廣東2020-2021年乙型流感病毒分子變異特征

譚 靜，梁麗君，黃 平，黃曉玲，李柏生，曹 虹，鄒麗容

510515 廣州，南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院1；511430 廣州，廣東省疾病預防控制中心廣東新發(fā)突發(fā)傳染病防治工作站2

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，歷史上曾發(fā)生多次世界范圍的大流行。根據(jù)抗原性不同，人類流感病毒分成甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因易變且易引起流行，乙型流感也常引起局部暴發(fā)。近年乙型流感受到全球關注，有研究報道，年齡≥50歲人群乙型流感感染者中，臨床病死率可達到2.5% (95%CI，0.7%～7.6%)。

乙型流感病毒基因組具有單負鏈8個節(jié)段，其中血凝素(hemagglutinin，HA)基因位于第4節(jié)段，神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)基因位于第6節(jié)段。HA在病毒包膜上以三聚體形式存在，識別并結合宿主細胞表面的受體結合位點(receptor binding sites，RBS)，具有特異性；同時刺激宿主產(chǎn)生保護性中和抗體，是設計流感疫苗的常用靶點。NA由4條糖蛋白鏈組成，單體頭部是NA活性中心，具有型別特異性；此外NA持有神經(jīng)氨酸酶活性(涉及感染細胞內(nèi)成熟病毒釋放)和抗原性(抗原特異性)。乙型流感8個節(jié)段中，以HA和NA基因的生物學功能最為重要，是流感疫情流行的分子基礎。

國內(nèi)山東濟寧地區(qū)2018-2020年乙型流感Bv毒株流行，屬于Bv.1a株系；2021年下半年，廣東地區(qū)流感疫情頻繁，較去年同期每月疫情上升50%～85%。結合本地區(qū)的監(jiān)測工作，初步鑒定為乙型流感活動。為深入了解廣東地區(qū)2020-2021年乙型流感HA和NA基因的變異和進化特征，本研究開展毒株HA/NA基因分析，以期為乙型流感防治提供分子水平依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株來源

廣東各地區(qū)流感監(jiān)測網(wǎng)絡采集流感咽拭并分離流感病毒；時空分布方法篩選流感毒株，其中2020年和2021年分別為8株和26株，合計34株。從GenBank下載全球人類乙型流感毒株的HA/NA基因序列共23對，包括世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)疫苗株4株，株系代表株5株(2008-2021年)；此外亞洲7株(含中國3株)，歐洲2株和北美5株。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)2015-2020年全球乙型流感Bv毒株HA和NA基因核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0軟件(PREMIER Biosoft International，Palo Alto，CA，USA)設計和兼并，合成HA和NA基因擴增引物各3對。

1.3 基因擴增與鑒定

采用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA mini Kit(Lot 169018932)提取RNA，置-20 ℃保存；采用Invitrogen的SuperScript? Ⅲ One-Step RT-PCR System with Platinum? Taq (Lot 1996333)進行RT-PCR擴增。擴增產(chǎn)物鑒定，Size Marker為100～2 500 bp。

1.4 序列檢測

PCR產(chǎn)物純化采用廣州天一輝遠基因科技有限公司磁珠法瓊脂糖凝膠PCR回收試劑盒，測序用ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，在ABI 3730 DNA Analyzer上測序。根據(jù)順義和反義引物的測序結果，采用Lasergene v8.1.3軟件(DNASTAR，Madison，WI，USA)拼接核苷酸(Nucleotide，Nt)，驗證檢測序列的正確性。

1.5 變異與進化分析[6]

采用MEGA 7.026軟件的Clustal W進行核苷酸同源性分析，用鄰接法(Neighbor-joining)構建HA/NA基因進化樹。通過BioEdit v7.2.6(Ibis Biosciences，Carlsbad，CA，USA)計算HA/NA上每個氨基酸(Amino acid，AA)位點的熵值(Entropy value)，并進行評價。通過NetNGlyc 1.0 Server對氨基酸序列進行糖基化位點分析。通過Datamonkey 2.0，分別采用SLAC (Single likelihood ancestor counting)、FEL (Fixed-effects likelihood)和FUBAR (Fast，Unconstrained Bayesian App Roximation)方法，對HA/NA基因進行進化分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

規(guī)整基因序列資料，采用SPSS 23.0對核苷酸和氨基酸變異信息進行獨立樣本

t

檢驗。以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 毒株分布

采用時空分布法篩選2020年(8株)和2021年(26株)毒株(2020年4-12月監(jiān)測無Bv分離株)，包括潮州5株、東莞1株、廣州2株、河源1株、惠州3株、江門2株、茂名2株、梅州1株、清遠2株、汕頭1株、汕尾2株、韶關5株、深圳3株、湛江1株、中山1株和珠海2株。

