豆蔻高低劑量組進(jìn)食量顯著增加，與模型組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；高良姜高低劑量組對(duì)進(jìn)食量無(wú)明顯影響。各給藥組之間比較，高良姜低劑量組日均進(jìn)食量與大高良姜組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大高良姜高劑量組、紅豆蔻高劑量組大鼠日均飲水量與高良姜高劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分對(duì)大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)、肛溫的影響

表3 3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分對(duì)大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食、飲水的影響

2.2 對(duì)胃潰瘍寒證大鼠血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清NO含量顯著減少，ET、PAF、TXB2、COR含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較，高良姜高低劑量組、大高良姜與紅豆蔻高劑量組大鼠血清NO含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01或P<0.05)，大高良姜、紅豆蔻低劑量組作用不明顯；各給藥組大鼠血清ET含量均顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01或P<0.05)；高良姜與紅豆蔻高劑量組、大高良姜高低劑量組大鼠PAF、TXB2含量顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01或P<0.05)，高良姜、紅豆蔻低劑量組作用不明顯；高良姜高低劑量組、大高良與紅豆蔻高劑量組血清COR含量顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01或P<0.05)，高良姜與紅豆蔻低劑量組作用不明顯。各給藥組之間比較，高良姜、大高良姜與紅豆蔻高劑量組NO含量升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；高良姜高劑量組、大高良姜與紅豆蔻低劑量組降低ET含量作用顯著，與其他給藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大高良姜與紅豆蔻高劑量組降低COR含量作用明顯，與其他給藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4、表5。

表4 3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠血清NO、ET、PAF含量的影響

表5 3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠血清TXB2、COR含量的影響

3 討論

胃潰瘍屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“胃脘痛”范疇，寒邪客胃型胃脘痛為臨床常見(jiàn)證型，需用溫中散寒藥治療[10-11]。高良姜、大高良姜、紅豆蔻3味山姜屬中藥藥性辛溫，歸脾胃經(jīng)，具有溫胃散寒的功效，臨床常用于治療寒性胃痛。本研究根據(jù)中醫(yī)藥理論、結(jié)合臨床表現(xiàn)復(fù)制胃潰瘍寒證模型，以此模型為基礎(chǔ)，對(duì)3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分的藥效與機(jī)制進(jìn)行研究，符合中醫(yī)“辨證論治”的用藥規(guī)律及“寒者熱之”的治療原則。胃潰瘍臨床表現(xiàn)多為上腹部疼痛，患者常見(jiàn)明顯的體質(zhì)量下降，其原因主要為患者為避免進(jìn)食疼痛，減少進(jìn)食及飲水[12-13]。寒性胃痛常兼有惡寒蜷臥、食欲不振、飲水少、大便稀溏等癥狀。本研究根據(jù)疾病證候特點(diǎn)，觀察大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)，進(jìn)食、體質(zhì)量、飲水、體溫情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：給藥后大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)改善，進(jìn)食量、飲水量增加，體質(zhì)量與體溫回升，表明3味山姜屬黃酮類(lèi)成分具有改善胃潰瘍寒證大鼠病理狀態(tài)，恢復(fù)正常功能的作用。NO是一種血管活性物質(zhì)，具有促進(jìn)胃黏膜血管舒張，增加胃血流量，舒張平滑肌，調(diào)節(jié)胃黏液分泌及阻止血小板凝集等作用。ET是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的斷裂多肽，具有血管收縮，緊張平滑肌等作用[14-15]。NO與ET共同調(diào)節(jié)胃黏膜表皮組織血管緊張性和內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性，有效維持黏膜完整性和黏膜防御功能。NO分泌的降低與ET的升高會(huì)直接導(dǎo)致胃黏膜血管通透性降低，胃黏膜血流量減少，增加黏膜損傷，加重潰瘍面的生成。PAF主要由體內(nèi)多種免疫細(xì)胞分泌，其受體在胃腸道黏膜及周邊血管組織中多有分布，具有降低微血管通透性，減少胃黏膜血流量的作用，PAF的大量分泌會(huì)促使胃黏膜細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂，產(chǎn)生胃黏膜損傷[16-17]。TXB2由生成血栓素A2(TXA2)代謝而成，TXA2能夠增加血栓形成，導(dǎo)致潰瘍面加重。TXA2在人體內(nèi)代謝極快，不易測(cè)定，通過(guò)測(cè)定TXB2含量可獲知TXA2在體內(nèi)的分泌[18]。COR是由腎上腺分泌的一種腎上腺糖皮質(zhì)激素，在機(jī)體受到刺激后，COR會(huì)大量生成，以促進(jìn)蛋白質(zhì)分解，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界刺激的抵抗力，同時(shí)炎癥介質(zhì)表達(dá)增加，導(dǎo)致潰瘍面愈合緩慢[19-21]。

本研究結(jié)果顯示，3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分能夠增加病證大鼠血清NO含量，降低ET含量，從而降低胃黏膜血管緊張性，增加胃黏膜血流量，維持胃黏膜血管緊張性和通透性，促進(jìn)潰瘍面愈合。通過(guò)減少PAF、TXB2、COR的分泌，增加微血管通透性，減少血栓形成，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，維持微血管循環(huán)及胃黏膜細(xì)胞組織的正常的代謝，促進(jìn)胃黏膜血流量，增加胃黏膜愈合。本研究結(jié)果表明：3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分具有抗胃潰瘍寒證作用，其主要通過(guò)增加NO含量，降低ET、PAF、TXB2、COR分泌，促進(jìn)胃黏膜血流量及胃黏膜血循環(huán)，改善胃黏膜細(xì)胞環(huán)境，發(fā)揮治療胃潰瘍寒證的作用。3味山姜屬中藥黃酮類(lèi)成分的溫中散寒藥效具有一定的相關(guān)性和差異性，表明具有親緣關(guān)系的藥物之間活性成分有相似的藥效，但作用強(qiáng)弱不同。