中線丘腦各核團(tuán)-中央杏仁核通路在覺醒/睡眠周期中活動(dòng)模式的研究

趙娟娟，劉程煜，孫雪琪，陳夢(mèng)婷，黃慶齡，張 婷，任栓成，高 東，唐 玲

401331 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院神經(jīng)科1；400050 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院神經(jīng)科2；400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室3；400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)心理科4

中線丘腦(midline thalamus)是覺醒上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)的關(guān)鍵區(qū)域，位于動(dòng)物丘腦復(fù)合體的中間，主要包括丘腦室旁核(paraventricular thalamic nucleus，PVT)、丘腦中央內(nèi)側(cè)核(central medial thalamic nucleus，CM)、菱形核(rhomboid thalamic nucleus，Rh)與連接核(reuniens thalamic nucleus，Re)。PVT位于中線丘腦背側(cè)，緊鄰背側(cè)第三腦室。PVT神經(jīng)元活動(dòng)在睡眠向覺醒轉(zhuǎn)換前升高，誘導(dǎo)覺醒發(fā)生，并且在覺醒期表現(xiàn)出高放電活動(dòng)。在饑餓狀態(tài)下，PVT神經(jīng)元放電頻率進(jìn)一步增加，介導(dǎo)饑餓誘導(dǎo)的覺醒。CM位于PVT下方，CM神經(jīng)元在覺醒期活躍，光遺傳學(xué)技術(shù)激活CM誘發(fā)快速的睡眠向覺醒轉(zhuǎn)換。此外，CM神經(jīng)元自發(fā)放電有助于誘導(dǎo)NREM睡眠期皮層慢波振蕩的上升相及其全腦同步化。Rh/Re靠近下丘腦及腹側(cè)第三腦室，SALAY等發(fā)現(xiàn)Rh/Re可被視覺相關(guān)危險(xiǎn)信號(hào)強(qiáng)烈激活，明顯提高覺醒水平，以幫助動(dòng)物逃避危險(xiǎn)。因此，中線丘腦神經(jīng)元在覺醒期活躍的活動(dòng)模式為其調(diào)控覺醒及其依賴的相關(guān)行為提供了重要電生理基礎(chǔ)。中線丘腦向前腦發(fā)出廣泛投射，如前額葉皮層(medial prefrontal cortex，mPFC)、伏隔核(nucleus accumbens，NAc)、杏仁核[Amygdala，包括中央杏仁核(central amygdala，CeA)和基底外側(cè)杏仁核(basolateral amygdala，BLA) ]和終紋床核(bed nucleus of the stria terminalis，BNST等。中線丘腦與上述腦區(qū)形成的通路參與覺醒及相關(guān)行為的調(diào)控。杏仁核作為中線丘腦的重要下游靶區(qū)之一，是情緒信息處理的關(guān)鍵神經(jīng)核團(tuán)。中線丘腦-杏仁核通路參與調(diào)節(jié)覺醒依賴的一系列行為，如恐懼應(yīng)激、焦慮、抑郁、神經(jīng)性疼痛信號(hào)傳導(dǎo)和防御行為等。例如，PVT-CeA通路在恐懼條件反射中聯(lián)系增強(qiáng)，促進(jìn)恐懼記憶的形成和表達(dá)。Rh/Re-BLA通路激活誘導(dǎo)小鼠凍結(jié)行為增加以避免被捕食者發(fā)現(xiàn)。但是，中線丘腦各核團(tuán)-中央杏仁核通路在自然覺醒/睡眠周期中的神經(jīng)元活動(dòng)模式尚未明確。因此，揭示中線丘腦-杏仁核通路在覺醒/睡眠周期中的活動(dòng)模式有助于更好的理解這些通路參與覺醒依賴行為調(diào)節(jié)的方式和規(guī)律。

為此，本研究首先通過(guò)逆行神經(jīng)示蹤技術(shù)，系統(tǒng)探索中線丘腦不同神經(jīng)核團(tuán)與杏仁核的聯(lián)系特征，為中線丘腦-杏仁核通路研究提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)；進(jìn)而利用光纖鈣信號(hào)記錄和腦電圖(electroencephalogram，EEG)-肌電圖(electromyogram，EMG)記錄技術(shù)結(jié)合觀察中線丘腦-中央杏仁核通路在覺醒/睡眠中的活動(dòng)模式，為中線丘腦-杏仁核通路調(diào)控覺醒的作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用小鼠均為8～12周齡，體質(zhì)量20～25 g的SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗交替(6：00-18：00照明)的晝夜節(jié)律控制箱中，可自由飲食和活動(dòng)，環(huán)境溫度控制在(22±1)℃。所有實(shí)驗(yàn)操作和小鼠倫理嚴(yán)格遵守相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理規(guī)范，并盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛苦和使用量。

