HPLC法測(cè)定通宣理肺片中多指標(biāo)性成分的含量

李堅(jiān)李運(yùn)石曉峰

1.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050

通宣理肺片收載于《中國(guó)藥典》，由紫蘇葉、前胡、桔梗等11味中藥組成，具有解表散寒，宣肺止咳的功效；用于風(fēng)寒束表、肺氣不宣所致的感冒咳嗽等癥的治療[1］。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定鹽酸麻黃堿、枳殼、甘草、紫蘇葉等的薄層鑒別及黃芩苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量測(cè)定，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制。近年來(lái)，有學(xué)者開展了通宣理肺片指紋圖譜[2］、柚皮苷含量測(cè)定[3］及基于近紅外的一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚4］等研究工作。為了更全面的掌握、控制通宣理肺片的整體質(zhì)量，本文結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，選擇甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸等6種指標(biāo)性成分的含量為考察對(duì)象，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695液相色譜儀（Waters公司）；XSE205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB-800DT超聲波恒溫清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑 甘草苷（批號(hào)：111610-201908，純度：95%）、柚皮苷（批號(hào)：110722-201815，純度：91.7%）、橙皮苷（批號(hào)：110721-202019，純度：95.3%）、新橙皮苷（批號(hào)：111857-201804，純度99.4%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-201619，純度96.2%）對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃芩苷（批號(hào)：8369，純度：96.2%）對(duì)照品購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純；純化水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 試藥 收集7個(gè)不同廠家生產(chǎn)的28份通宣理肺片樣品。見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備。精密稱取各對(duì)照品適量，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，即得（其中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸的濃度分別為0.928、1.737、0.679、1.778、1.708、0.965mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液的制備。取編號(hào)為S3的樣品適量，研成粉末，取約1g置于150mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇25.00mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300W，頻率40kHz）30min，放冷，再次稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備。按照處方比例及工藝，分別模擬制備缺甘草，缺陳皮，缺枳殼，缺陳皮、枳殼，缺黃芩及缺甘草、黃芩、陳皮、枳殼的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[5］。CAPCELL PAK C 18 MG色譜柱（250 mm×4.6mm，5μm）；0.1%甲酸水溶液（A）-80%乙腈（B），梯度洗脫（0～5min，15%～20%B；5～10min，20%～25%B；10～20min，25%B；20～30min，25%～48%B；30～40min，48%～70%B；40～45min，70%～90%B；45～55min，90%B；55～56min，90%～15%B；56～60min，15%B）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；進(jìn)樣體積：10μL。

2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。分別取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，色譜圖見圖1。分析結(jié)果提示，各指標(biāo)性成分分離度良好；陰性樣品色譜圖中，各對(duì)應(yīng)目標(biāo)化合物在相應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)色譜峰吸收出現(xiàn)，表明處方中其他共存物質(zhì)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，理論塔板數(shù)以黃芩苷（5號(hào)峰）計(jì)應(yīng)不得少于5000。

圖1 通宣理肺片及其陰性樣品的HPLC色譜圖

2.2.3 線性關(guān)系考察。精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各指標(biāo)性成分的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)

2.2.4 精密度試驗(yàn)。取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，以色譜峰面積積分值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、峰面積的RSD（n=6）分別為1.57%、2.47%、2.27%、2.47%、2.32%、2.67%，表明該方法的儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)。取編號(hào)為S3的樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸峰面積RSD分別為1.05%、1.09%、2.20%、2.18%、2.52%、1.61%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取編號(hào)為S3的樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸峰面積RSD分別為1.43%、2.68%、1.40%、1.10%、0.36%、1.11%，表明供試品溶液在24h內(nèi)均處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)。精密量取各成分含有量已知的樣品（S3）0.5g，共6份，加入對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷和甘草酸平均加樣回收率（n=6）分別為98.65%、102.10%、98.53%、98.69%、94.12%、99.05%、RSD分別為2.05%、1.68%、2.30%、1.29%、2.25%、1.49%。

2.2.8 樣品測(cè)定。分別取28批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算含量。見表3。

表3 各指標(biāo)性成分的含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的考察 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%甲酸、90%乙腈-0.2%磷酸水、80%乙腈-0.2%磷酸水、80%乙腈-0.1%甲酸水等不同流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果表明以80%乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫，各指標(biāo)成分峰形較好。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的考察 采用DAD檢測(cè)器，對(duì)各指標(biāo)成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，比較不同吸收波長(zhǎng)處色譜峰響應(yīng)強(qiáng)度，最終確定250nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，各成分在該波長(zhǎng)下，檢測(cè)靈敏度較好，無(wú)干擾。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析 28份分析樣品中，甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸的含量分別為0.0046%～0.0735%、0.0169%～0.5200%、0.0151%～0.2408%、0.0084%～0.4399%、0.4348%～0.8137%、0.0137%～0.1068%。結(jié)果提示，各企業(yè)內(nèi)部不同批次間各指標(biāo)成分的含量差異較小，一致性較好。而在不同企業(yè)間各樣本中指標(biāo)成分的含量差異較大。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定通宣理肺片其中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸含量的HPLC方法，能夠較全面地反映該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量狀況；且測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定性好，可為該制劑的整體質(zhì)量控制提供參考。