突觸融合蛋白17改善Aβ31-35誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡

王 寧，周秀雅，何星鴻，張立飛，李朋佳，師 姝，王 麗,2，王曉暉,2

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院：病理教研室1，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心2

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以認(rèn)知和記憶功能損害為主的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著老齡化社會(huì)的到來，AD的發(fā)病率逐年上升并隨著年齡的增長呈指數(shù)增加。AD的病理特點(diǎn)表現(xiàn)為神經(jīng)元胞外老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及海馬等腦區(qū)神經(jīng)元大量丟失，最終導(dǎo)致與海馬區(qū)相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能減弱和認(rèn)知功能障礙。β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)毒性學(xué)說是AD發(fā)病的主流學(xué)說。Aβ由β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶水解作用而產(chǎn)生的含有39～43個(gè)氨基酸的多肽，由細(xì)胞分泌，在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積后具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用，可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡。

研究發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)存在大量的自噬體和溶酶體，自噬體和溶酶體的增加很大程度上是由自噬水平降低引起的。自噬是指吞噬自身受損蛋白或衰老細(xì)胞器使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程。隨著AD病情的進(jìn)展，自噬體逐漸增多，自噬體和溶酶體融合受限，最終引起腦內(nèi)大量神經(jīng)細(xì)胞丟失和死亡。因此，改善自噬體和溶酶體融合障礙對逆轉(zhuǎn)AD尤為重要。突觸融合蛋白17(syntaxin17，STX17)是自噬體和溶酶體融合過程中的關(guān)鍵蛋白。在自噬過程中，STX17蛋白招募SNAP29蛋白和VAMP8蛋白形成STX17-SNAP29-VAMP8復(fù)合體，介導(dǎo)自噬體與溶酶體的融合。然而，STX17是否可以改善Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡目前尚不清楚。因此，本研究探討Aβ31-35對小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中STX17表達(dá)和自噬的影響，并觀察過表達(dá)STX17是否能逆轉(zhuǎn)Aβ31-35所致小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡和自噬異常。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠，質(zhì)量18～25 g，飼養(yǎng)環(huán)境適宜且自由飲食。本研究涉及動(dòng)物的所有程序均得到山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，使用過程符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)定。HT22小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系購自廣州吉尼歐生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

Aβ31-35試劑(貨號(hào)：ab120974)、LC3抗體(貨號(hào)：ab48394)和P62抗體(貨號(hào)：ab56416)購自英國Abcam公司；Cell Counting Kit-8試劑盒(貨號(hào)：CK04)購自日本Dojindo公司；STX17抗體(貨號(hào)：17815-1-P)購自美國Proteintech公司；LV-OE STX17購自中國吉?jiǎng)P公司。

CO恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(貨號(hào)：HERAcell 150i)購自美國Thermo公司；酶聯(lián)免疫檢測儀(貨號(hào)：SMP500-071 47-HLXU)購自美國SoftMax公司；PCR擴(kuò)增儀(貨號(hào)：MX3005P)購自美國Stratagene公司；凝膠成像系統(tǒng)(貨號(hào)：BioSpectrum 810)購自美國UVP公司，倒置熒光顯微鏡(貨號(hào)：IX51)購自日本Olympus公司。

1.3 WGCNA分析和關(guān)鍵基因篩選

使用R語言WGCNA包對GSE 111737數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，該數(shù)據(jù)含7例AD患者和6例健康人群，參考GPL21810平臺(tái)的注釋信息將探針轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因符號(hào)。通過WGCNA包中的“pickSoftThreshold”函數(shù)獲得相鄰函數(shù)加權(quán)參數(shù)的最優(yōu)值，將其作為軟閾值。構(gòu)建鄰接矩陣探索基因的內(nèi)在聯(lián)系，利用拓?fù)渲丿B矩陣(TOM)相似性函數(shù)將鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為TOM矩陣?；趧?dòng)態(tài)剪切樹將基因分為不同模塊，并計(jì)算模塊臨床特征的相關(guān)性，從中選擇與阿爾茨海默病相關(guān)程度最高的模塊并對該模塊中的基因進(jìn)行后續(xù)分析。通過WGCNA分析篩選出來的模塊基因分別與自噬基因庫和KEGG篩選出的SNARE家族基因取交集。

1.4 小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞培養(yǎng)

將-80 ℃取出裝有HT22神經(jīng)細(xì)胞的凍存管立即放入37 ℃水浴鍋，快速晃動(dòng)凍存管使其融解，1 000 r/min離心5 min，棄上清后添加新的完全培養(yǎng)基并吹打混勻，將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶并補(bǔ)加適量的完全培養(yǎng)基，“8”字晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻；使用含EDTA的胰酶對生長狀態(tài)良好的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行消化，從而制備成細(xì)胞懸液，以2 ×10/孔接種至6孔板，次日觀察細(xì)胞生長情況，待匯合度達(dá)70%進(jìn)行干預(yù)；當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代處理；部分細(xì)胞進(jìn)行凍存處理，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為對照組(正常培養(yǎng))和Aβ31-35組(5 μmol/L Aβ31-35處理)。

