基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討重樓與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)分子機(jī)制

陳佳麗 滕龍飛 李素云 范正媛

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州，450046; 2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州，450000)

原發(fā)性支氣管肺癌(Primary Bronchogenic Carcinoma)簡稱肺癌。按組織病理學(xué)特點(diǎn)不同，分為小細(xì)胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)兩大類，而NSCLC占全部肺癌的80%左右。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告，肺癌發(fā)病率高達(dá)11.6%，居癌癥首位[1]。調(diào)查顯示，85%以上肺癌患者有吸煙史，我國是煙草消費(fèi)大國，肺癌防治已成為我國重要公共健康問題。西醫(yī)治療肺癌的方法包括手術(shù)、放療、化療、靶向以及免疫治療，而這些方法存在一定局限性，或容易復(fù)發(fā)，或不良反應(yīng)較大，或易產(chǎn)生耐藥性等[2]。因此尋找療效好、不良反應(yīng)小的藥物是當(dāng)務(wù)之急。

中藥由于其毒性較低、作用持久的優(yōu)點(diǎn)，在治療癌癥方面展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢，是開發(fā)抗癌新藥的重要來源。肺癌在中醫(yī)古籍中有息賁、肺積、癥瘕、積聚、咳嗽等的記載，《靈樞》曰：“虛邪之人……寒與熱相搏，久留而內(nèi)著，邪氣居其間而不反，發(fā)為瘤?！薄鹅`樞》曰：“夫血脈營衛(wèi)，周流不休……寒邪客于經(jīng)絡(luò)之中則血泣，血泣則不通……故癰腫。寒氣化為熱，熱勝則肉腐……血枯空虛，則筋骨肌肉不相榮，經(jīng)脈敗漏，熏于五臟，臟傷故死矣?！狈伟┌l(fā)病，多由痰、虛、毒、瘀等病因?qū)е?，正氣虛損，臟腑功能失調(diào)，正虛而邪入，使氣血周行不利、產(chǎn)生瘀積，互結(jié)于肺，因此氣血因寒瘀滯，郁而化熱是腫瘤與癰的共同病機(jī)，治宜散結(jié)消瘀之法[3]。從藥理學(xué)方面積累的證據(jù)表明，散結(jié)消瘀法可以改善肺癌患者的癥狀，預(yù)防疾病進(jìn)展，且常規(guī)治療聯(lián)合散結(jié)消瘀類方藥效果優(yōu)于單純西醫(yī)治療[4]。

重樓[Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.]具有清熱解毒，消腫止痛，平喘止咳之功效，可散結(jié)消瘀，是臨床治療肺癌高頻中藥之一[5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ對多種癌細(xì)胞生長均具有抑制作用[6-10]。重樓作為臨床廣泛應(yīng)用的一味中藥，具有多靶點(diǎn)、價(jià)格低、增效減毒等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也面臨著成分較多、作用機(jī)制不明確等問題。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)及生物數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)，使探索中藥發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制變?yōu)榭赡?。這種研究方法，與中醫(yī)藥的整體觀不謀而合，有利于闡明中藥起作用的科學(xué)依據(jù)。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，利用現(xiàn)代生物信息手段探討重樓治療NSCLC的可能作用機(jī)制，為深入研究重樓和研發(fā)新型治療NSCLC藥物提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 獲取藥物活性成分和靶基因 在中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/main/tcm_introduce.asp)以“重樓”或“蚤休”為關(guān)鍵詞，檢索獲得其化學(xué)成分，以SMILES格式保存。利用瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics，SIB)平臺(tái)(http://www.swissadme.ch/)限定藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Absorption為High)，篩選重樓主要活性成分，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道篩選不符合藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)但有可能起到治療作用的藥物成分，并利用SwissTargetPrediction在平臺(tái)中獲得其所對應(yīng)的靶標(biāo)[11-12]。