2.2 同源性與進化分析

廣東Bv毒株HA和NA基因片段，分別為1 875 bp和1 556 bp；編碼區(qū)(ORF，Open reading frame)分別為1 749 bp和1 401 bp。基因比對發(fā)現(xiàn)：①疫苗株B/Colorado/06/2017的HA基因ORF丟失Nt序列(aaaaac)；此后2017年以后的毒株[包括2019和2021年疫苗株(2株)、廣東毒株(34株)和全球毒株(14株)]均丟失Nt序列(aaaaacgac)；②以疫苗株B/Brisbane/60/2008的NA基因為基準，其ORF共有1 401 bp，在Nt后插入tcc，出現(xiàn)在B/Bangladesh/8007/2021和B/Singapore/WUH7588/2021毒株。

以4株疫苗株基因序列作為基準，計算2020年和2021年廣東毒株的核苷酸同源性，結果如表1所示。同源性分析揭示：①4株疫苗株中，廣東2021年流行毒株HA基因同源性與疫苗株B/Austria/1359417/2021同源性最高[(99.19±0.26)%]，而NA基因同源性卻與2019年疫苗株B/Washington/02/2019同源性卻最高[(99.23±0.11)%]；②以4株疫苗株HA核苷酸序列為基準，2021與2020年毒株HA基因均有統(tǒng)計學差異(

P

<0.01)，提示廣東2021年毒株HA基因發(fā)生極其明顯變異；③以疫苗株B/Washington/02/2019的NA核苷酸序列為基準，2021年毒株與2020年毒株NA基因同源性有統(tǒng)計學差異(

P

<0.01)，提示廣東2020年毒株NA基因有明顯變異；④疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因與2021年毒株HA基因同源性為(99.19±0.26)%；而與2021年下半年毒株(17株)HA基因同源性高達(99.28±0.25)%，提示廣東2021年下半年流行毒株HA基因與當前WHO推薦疫苗株基因依然高度契合。

廣東2020-2021年的34株毒株HA基因進化特征，如圖1A所示，結果顯示：①廣東2020年毒株(8株)與廣東2021年毒株(下半年分離，17株)具有不同基因特征：2020年毒株呈Bv.1a.3株系特征，2021年毒株主要呈Bv.1a.3a.2株系特征。；②廣東2020年毒株與2021年毒株(上半年，9株)具有疫苗株B/Washington/02/2019基因特征；國外2020年毒株包括歐洲(圣彼得堡)、美洲(加州和賓州)、亞洲(新加坡、愛知)和2021年美洲毒株(德州和新墨州)；③廣東2021年毒株(下半年分離)呈現(xiàn)疫苗株B/Austria/1359417/2021基因特征，具體表現(xiàn)國外是B/Paris/9867/2020最早出現(xiàn)(2020-11-25)，隨后是國內(nèi)廣東B/Guangdong/073/2021 (2021-01-02)，北京B/Beijing/Chaoyang/12099/2021 (2021-08-31)；另包括國外(密歇根、孟加拉和新加坡)2021年1月后的分離毒株。

廣東毒株NA基因進化如圖1B所示，主要特征包括：①廣東2020年毒株(8株)與2021年(26株)具有不同基因特征，廣東2020年毒株NA基因與同期圣彼得堡、加州、新加坡、賓州、愛知、中國香港的毒株同源性類似；②廣東2021年上半年毒株(1～6月，9株)與下半年部分毒株(17株)也具有一定差異；③廣東2021年26株NA基因相似度更接近疫苗株B/Washington/02/2019的基因(99.23±0.11)%。

2.3 氨基酸和抗原位點置換

HA基因ORF的1 749 bp編碼582個氨基酸(AA)；以疫苗株B/Washington/02/2019的HA基因為基準，50株中，31個氨基酸位點發(fā)生置換，其中廣東34株毒株有26個置換，全球14株(2020-2021年)有16個置換，疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因有8個置換。以疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因為基準，廣東和全球毒株置換差異一致。

以疫苗株B/Washington/02/2019的HA基因為基準，置換位點包括位點HQ/N(廣東，16/26；全球，1/6)、位點SD/N(廣東，7/8和廣東，26/26；全球，8/8和全球，6/6)、位點AT、PL和KR(廣東，15/26；全球，1/8和全球，4/6)、位點RG、GE和RK(廣東，26/26；全球，2/8和全球，4/6)、位點VM和PQ(廣東，10/26；全球，1/8和全球，4/6)。

疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因特征在于，位點AT、RG、PL、GE、SD、KR和RK已經(jīng)發(fā)生置換；即在這些位點上，疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA氨基酸序列已體現(xiàn)出廣東2021毒株特征。比較廣東2021年下半年毒株與疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA基因差異，在于KE(2/19)以及TI、PLSS、AT和GR(1/19)置換。