1.5 小鼠海馬內(nèi)注射給藥

使用5%水合氯醛對小鼠腹腔進(jìn)行注射麻醉，將頭部固定在三維腦力體定位儀，使用消毒后的剪刀在小鼠頭部剪開約1.5 cm的切口；定位海馬組織的位置：前囟后2 mm，中線兩側(cè)旁開1.8 mm，深度1.8 mm；進(jìn)行海馬內(nèi)注射。實(shí)驗(yàn)分為對照組和Aβ31-35處理組，Aβ31-35組給予Aβ31-35(1 g/L，750 nmol/kg，雙側(cè)海馬注射共約8.2 μL)，對照組注射等量的高壓三蒸水。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

將對數(shù)生長期的細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液后接種到96孔板上，次日更換新的完全培養(yǎng)基并進(jìn)行藥物干預(yù)，藥物處理24 h后，每孔各加入10 μL CCK-8溶液并孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度值[

D

(450)]并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)算公式如下。細(xì)胞存活率=[實(shí)驗(yàn)組

D

(450)值-空白對照組

D

(450)值]/[陰性對照組

D

(450)值-空白對照組

D

(450)值]×100%

1.7 Western blot檢測

使用配制好的裂解液(RiPa∶PMSF=100∶1)提取組織和細(xì)胞的總蛋白，BCA法測蛋白的濃度，對各組溶液進(jìn)行定量處理，之后放在100 ℃金屬浴加熱10 min；配制5%的濃縮膠和12%的分離膠，按順序依次將Marker和蛋白樣品加入SDS-PAGE膠樣孔內(nèi)，先設(shè)置80 V的電壓待跑出一定量Marker后轉(zhuǎn)為120 V；使用甲醇激活PVDF膜后開始進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，再使用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉(常溫，2 h)，封閉結(jié)束后使用TBST洗膜三次加入相應(yīng)一抗進(jìn)行孵育，孵育條件為4 ℃冰箱過夜，次日繼續(xù)洗膜3次，加入相應(yīng)二抗，在4 ℃孵育2 h后洗膜3次；吸取適量的Super ECL Plus超敏發(fā)光液滴加到PVDF膜蛋白條帶上，使用BioSpectrum 810 Imaging System系統(tǒng)采集圖像，利用凝膠成像系統(tǒng)曝光并使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.8 慢病毒感染及感染細(xì)胞的篩選

HT22細(xì)胞制備成懸液后以1×10/孔接種于96孔板上，設(shè)置梯度最佳感染復(fù)數(shù)MOI為5、10、20、30，加入病毒體積=細(xì)胞計(jì)數(shù)×2×MOI/病毒滴度，根據(jù)熒光表達(dá)情況選擇感染效率最佳MOI。使用1/2小體積感染法：在倒置熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長狀態(tài)和密度，密度達(dá)60%時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，加PBS緩沖液沖洗一次并更換新的完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入最佳MOI值所對應(yīng)的慢病毒量和1/2體積完全培養(yǎng)基和助轉(zhuǎn)劑，待感染4 h后再加入另一半新鮮培養(yǎng)基和助轉(zhuǎn)劑，感染16 h后，將含病毒的培養(yǎng)基換為普通完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為4組：空病毒組(LV-NC)、空病毒+Aβ31-35組(LV-NC+Aβ31-35)、慢病毒過表達(dá)STX17組(LV-OE STX17)、慢病毒過表達(dá)STX17+Aβ31-35組(LV-OE STX17+Aβ31-35)。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR，RT-PCR)檢測

在各組細(xì)胞加入500 μL RNAisoPlus，冰上充分裂解后收集于EP管中，進(jìn)行總RNA提取、溶解及濃度檢測；進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR上游引物：5′-GGAAACCTTAGAAGCGGACTT-3′，下游引物：5′-TCAACATTCACAGCGGCAC-3′。所有結(jié)果與對照組GAPDH的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)化，采用2法對目的基因mRNA水平進(jìn)行相對定量。實(shí)驗(yàn)分為3組：普通對照組(Control)、普通對照組+空載組(LV-NC)、普通對照組+載體組(LV-OESTX17)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用完全隨機(jī)兩獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異采用最小顯著法(LSD)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析AD患者中STX17表達(dá)水平