1.2 NSCLC相關(guān)靶標(biāo)基因的獲取 在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中以“Non-small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞，檢索與NSCLC相關(guān)靶標(biāo)基因[13]。

1.3 重樓治療NSCLC潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測 通過Venny2.1繪圖工具，將重樓主要活性成分對應(yīng)的靶基因與疾病靶基因相映射，獲得“重樓”治療NSCLC的關(guān)鍵作用靶基因。

1.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用Cytoscape(Version 3.6.1)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)(Node)代表重樓活性成分、關(guān)鍵靶基因。邊(Edge)代表活性成分與靶基因相互作用關(guān)系。

1.5 核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為明確潛在作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將1.3篩選出的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)，將蛋白種類定義為“Homo sapiens”，設(shè)置信度>0.7為篩選條件，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，將“重樓”與NSCLC相關(guān)的85個(gè)靶蛋白導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，獲取其相互作用關(guān)系的信息，利用Cytoscape 3.6.1軟件可視化，以TSV格式文件保存。將其導(dǎo)入Cytoscape-3.6.1中，并運(yùn)用其插件“Network Analyze”分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以節(jié)點(diǎn)度值越大說明其越重要[14]。

1.6 基因富集分析及其可視化 將“重樓”與NSCLC的共同基因?qū)牍δ茏⑨屔镄畔W(xué)分析平臺(tái)(DAVID)數(shù)據(jù)庫[15](https://david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。篩選P<0.05的通路，選取富集基因數(shù)最多的前20條通路，使用bioinformatics網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制高級氣泡圖。利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，將19個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG富集分析，以P<0.05為前提篩選GO功能和KEGG通路，并制作高級氣泡圖。

1.7 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 選取富集基因數(shù)最多的20條通路，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出可能與治療NSCLC相關(guān)的通路，利用Cytoscape 3.6.1構(gòu)建出“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.8 分子對接 將重樓核心成分β-蛻皮素通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載其“3D SDF”格式文件，作為分子對接配體；將NSCLC通路涉及核心靶點(diǎn)PIK3CA、MAPK3、MAPK1通過PDB數(shù)據(jù)庫，下載其“PDB”格式文件，作為分子對接受體，利用PyMOL軟件去水加氫后將受體及配體保存成“pdbqt”格式文件，利用Autodock Vina進(jìn)行分子對接，篩選結(jié)合能絕對值最高的為最優(yōu)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 重樓活性成分與相應(yīng)靶點(diǎn) 以藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Absorption為High)作為限定條件并參考文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出活性成分9個(gè)，重樓成分共有14個(gè)。見表1。同時(shí)在平臺(tái)獲取重樓主要活性成分的預(yù)測靶點(diǎn)，共200個(gè)。

表1 重樓活性成分

2.2 NSCLC潛在靶點(diǎn)的預(yù)測 通過GenCards、OMIM數(shù)據(jù)庫剔除重復(fù)后共收集NSCLC潛在靶點(diǎn)4 351個(gè)。

2.3 重樓治療NSCLC潛在作用靶點(diǎn) 將重樓和NSCLC潛在靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集共得到85個(gè)交集靶點(diǎn)，即重樓治療NSCLC潛在作用靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 重樓和NSCLC靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點(diǎn)150個(gè)，邊202條；節(jié)點(diǎn)(Node)代表重樓、重樓活性成分、重樓治療NSCLC潛在作用靶點(diǎn)；邊(Edge)代表其相互作用關(guān)系。其中，β-蛻皮素、γ-氨基丁酸、重樓皂苷A、重樓皂苷G、重樓皂苷F、重樓皂苷D、重樓皂苷B涉及核心靶點(diǎn)較多，可能是重樓治療NSCLC的關(guān)鍵成分，根據(jù)“Degree”值大于均值2.73的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括HSD11B2、PPP2R5A、PPP1CC、PTAFR、STAT3、IL2、PTPN1、PPP2CA、PPM1B、HSD11B1、HPSE、FGF1、VEGFA、F2、BCL2L1、ABAT，這些靶蛋白在網(wǎng)絡(luò)中具有一定的重要性。見圖2。