疫苗株B/Washington/02/2019的NA基因ORF具有1 401 bp，編碼466個AA；以此NA基因為基準，AA后插入亮氨酸(L)見于B/Bangladesh/8007/2021和B/Singapore/WUH7588 /2021毒株。50株中，共29個AA位點變異，其中廣東(34株)和全球(14株)分別有14和20變異位點；此外，疫苗株B/Austria/1359417/2021的6個位點變異。

以2019年疫苗株NA基因為基準，變異特點包括：①廣東2020年毒株僅EG變異；②2021年毒株包括DN(13/26)、NS(13/26)、GE/R(14/26)、VI(13/26)和KE(15/26)；以及DN、NS、GE、VI和KE；③少數(shù)基因變異還包括FL、IM、PQ、PT、VI、IV、GE和ED。

表1 廣東毒株HA/NA基因同源性比較(%)

HA (x±s)NA (x±s)疫苗株2020年(n=8)2021年(n=26)P2020年(n=8)2021年(n=26)PB/Brisbane/60/200897.76±0.0997.43±0.16<0.00198.44±0.0998.47±0.090.464B/Colorado/06/201798.75±0.0798.45±0.17<0.00199.14±0.0999.17±0.090.448B/Washington/02/201999.81±0.0698.90±0.21<0.00199.79±0.0899.23±0.11<0.001B/Austria/1359417/202198.50±0.0599.19±0.26<0.00198.44±0.0998.54±0.150.072

基因核苷酸(ORF)同源性是基于廣東毒株與疫苗株的比較

A:HA基因；B:NA基因

2.4 糖基化位點與藥敏位點變異

疫苗株B/Austria/1359417/2021的HA蛋白共有潛在糖基化位點10個，即NVT、NCT、NIT、NKT、NQT、NKS、NGT、NIT、NHT和NVS。此次變異中，HA氨基酸DN變異，導致增加糖基化位點NET，見于B/Guangdong/428/2020、B/Guangdong/523/2020和B/Guangdong/053/2021；PLSS變異，增加NSS糖基化位點，見于B/Guangdong/116/2021。疫苗株B/Austria/1359417/2021的NA蛋白共有潛在糖基化位點4個，NAS、NRS、NGT和NKT；未發(fā)現(xiàn)置換變異。

以疫苗株B/Brisbane/60/2008的NA為基準，已報道NA單耐藥位點共有29個和雙耐藥位點4個；在本研究中未出現(xiàn)上述具體氨基酸位點變異。

2.5 熵值和選擇性改變

根據(jù)50株毒株HA氨基酸熵值結果，熵值≥0.600包括位點148、165和291(均為0.641)， 142、159和215(均為0.680)，137(0.717)，196(0.731)和209(0.779)；NA氨基酸包括位點344(0.680)和234(0.684)。見表2。

50株HA和NA基因，進行選擇性分析(NA未計入插入L，見B/Bangladesh/8007/2021和B/Singapore/WUH7588/2021)。SLAC和FEL兩方法中к<к，而FUBAR方法中к>к，提示不同計算方法導致HA基因的к值[轉(zhuǎn)換(α)/顛換(β)]不同。SLAC檢驗ω=d/d比值，如果ω<1，且

P

(ω<1)<0.1則存在負向選擇位點，SLAC檢驗分別位于HA基因73，138，437和497位點和NA基因179，321和335位點。

50株毒株采用FEL檢驗，選擇性分析顯示，HA和NA基因分別篩選出28個和14個負向選擇位點；采用FUBAR檢驗，分別篩選出HA基因15個負向選擇位點和1個正向選擇位點(AA)，NA基因10個負向選擇位點和1個正向選擇位點(AA)。根據(jù)多種方法結果一致性的原則，綜合評價，HA和NA基因氨基酸負向選擇位點分別是73，138，437和497位點，及179，321和335位點。

3 討論

自2009年流感H1N1出現(xiàn)以后，廣東流感各型別(包括HN和B型)共同存在流行季節(jié)中，交替成為優(yōu)勢型別。本研究中，①2020-2021年流感優(yōu)勢毒株被鑒定為B型Victoria株系；②2020年4-12月監(jiān)測未分離到流感各亞型毒株，這可能與流感流行特征以及國內(nèi)新冠疫情的嚴格防控措施有關系；③2021年下半年Bv毒株多從局部疫情暴發(fā)人群中分離。

分別以4株疫苗株HA基因為基準比較廣東2020與2021年毒株之間差異，發(fā)現(xiàn)4株疫苗株的基準的2年間HA基因同源性均有統(tǒng)計學差異(