1.2 方法

1.2.1 逆行神經(jīng)示蹤實(shí)驗(yàn) 在逆行神經(jīng)示蹤實(shí)驗(yàn)中將同一批10只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，每組5只，分別在杏仁核的兩個(gè)亞區(qū)CeA和BLA注射100 nL逆行示蹤熒光微粒RetroBeads(R180-1000, Lumaflouor, USA)，感染3～7 d后，觀察形態(tài)。

立體定位注射操作流程參考課題組已發(fā)表的工作。小鼠在麻醉誘導(dǎo)盒中以濃度2.0%，流速0.6 mL/min科研用異氟烷(瑞沃德公司，中國(guó))氣體誘導(dǎo)麻醉5 min，隨后將小鼠頭部固定于單臂數(shù)顯腦立體定位儀(瑞沃德公司，中國(guó))上，將麻醉濃度調(diào)整為1.0%，流速調(diào)整為0.5 mL/min，且手術(shù)過(guò)程中維持此濃度。用紅霉素眼膏保護(hù)小鼠眼睛，防止燈光長(zhǎng)時(shí)間直接照射致盲。剃除小鼠頭頂毛發(fā)后，用碘伏棉球消毒小鼠頭皮，用眼科剪沿中線剪開小鼠頭皮，暴露顱骨。在顯微鏡下以前囟點(diǎn)為原點(diǎn)調(diào)整小鼠頭部，使小鼠顱骨與水平面平行。參照Franklin & Paxinos 小鼠腦圖譜以及相關(guān)文獻(xiàn)，確定各腦區(qū)病毒注射的位置坐標(biāo)，分別對(duì)CeA(前囟后1.20 mm，中線旁開2.80 mm，腦膜下深度4.00 mm)、BLA(前囟后1.20 mm，中線旁開3.35 mm，腦膜下深度3.65 mm)進(jìn)行立體定位。使用玻璃微電極(3-000-203-G/X，Drummond Scientific 公司，美國(guó))抽取100 nL RetroBeads。按照坐標(biāo)將玻璃微電極緩慢下降至相應(yīng)位置并停針5 min后，以20 nL/min的速度推注病毒，注射完成后停留10 min，等待病毒或示蹤劑擴(kuò)散，隨后緩慢升起玻璃電極。消毒傷口，縫合頭皮，將小鼠放置在保溫墊上，待其恢復(fù)清醒后放入水糧充足的飼養(yǎng)籠中。

1.2.2 腦肌電記錄與分析 將麻醉的小鼠固定在立體定位儀上，剪開頭皮，暴露顱骨，并調(diào)平(過(guò)程同病毒注射)；在小鼠顱骨表面開4個(gè)直徑0.80 mm的骨窗，坐標(biāo)分別為前囟點(diǎn)前1.50 mm，左右旁開1.50 mm與前囟點(diǎn)后3.00 mm，左右旁開2.00 mm；將EEG-EMG電極的螺釘按順時(shí)針?lè)较蛐M(jìn)骨窗內(nèi)，螺釘剛好接觸到腦組織表面即可，以接收小鼠腦電信號(hào)，將額外一顆螺釘旋進(jìn)第4個(gè)骨窗內(nèi)；用精細(xì)鑷將焊有錫球的3根導(dǎo)線穿進(jìn)小鼠頸部肌肉內(nèi)，并保證一定的距離，使其互不形成串聯(lián)電路，以接受小鼠肌電信號(hào)。牙科水和牙科粉混合，將EEG-EMG電極固定在小鼠顱骨上，完全覆蓋電極的導(dǎo)線，并避免金屬暴露部分互相接觸。待牙科水泥干透后，將小鼠放置到加熱墊上保溫并等待其恢復(fù)，小鼠完全清醒后放回水糧充足的飼養(yǎng)籠中，做好標(biāo)記。

小鼠手術(shù)7 d后，將小鼠通過(guò)腦肌電電極接入恒溫恒濕并控制晝夜節(jié)律(ZT0=6：00, ZT12=18：00)的隔音睡眠覺醒記錄箱中，用日本Kissei Comtec公司的Vital Recorder軟件記錄腦電/肌電信號(hào)(EEG: 0.3～30.0 Hz, EMG: 10～1 000 Hz，采樣頻率:512 Hz)并保存。將數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，通過(guò)SleepSign for Animals睡眠分析軟件將小鼠的睡眠/覺醒狀態(tài)自動(dòng)評(píng)分，并根據(jù)小鼠睡眠覺醒狀態(tài)的定義手工修正。根據(jù)腦電/肌電圖的頻譜特征，將小鼠狀態(tài)分為清醒期(Wake)、非快速眼動(dòng)(non-rapid eye movement，NREM)睡眠期和快速眼動(dòng)(rapid eye movement，REM)睡眠期。Wake被定義為不同步、低振幅的腦電圖節(jié)律和伴有相位爆發(fā)的肌電活動(dòng)升高。NREM睡眠被定義為同步、高振幅和低頻率(0.5～4.0 Hz, delta)的腦電圖活動(dòng)和較低的肌電活動(dòng)，與覺醒相比沒(méi)有相位爆發(fā)。REM睡眠被定義為包含明顯的Theta (4～10 Hz)節(jié)律，幾乎沒(méi)有肌電活動(dòng)。利用快速傅里葉變換對(duì)0～25 Hz頻率范圍內(nèi)連續(xù)4 s的原始腦肌電數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，分析腦電活動(dòng)的增量功率。