圖2 重樓-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共涉及85個(gè)節(jié)點(diǎn)、273條邊，其中節(jié)點(diǎn)越大度值越大，其關(guān)系越密切，其在網(wǎng)絡(luò)中更重要。Degree值排名前5位的靶蛋白為促分裂原活化的蛋白激酶1(MAPK1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、促分裂原活化的蛋白激酶3(MAPK3)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(PI3KCA)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)。見圖3。

圖3 重樓核心靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO、KEGG富集分析 通過GO功能富集分析可知，富集基因數(shù)量排名前10位的相關(guān)生物過程包括多細(xì)胞生物生長的調(diào)節(jié)、積極調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂的正調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控、缺乏配體的外在凋亡信號通路、端粒封端的正調(diào)控、端粒酶活性的正調(diào)控、通過端粒酶積極調(diào)節(jié)端粒的維持、對表皮生長因子的反應(yīng)、肺形態(tài)發(fā)生。見圖4A。NSCLC的發(fā)生涉及多種生物過程，而重樓可以通過對以上多種生物過程的調(diào)節(jié)，治療NSCLC。KEGG通路富集分析可知，重樓治療NSCLC的靶點(diǎn)主要與PI3K-AKT信號通路、蛋白聚糖在癌癥通路、Ras信號通路、HIF-1信號通路、Rap1信號通路、VEGF信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、FoxO信號通路、NSCLC通路等關(guān)系較為密切。重樓可能通過多通路共同起到治療NSCLC的作用。見圖4B。

圖4 重樓作用靶點(diǎn)的富集分析

2.7 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 此網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點(diǎn)32個(gè)，邊線93條，體現(xiàn)了重樓治療NSCLC的過程涉及多成分-靶點(diǎn)-通路，符合中藥作用機(jī)制復(fù)雜多樣的特點(diǎn)。其中，PI3K-AKT信號通路Degree值最高，涉及核心靶點(diǎn)最多，如核心靶點(diǎn)PIK3CA、MAPK3、MAPK1、VEGFA等；NSCLC通路涉及核心靶點(diǎn)PI3KCA、MAPK3、MAPK1。見圖5。

圖5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.8 分子對接以驗(yàn)證預(yù)測 結(jié)果顯示：β-蛻皮素與PIK3CA結(jié)合能值為-9.5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)，與MAPK3結(jié)合能為-8.4 kcal/mol，與MAPK1結(jié)合能為-7.0 kcal/mol，分子對接模式見圖6，重樓的活性成分和關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力較好，初步驗(yàn)證了預(yù)測結(jié)果的可靠性。

圖6 分子對接

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新型研究方法，利用網(wǎng)絡(luò)、數(shù)據(jù)庫、計(jì)算機(jī)綜合分析藥物的作用機(jī)制，契合中醫(yī)的整體觀思想，已經(jīng)被成功用于中藥的研究中。本研究利用多個(gè)數(shù)據(jù)庫，獲得了重樓治療NSCLC的85個(gè)候選靶點(diǎn)，根據(jù)篩選出大于“Degree”均值的關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為HSD11B2、PPP2R5A、PPP1CC、PTAFR、STAT3、IL2、PTPN1、PPP2CA、PPM1B、HSD11B1、HPSE、FGF1、VEGFA、F2、BCL2L1、ABAT。由于PPI關(guān)系，為了進(jìn)一步擴(kuò)大篩選范圍，故基于候選靶點(diǎn)構(gòu)建PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選出5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為MAPK1、STAT3、MAPK3、PI3KCA、VEGFA。最終去除重復(fù)后獲得重樓治療NSCLC的19個(gè)靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)被認(rèn)為可能是重樓在NSCLC病理過程中發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

