TcYellow-h基因過(guò)表達(dá)參與介導(dǎo)赤擬谷盜對(duì)磷化氫的抗性形成

陳二虎，孟宏杰，陳 艷，宋 偉，唐培安

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)隸屬鞘翅目，擬步甲科，擬谷盜屬，是一種全球廣泛分布的重要儲(chǔ)糧害蟲，在我國(guó)大部分地區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重危害玉米、稻谷、小麥、大豆以及薯干、酒曲、豆餅、藥材、油菜等[1]。赤擬谷盜具有食性復(fù)雜、繁殖能力強(qiáng)、分泌有毒物質(zhì)等特點(diǎn)，在農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中一旦局部發(fā)生便會(huì)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。磷化氫(PH3)是儲(chǔ)糧害蟲防治的重要熏蒸劑，由于長(zhǎng)期施用，已導(dǎo)致赤擬谷盜、銹赤扁谷盜(Cryptolestesferrugineus)、谷蠹(Rhyzoperthadominica)等害蟲對(duì)其產(chǎn)生不同程度抗藥性[3-5]，影響了糧食倉(cāng)儲(chǔ)[6]。因此，開展磷化氫抗性機(jī)制研究，避免和延緩磷化氫抗性發(fā)展，對(duì)磷化氫的可持續(xù)利用具有參考價(jià)值。磷化氫可通過(guò)呼吸作用進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，進(jìn)而降低線粒體膜電位，抑制氧化呼吸反應(yīng)，引起蟲體內(nèi)活性氧(ROS)水平顯著提升，導(dǎo)致氧化損傷，最終造成昆蟲死亡[7]。因此，可通過(guò)控制昆蟲線粒體及呼吸代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平來(lái)降低呼吸速率，進(jìn)而減少熏蒸劑的吸收[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜和谷蠹磷化氫抗性品系的呼吸速率顯著低于敏感品系[9, 10]，線粒體重要的二聚體酶二氫硫辛酰胺脫氫酶基因突變已被證實(shí)參與介導(dǎo)谷蠹和赤擬谷盜對(duì)磷化氫高水平抗性的形成[11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)眾多解毒代謝相關(guān)基因，包括細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶(Carboxylesterases)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases)等均在儲(chǔ)糧害蟲磷化氫抗性品系中顯著高表達(dá)[12-15]。本課題組前期研究結(jié)果顯示P450酶活性的提高參與介導(dǎo)赤擬谷盜磷化氫抗性，進(jìn)一步干擾過(guò)表達(dá)的P450基因，昆蟲對(duì)磷化氫敏感性顯著增強(qiáng)，證實(shí)解毒代謝反應(yīng)亦參與儲(chǔ)糧害蟲磷化氫抗性形成[14, 15]。昆蟲表皮覆蓋于蟲體外表面，具有承擔(dān)外骨骼的功能，起防御外界不良環(huán)境如病原體、殺蟲劑等侵襲的作用，是昆蟲適應(yīng)復(fù)雜自然環(huán)境的重要保護(hù)器官[16]。昆蟲可通過(guò)改變表皮結(jié)構(gòu)和成分，降低表皮穿透性來(lái)阻止或減少殺蟲劑進(jìn)入蟲體，進(jìn)而形成抗藥性，因此表皮穿透性是昆蟲抗藥性形成的機(jī)制之一[17]，其是否參與磷化氫抗性形成鮮見報(bào)道。研究人員已通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)表皮相關(guān)基因TcYellow-h在赤擬谷盜磷化氫抗性品系中顯著高表達(dá)，預(yù)示其可能與磷化氫抗性相關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)以危害嚴(yán)重且抗性發(fā)展迅速的儲(chǔ)糧害蟲赤擬谷盜為研究對(duì)象，綜合運(yùn)用生物測(cè)定、RT-qPCR、RNA干擾等技術(shù)明確昆蟲磷化氫抗性與表皮相關(guān)基因的關(guān)系，進(jìn)而為儲(chǔ)糧害蟲的抗性治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

選用5個(gè)不同地理種群的赤擬谷盜，分別采自江蘇(JS，抗性倍數(shù)為1.7)、云南(YN，抗性倍數(shù)為3.0)、湖南(HN，抗性倍數(shù)為20.2)、四川(SC，抗性倍數(shù)為395.4)和廣東(GD，抗性倍數(shù)為862.7)，并在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)糧食儲(chǔ)運(yùn)研究室培養(yǎng)數(shù)代并形成穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室種群。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以人工飼料(全麥粉∶酵母粉=19∶1)，在恒溫(29～31) ℃、相對(duì)濕度為70%～80%、無(wú)光照的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。

1.2 生物信息學(xué)分析

從Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得赤擬谷盜表皮相關(guān)基因TcYellow-h(LOC660892)的核苷酸序列，用NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測(cè)該基因的完整開放閱讀框(ORF)。分別使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)在線軟件預(yù)測(cè)TcYellow-h蛋白的信號(hào)肽及保守的特征序列。