P

<0.01)，NA基因在2020年(與2020年前比較)也發(fā)生變異，但僅與B/Washington/02/2019基準差異明顯，提示廣東Bv流行株HA基因在2021年(與2020年比較)發(fā)生顯著性變異。而且廣東Bv流行株HA基因變異特征，主要呈現(xiàn)于2021年下半年的疫情毒株。杭州2014-2019年流行Bv的Bv.1a株系(類似疫苗株Bv/Colorado/06/2017)，HA和NA基因同源性分別為94.67%和97.13%。

此次廣東毒株變異(以疫苗株B/Washington/02/2019的HA基因為基準)見于A表位[VI (1/26，202 1)、HN/Q (16/26，2021)、AT(15/26，2021)；RG(26/26，2021)]、B表位[GR(1/26，2021)、PL (15/26，2021)；NK(26/26，2021)]；D表位[SN(7/8，2020)、SD(25/26，2021)；TA(5/8，2020)]。與此比較，杭州Bv.1a株系毒株變異見于A表位(LI、HN、IV)、B表位(ND/G、GR)和D表位(IV)；云南地區(qū)2017-2018年流行乙型流感By/Bv毒株，其中Bv毒株HA基因具有VI突變特征，同時SN和VI發(fā)生變異。

表2 50株毒株HA/NA基因熵值

氨基酸位點a熵值HANA<0.30014, 88, 95, 125, 141, 143, 155, 174, 182, 184, 185, 194, 268, 71, 156, 519, 245, 21412, 16, 45, 51, 70, 73, 80, 119, 263, 360, 372 , 400, 406, 460, 75, 76, 107, 249, 314, 379, 385, 284<0.600211, 560, 232, 25353, 59, 304≥0.600148, 165, 291, 142, 159, 215, 137, 196, 209344,234

a：基于疫苗株B/Washington/02/2019的基因序列

與2019年和2021年疫苗株HA基因比較，廣東2020年毒株呈Bv.1a.3株系特征，2021年毒株主要呈Bv.1a.3a.2株系特征，但變異幅度更大。WHO已于2021年9月更換疫苗組Bv毒株為B/Austria/1359417 /2021，與該疫苗株比較，2021年廣東株在表位和RBS區(qū)域變異包括HQ/N、RG和PQ。以疫苗株B/Washington/02/2019的NA基因為基準，2021年廣東毒株NA基因5個氨基酸(DN、NS、GE/R、VI和KE)發(fā)生明顯變異(50.0%～57.7%)。此變異幅度既超越疫苗株B/Austria/135941 7/2021 (2021-10 -09，僅KE)，也超越2021年上半年的北京毒株B/Beijing/Chaoyang/12099/2021(2021-08-31，僅DN、NS和GE)。

10個HA和4個NA基因潛在糖基化位點，經(jīng)分析均無明顯變異趨勢。NA基因已知藥物敏感位點未發(fā)現(xiàn)變異?；虬被嵛稽c的熵值反映該位點變異頻率。本研究中，50株毒株的HA和NA分別存在9個(148/165/291/142/159/215/137/196/209)和2個(344/234)易突變位點。

由于流感病毒缺乏RNA聚合酶校對功能，HA和NA基因易發(fā)生點變異，常使用錯義替代與同義替代的比值(d/d)評估氨基酸位點所受的自然選擇壓力。當d/d>1時，表示該位點為正向選擇位點；d/d=1時，該位點為中性進化不受選擇；d/d<1時，則表示該位點為負向選擇位點。本研究中，50株Bv經(jīng)SLAC、FEL和FUBAR 3種方法均篩選出HA和NA基因存在負向選擇位點，分別位于73，138，437和497位點，及179，321和335位點。此次篩選出的負向選擇位點，提示乙型流感病毒Bv毒株HA和NA基因在廣東地區(qū)的自主變異進化明顯，已超越免疫壓力因素的作用。

在人類流感病原體中，甲型流感病毒(H1N1、H3N2)的HA/NA基因表現(xiàn)變異頻繁，通常存在基因正向選擇位點。此次廣東Bv毒株出現(xiàn)多個氨基酸的負向選擇位點，在流行病學和基因進化中的意義有待于進一步探討。然而，結合流感疫情現(xiàn)狀，同時關聯(lián)核苷酸/氨基酸的同源性比較、抗原表位的變異、負向選擇位點篩選，可以推斷廣東乙型流感Bv毒株具有引發(fā)流感局部/洲際疫情的流行病學意義?？傊?，本研究提示，①Bv毒株分子(HA等)變異是導致廣東2020-2021年流感局部暴發(fā)的原因；②2021年下半年的流感進一步變異，可能引起2022年Bv毒株局部流行；③盡管WHO的2021年9月推薦的疫苗株依然有效，但廣東2021年Bv毒株的變異，提示W(wǎng)HO應考慮更新疫苗株的可能性。