GO功能富集分析可知，富集基因涉及細(xì)胞生長、增殖、分裂、遷移、凋亡過程以及維持端粒穩(wěn)定。KEGG通路富集分析可知，核心靶點(diǎn)MAPK1、MAPK3、PI3KCA均富集在NSCLC通路，核心靶點(diǎn)MAPK1、MAPK3、VEGFA、PIK3CA、BCL2L1、FGF1、STAT3均富集在癌癥通路。核心通路PI3K-AKT信號通路是近年癌癥研究的焦點(diǎn)之一，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期改變等方面有著關(guān)鍵作用。研究顯示，微RNA可通過下調(diào)PI3K-AKT信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻滯細(xì)胞周期，達(dá)到抑制肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[16-17]。FoxO信號通路中抑癌因子FOXO3a可拮抗PI3K-AKT生存信號，修復(fù)細(xì)胞DNA損傷[18]；相關(guān)研究表明，大部分肺鱗癌患者存在著FOXO3基因缺失導(dǎo)致FoxO信號通路的異常[19]。在NSCLC組織中，MAPK信號通路的磷酸化p38 MAPK和磷酸化ERK1/2的表達(dá)均升高，其與肺癌的發(fā)生、預(yù)后密切相關(guān)[20]。故重樓可能通過與多靶點(diǎn)、多通路之間的共同協(xié)同作用，達(dá)到治療NSCLC的效果。

重樓是我們導(dǎo)師治療NSCLC的常用藥，其功效為清熱解毒，消腫止痛，活血化瘀，止咳平喘，現(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)重樓有止血止痛、祛痰抑菌、抗細(xì)胞毒的作用，與肺癌“痰、毒、瘀”的病理特點(diǎn)相切合[21]。研究證實(shí)，重樓治療NSCLC療效確切，探討其活性成分及作用機(jī)制有一定意義，其所含的β-蛻皮素、γ-氨基丁酸、重樓皂苷A、重樓皂苷G、重樓皂苷F、重樓皂苷D、重樓皂苷B均具有較高的Degree值，是重樓重要活性成分，與核心靶標(biāo)和通路聯(lián)系密切，其具有抗腫瘤、細(xì)胞毒，免疫調(diào)節(jié)等作用[22-23]。重樓皂苷A可能通過P53/GADD45/JUN信號通路，抑制蛋白激酶B蛋白磷酸化誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡[24]；重樓皂苷G通過蛋白激酶B、P38促分裂原活化的蛋白激酶和Jun激酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬來抑制癌細(xì)胞成活[25]；重樓皂苷F和重樓皂苷G通過阻斷G2/M細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)外均明顯抑制肺癌細(xì)胞生長[26]；重樓皂苷D可能通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)揮抗癌作用[27]；香煙有害物誘導(dǎo)小氣道肺腺癌動(dòng)物中γ-氨基丁酸表達(dá)不足，提示γ-氨基丁酸可能具有抗小氣道肺腺癌作用[28]；重樓皂苷B可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路降低基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[29]。β-蛻皮素尚未見抗癌機(jī)制報(bào)道，其口服生物利用度高，在網(wǎng)絡(luò)中也是重點(diǎn)成分之一，可做進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步預(yù)測了重樓治療NSCLC的可能靶點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供參考。重樓治療NSCLC的有效成分可能是β-蛻皮素、γ-氨基丁酸、重樓皂苷A、重樓皂苷G、重樓皂苷F、重樓皂苷D、重樓皂苷B等，這些成分可能通過MAPK1、MAPK3、VEGFA、PIK3CA、BCL2L1、FGF1、STAT3等多靶標(biāo)-多通路，共同參與抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、維持端粒穩(wěn)定作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討重樓治療NSCLC的作用機(jī)制，但仍具有一定局限性，有待進(jìn)一步探討及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。