1.3 不同組織基因表達(dá)模式分析

不同組織樣本收集，在冰上解剖羽化后7日齡的赤擬谷盜成蟲30頭(江蘇種群為試蟲)，分別在加有Trizol的無(wú)菌離心管中收集足量的不同組織部位表皮(頭、胸、腹)、翅、足、腸道、馬氏管、脂肪體，并置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。參照Trizol試劑說(shuō)明書提取樣品的總RNA(RNA濃度約為500～600 ng/μL)，接著利用RQ1 Rnase-Free Dnase去除基因組DNA。用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶情況，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以RNA為模板(約1 000 ng)，依據(jù)HiScript?ⅡstStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)1.3節(jié)中獲得的序列信息，利用Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設(shè)計(jì)赤擬谷盜TcYellow-h的特異性RT-qPCR引物(表1)，同時(shí)選擇赤擬谷盜RPS18(XM_968539)和RPL13(XM_969211)作為定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因[14, 15]。按照ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix (Low Rox Premixed)試劑盒說(shuō)明書，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。該反應(yīng)為20 uL體系，包括ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low Rox Premixed)10 μL，上下游引物各1 μL，Template cDNA 2 μL和RNaes free water 6 μL。RT-qPCR程序包括，95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，并進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后95 ℃延伸30 s。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并基于2-ΔΔCt的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[18]。RT-qPCR采用單因素方差分析方法，平均值多重比較采用最小顯著差異法(LSD)，柱形圖中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

表1 引物序列

1.4 不同地理種群基因的表達(dá)模式分析

分別挑取正常飼養(yǎng)條件下不同地理種群(JS、YN、HN、SC和GD)的赤擬谷盜7日齡成蟲5頭，加入Trizol充分研磨，總RNA提取、cDNA合成、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)以及數(shù)據(jù)分析均參照1.3小節(jié)，共設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 RNA干擾

根據(jù)TcYellow-h的基因序列信息，設(shè)計(jì)帶有T7啟動(dòng)子的特異性引物(表1)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參照T7 RNAi Transciption Kit TR102試劑盒說(shuō)明書體外合成dsRNA。參照Huang et al(2019)的方法[14]，將200 ng dsRNA注射到赤擬谷盜(廣東種群)蛹內(nèi)(注射位置為蛹的腹側(cè)第1節(jié)或者第2節(jié))，以未注射組作為空白對(duì)照，注射dsGFP組作為陰性對(duì)照，每組試蟲30頭，設(shè)置3次重復(fù)。注射完畢后，置于培養(yǎng)箱中正常飼養(yǎng)，收集羽化第7天的赤擬谷盜成蟲，并凍存于液氮中備用。參照1.3小節(jié)的方法進(jìn)行總RNA提取、cDNA合成、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)以及數(shù)據(jù)分析，并計(jì)算RNA干擾的沉默效率。

將TcYellow-h基因進(jìn)行有效沉默后，對(duì)赤擬谷盜磷化氫敏感性進(jìn)行檢測(cè)。選取各處理組成蟲試蟲(50頭，7日齡)，使用LC30的磷化氫濃度行處理；使用氣密性注射器抽取磷化氫氣體并注入熏蒸瓶?jī)?nèi)，搖勻后置于培養(yǎng)箱中密閉熏蒸(恒溫29～31 ℃、相對(duì)濕度為(70%～80%)。熏蒸20 h，統(tǒng)計(jì)試蟲死亡數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)14 d(以毛筆輕碰蟲體尾部，附肢無(wú)反應(yīng)作為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn))，每組實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)?；虺聊始霸囅x死亡率均采用單因素方差分析方法，平均值多重比較采用最小顯著差異法(LSD)，柱形圖中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤擬谷盜Tcyellow-h序列分析

根據(jù)ORF Finder分析，赤擬谷盜TcYellow-h(GeneBank登錄號(hào)：XM_008198277.2)開放閱讀框840 bp，編碼279個(gè)氨基酸。SignalP 4.1信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TcYellow-h不存在信號(hào)肽。氨基酸序列分析顯示TcYellow-h在第159～448個(gè)氨基酸之間存在保守的major royal jelly protein domains(MRJP, pfam03022)氨基酸區(qū)域(圖1)。

圖1 赤擬谷盜TcYellow-h氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析

2.2 不同組織表達(dá)模式分析

針對(duì)TcYellow-h基因，其主要在翅組織中高表達(dá)，且與其他組織表達(dá)量差異顯著(P<0.05)；在胸和腹部表皮組織和足中表達(dá)量相對(duì)較低；在腸道、馬氏管、脂肪體中少量表達(dá)或幾乎不表達(dá)。

2.3 不同地理種群表達(dá)量分析

TcYellow-h基因在不同地理種群赤擬谷盜的表達(dá)水平顯示該基因表達(dá)水平隨赤擬谷盜磷化氫抗性水平的增加呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，且TcYellow-h基因在極高抗種群(SC和GD)的表達(dá)量顯著高于其他種群(P<0.05)。