通過WGCNA包的算法，根據(jù)無尺度網(wǎng)絡(luò)分布擬合，選取β=8作為軟閾值(圖1A)，并計(jì)算基因間的相關(guān)性矩陣和TOM，使用TOM構(gòu)建基因間分層聚類樹，合并相似模塊后得到40個(gè)模塊(圖1B)，其中黑色模塊和淺橙色模塊與AD的相關(guān)性最高(圖1C)。因此黑色模塊和淺橙色模塊可以作為與AD密切相關(guān)的樞紐模塊。而后將兩個(gè)模塊的基因分別與自噬基因庫和SNARE家族基因取交集，僅有黑色模塊提取出STX17(圖1D、E)。

A：基于GSE111737表達(dá)數(shù)據(jù)的軟閾值確定；B：基因表達(dá)的聚類分析 確定不同的共表達(dá)數(shù)據(jù)模塊；C：基因模塊與AD之間的相關(guān)性熱圖；D：黑色模塊與自噬基因庫和SNARE家族基因庫取交集；E：淺橙色模塊與自噬基因庫和SNARE家族基因庫取交集

2.2 Aβ31-35可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠海馬組織和HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞的STX17蛋白表達(dá)下調(diào)

與對照組比較，海馬內(nèi)注射Aβ31-35誘導(dǎo)了C57BL/6小鼠海馬組織STX17蛋白表達(dá)(0.72±0.28)顯著降低(

P

<0.05，圖2A)。進(jìn)一步離體研究發(fā)現(xiàn)，Aβ31-35作用后，HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞STX17蛋白表達(dá)(0.78±0.16)也較對照組顯著降低(

P

<0.05，圖2B)。

a：P<0.05，與對照組比較

2.3 Aβ31-35導(dǎo)致HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡

5 μmol/L Aβ31-35作用24 h后，HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率為(81.81±11.65)%，較對照組顯著降低(

P

<0.05，圖3)，表明Aβ31-35對海馬神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。

a：P<0.05，與對照組比較

2.4 Aβ31-35誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、P62蛋白表達(dá)升高

經(jīng)海馬內(nèi)注射Aβ31-35后，小鼠海馬組織LC3Ⅱ的表達(dá)(1.23±0.22)較對照組顯著升高(

P

<0.05)，P62的表達(dá)(1.22±0.16)較對照組顯著升高(

P

<0.05)，見圖4A。同樣的，Aβ31-35作用HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞后，細(xì)胞中LC3Ⅱ的表達(dá)較對照組顯著升高(

P

<0.05)，P62的表達(dá)較對照組顯著升高(

P

<0.05)，見圖4B。

a：P<0.05，與對照組比較

2.5 過表達(dá)STX17逆轉(zhuǎn)Aβ31-35誘導(dǎo)的HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率降低

上海吉?jiǎng)P公司協(xié)助構(gòu)建慢過表達(dá)STX17病毒載體(OE STX17，圖5A)，設(shè)置MOI值，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染情況，結(jié)果顯示MOI=20時(shí)熒光強(qiáng)度較高(圖5B)，故選用MOI=20用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；與對照組比較，慢病毒OE STX17感染使HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞STX17 mRNA表達(dá)水平顯著升高(

P

<0.05，圖5C)。STX17過表達(dá)的HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率為(101.91±13.81)%，較Aβ31-35處理組(79.21±8.75)%顯著上升(

P

<0.05，圖6)，說明過表達(dá)STX17可以逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)的HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率降低。

A：上海吉?jiǎng)P公司提供的構(gòu)建過表達(dá)慢病毒載體；B：MOI為5、10、20、30的GFP熒光圖；C：RT-PCR檢測LV-OE STX17 mRNA表達(dá)情況 1：Control；2：LV-NC組; 3：LV-OESTX17；a：P<0.05，與Control和LV-NC組比較

1：LV-NC組；2：LV-NC+Aβ31-35組；3：LV-OE STX17組；4：LV-OE STX17+Aβ31-35組；a：P<0.05，與LV-NC組比較，b：P<0.05，與LV-NC+Aβ31-35組比較

2.6 過表達(dá)STX17逆轉(zhuǎn)Aβ31-35誘導(dǎo)的HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3Ⅱ和P62蛋白升高

慢病毒感染HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞過表達(dá)STX17后，LC3 Ⅱ 蛋白表達(dá)(0.89±0.23)較Aβ31-35處理組(1.30±0.25)顯著降低(

P

<0.05，圖7A)，P62蛋白表達(dá)(0.97±0.29)較Aβ31-35處理組(1.34±0.26)顯著降低(

P

<0.05，圖7B)，表明過表達(dá)STX17后拮抗了Aβ31-35誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3 Ⅱ 和P62蛋白表達(dá)升高。