2.4 基因沉默對(duì)赤擬谷盜磷化氫敏感性的影響

利用RNAi技術(shù)干擾TcYellow-h基因的表達(dá)，以分析該基因與赤擬谷盜磷化氫抗性形成的關(guān)系?；虺聊蕶z測(cè)結(jié)果顯示，dsRNA注射能有效降低目的基因的表達(dá)，且dsGFP注射組與空白對(duì)照組基因表達(dá)量均無(wú)顯著差異，dsTcYellow-h注射組基因沉默效率為73.0%。TcYellow-h基因的表達(dá)量降低后，極高抗種群(廣東，GD)試蟲對(duì)磷化氫的敏感性顯著增強(qiáng)，經(jīng)磷化氫(LC30)處理后其死亡率較對(duì)照組均顯著升高(P< 0.05)。dsTcYellow-h處理組試蟲死亡率較對(duì)照組升高了32.22%，空白對(duì)照組和dsGFP處理組之間試蟲死亡率均無(wú)顯著差異(圖2)。

注：柱形圖表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母之間表示顯著性差異(P < 0.05, LSD法)，以dsGFP為陰性對(duì)照，以未處理組為空白對(duì)照。圖2 赤擬谷盜TcYellow-h基因沉默效率檢測(cè)及基因沉默后磷化氫的敏感性變化

3 討論

儲(chǔ)糧害蟲對(duì)磷化氫的抗性問(wèn)題日益嚴(yán)重，已經(jīng)成為制約世界各國(guó)糧食儲(chǔ)藏行業(yè)健康發(fā)展的主要問(wèn)題之一[6, 19]。目前，美國(guó)、澳大利亞、巴西、印度、中國(guó)等眾多國(guó)家發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜對(duì)磷化氫產(chǎn)生了較高的抗藥性[14, 20-22]。已有研究發(fā)現(xiàn)磷化氫可通過(guò)呼吸作用進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，且磷化氫抗性產(chǎn)生與儲(chǔ)糧害蟲呼吸和解毒代謝通路基因相關(guān)[7, 10, 11, 13]。磷化氫除通過(guò)呼吸作用進(jìn)入蟲體外，亦可通過(guò)擴(kuò)散作用穿透表皮直接進(jìn)入蟲體，即當(dāng)昆蟲呼吸急促時(shí)，呼吸作用表現(xiàn)為主要吸收途徑；而當(dāng)昆蟲呼吸作用逐漸減弱時(shí)，表皮穿透作用則上升為主要方式[23]，推測(cè)表皮穿透性直接影響昆蟲對(duì)磷化氫的吸收，表皮相關(guān)基因TcYellow-h與磷化氫抗性形成可能存在聯(lián)系。

TcYellow-h擁有典型的MRJP基序，屬于昆蟲yellow家族蛋白，且該家族基因在昆蟲表皮鞣化(骨化和著色)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[24]。赤擬谷盜不同組織表達(dá)模式分析顯示，TcYellow-h基因主要在成蟲外周組織高表達(dá)，該基因可能在昆蟲表皮中發(fā)揮作用。RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)TcYellow-h基因表達(dá)量隨赤擬谷盜抗性水平的增加而顯著升高，類似地，在銹赤扁谷盜、溫帶臭蟲(Cimexlectularius)、桃蚜(Myzuspersicae)、中華按蚊(Anophelessinensis)、致倦庫(kù)蚊(Culexquinquefasciatus)等昆蟲中發(fā)現(xiàn)不同種類表皮相關(guān)基因在藥劑抗性品系中顯著高表達(dá)[25-29]。可見，TcYellow-h是赤擬谷盜表皮重要的結(jié)構(gòu)基因，可能參與了磷化氫抗性的形成。

本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證TcYellow-h基因在赤擬谷盜磷化氫抗性形成過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示，當(dāng)注射該基因的dsRNA后，TcYellow-h基因表達(dá)水平顯著降低，且經(jīng)磷化氫處理后，處理組害蟲的死亡率顯著高于對(duì)照組，表明基因干擾后赤擬谷盜對(duì)于磷化氫的敏感性顯著增強(qiáng)。昆蟲表皮鞣化反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的胞外過(guò)程，對(duì)于表皮的硬化和著色至關(guān)重要。有效沉默鞣化通路上的關(guān)鍵基因，如酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase)、多巴脫羧酶(DOPAdecarboxylase)、漆酶(laccase2)、yellow等基因后，昆蟲表皮的著色、結(jié)構(gòu)和厚度均受到顯著影響[24, 30, 31]，暗示它們存在參與昆蟲對(duì)于藥劑表皮穿透抗性形成的潛力[32]。據(jù)此，通過(guò)本研究可得出表皮相關(guān)基因TcYellow-h與赤擬谷盜磷化氫抗性相關(guān)。

4 結(jié)論

赤擬谷盜表皮相關(guān)基因TcYellow-h屬于昆蟲yellow家族基因，且其主要在昆蟲外周組織進(jìn)行表達(dá)；TcYellow-h基因表達(dá)量隨赤擬谷盜磷化氫抗性水平增加而顯著升高；干擾TcYellow-h基因后，赤擬谷盜對(duì)磷化氫的敏感性顯著增強(qiáng)，說(shuō)明表皮相關(guān)基因可能參與介導(dǎo)赤擬谷盜對(duì)磷化氫抗藥性的形成。