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)AD患者海馬組織中STX17表達(dá)水平異常，Aβ31-35導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率下降，誘導(dǎo)了STX17蛋白表達(dá)下降和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、P62表達(dá)升高，使用慢病毒感染HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞來過表達(dá)STX17后，改善了Aβ31-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率降低和逆轉(zhuǎn)了LC3Ⅱ、P62蛋白表達(dá)升高。

AD發(fā)病機(jī)制不清，目前有多種學(xué)說，例如Aβ毒性學(xué)說、Tau蛋白過度磷酸化學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、炎癥學(xué)說和膽堿能損傷學(xué)說等，進(jìn)一步揭示AD發(fā)病機(jī)制和尋找潛在干預(yù)靶點(diǎn)尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，AD發(fā)生過程中伴有自噬功能障礙，AD患者以及AD小鼠模型大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元內(nèi)存在大量的自噬泡的異常聚集，提示AD過程中存在自噬體和溶酶體融合障礙。在自噬過程中，STX17可與囊泡相關(guān)蛋白8(VAMP8)、可溶性NSF黏附蛋白29(SNAP29)形成SNARE復(fù)合體共同介導(dǎo)自噬小體與溶酶體的融合，且有研究表明AD患者死后腦樣本中SNARE復(fù)合體水平降低，提示SNARE蛋白復(fù)合體與AD的發(fā)生或發(fā)展相關(guān)。本研究采用WGCNA分析GSE 111737數(shù)據(jù)集獲得40個(gè)與AD臨床特征相關(guān)的模塊，其中以salmon和black模塊的相關(guān)性最為顯著，而后將自噬基因庫和SNARE家族基因與salmon模塊和black模塊中的基因取交集，最終得到1個(gè)AD發(fā)病關(guān)鍵基因——STX17基因。

1：LV-NC組；2：LV-NC+Aβ31-35組；3：LV-OE STX17組；4：LV-OE STX17+Aβ31-35組；a：P<0.05，與LV-NC組比較，b：P<0.05，與LV-NC+Aβ31-35組比較

STX17蛋白是自噬體和溶酶體融合的關(guān)鍵蛋白，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)。STX17蛋白具有特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，有助于其向自噬體轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)位到自噬體的STX17，募集細(xì)胞質(zhì)中SNAP29與VAMP8并結(jié)合形成STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合物，介導(dǎo)自噬體與溶酶體的融合。當(dāng)自噬體和溶酶體融合發(fā)生障礙時(shí)就會(huì)導(dǎo)致自噬流受阻，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器和異常蛋白質(zhì)聚集。通常，評價(jià)自噬功能狀態(tài)主要有2個(gè)指標(biāo)，分別是LC3和P62。LC3是自噬小體膜上特征性標(biāo)記，自噬形成時(shí)，胞漿型LC3(即LC3-1)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?即LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可在一定程度上評估自噬水平的高低。因此，LC3蛋白的表達(dá)高低在某種程度上可以反映自噬小體形成的活躍程度。P62作為自噬選擇性底物，在自噬功能正常即自噬流通暢的情況可以被降解，當(dāng)LC3蛋白升高，P62蛋白水平也升高的情況下提示自噬流受阻，反之，當(dāng)P62蛋白水平降低時(shí)提示自噬流通暢，自噬功能正常。STX17的耗竭阻斷了STX17-VAMP8-SNAP29復(fù)合物的形成，并損害了溶酶體和自噬體的融合，導(dǎo)致自噬體的積累，自噬流受阻，進(jìn)而導(dǎo)致自噬標(biāo)記物L(fēng)C3蛋白和底物P62蛋白表達(dá)水平升高。研究證實(shí)，在AD模型小鼠腦內(nèi)STX17蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Aβ31-35的處理后，在體和離體水平小鼠海馬神經(jīng)組織和細(xì)胞STX17蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ、P62表達(dá)升高。提示STX17蛋白在阿爾茨海默病的發(fā)展進(jìn)程中起重要作用。

本研究進(jìn)一步證實(shí)STX17蛋白表達(dá)異常是否是神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因。如前文所述，STX17蛋白在調(diào)控自噬過程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)自噬過程異常時(shí)能導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，一種程序性細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，STX17可以通過增強(qiáng)自噬通量和減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性神經(jīng)元凋亡來改善缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。STX17過表達(dá)恢復(fù)了自噬通量，并且緩解了柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的溶酶體功能障礙，并減少了HeLa細(xì)胞中柯薩奇病毒B3感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究采用慢病毒感染HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞來過表達(dá)STX17基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示LV-OE STX17后改善了Aβ31-35導(dǎo)致的細(xì)胞存活率降低?？梢?，STX17可以有效逆轉(zhuǎn)AD神經(jīng)細(xì)胞死亡，并與細(xì)胞自噬功能密切相關(guān)，早期合理調(diào)控STX17蛋白水平對于減少AD神經(jīng)細(xì)胞死亡意義重大。