1.2.3 光纖記錄實(shí)驗(yàn) 為了觀察特異性投射到中央杏仁核的中線丘腦神經(jīng)元在覺醒/睡眠中的活動(dòng)模式，將同一批15只小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，在CeA注射逆行標(biāo)記病毒AAV2/retro-Syn-Cre 100 nL，并分別在PVT、CM、Rh/Re注射AAV-EF1α-DIO-GCaMp7b 100 nL，病毒注射及手術(shù)方法與過(guò)程同前。病毒感染3～4周后分別在PVT上方(前囟后1.20 mm，中線旁開0 mm，腦膜下深度2.35 mm)、CM上方(前囟后1.20 mm，中線旁開0 mm，腦膜下深度3.00mm)、Rh/Re上方(前囟后1.20 mm，中線旁開0 mm，腦膜下深度3.80 mm)埋置光纖，同時(shí)埋置EEG-EMG電極。手術(shù)恢復(fù)7 d后，在光照期記錄神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)的變化，并同步記錄小鼠腦肌電信號(hào)。使用Inper Technology提供的腳本以40 Hz記錄光纖鈣信號(hào)，光纖鈣信號(hào)的變化由ΔF/F=(F-F0)/F0公式計(jì)算，使用最小二乘回歸法從488 nm信號(hào)中扣除410 nm信號(hào)，使用多項(xiàng)式擬合校正來(lái)減小長(zhǎng)期記錄造成的漂白效應(yīng)。

1.2.4 灌注與取材 將病毒感染時(shí)間充分后的小鼠和記錄結(jié)束的小鼠用37℃的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)(ZLI-9061,中杉金橋公司，中國(guó))和4 ℃的4%多聚甲醛(158127，Sigma公司，美國(guó))溶液進(jìn)行心臟灌流，隨后取出完整的腦組織，于4 ℃的4%多聚甲醛溶液中固定4～6 h后轉(zhuǎn)移至30%的蔗糖(生工公司，中國(guó))溶液中脫水。

1.2.5 腦片制備與形態(tài)分析 脫水完成后的腦組織沉至管底，將腦組織取出，用濾紙吸去水分，沿冠狀切面修整腦組織塊。用冰凍切片機(jī)(CM1900，Leica公司，美國(guó))在-20 ℃下連續(xù)切片，切片厚度為30 μm。將切下的腦片每120 μm取1張，在載玻片上連續(xù)貼片，待其自然風(fēng)干后，用含DAPI的防熒光淬滅封片劑(F6057，Sigma公司，美國(guó))進(jìn)行封片。將制作好的腦片標(biāo)本放入標(biāo)本盒中并保存在4 ℃冰箱中。腦片標(biāo)本用數(shù)字切片工作站—OlympusVS120顯微鏡掃描并保存圖片，在OLYVIA軟件中進(jìn)行可視化調(diào)整及圖像的保存和輸出。利用激光共聚焦顯微鏡Zeiss LSM880拍攝高分辨率圖像，并在Zen 2012成像系統(tǒng)軟件中調(diào)整圖像對(duì)比度，完成逆行示蹤中線丘腦中RetroBeads陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)。通過(guò)形態(tài)學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)光纖記錄實(shí)驗(yàn)中2只PVT-CeA組小鼠病毒感染狀況不良，數(shù)據(jù)被剔除；CM-CeA組1只小鼠病毒感染狀況不良，數(shù)據(jù)被剔除。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析；用GraphPad Prism 8.0或SigmaPlot 12.5繪制統(tǒng)計(jì)圖。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。兩組間比較使用配對(duì)/非配對(duì)

t

檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布使用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)；三組數(shù)據(jù)比較時(shí)使用單因素方差分析，若方差不齊，則使用Kruskal-Wallis單因素秩方差分析。

P

<0.05差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 逆行示蹤鑒定投射至杏仁核的中線丘腦神經(jīng)元分布特征

為了比較中線丘腦神經(jīng)核團(tuán)與杏仁核聯(lián)系的密切程度，本研究分別在杏仁核的兩個(gè)亞區(qū)CeA和BLA注射逆行示蹤熒光微粒RetroBeads(圖1A)，發(fā)現(xiàn)中線丘腦的3個(gè)腦區(qū)PVT、CM、Rh/Re內(nèi)RetroBeads標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量和分布情況差別較大(圖1B～D左)。統(tǒng)計(jì)CeA、BLA逆行追蹤到中線丘腦的神經(jīng)元總數(shù)量，發(fā)現(xiàn)投射至CeA的PVT神經(jīng)元顯著多于投射至BLA的PVT神經(jīng)元(

P

<0.01)，PVT投射至CeA和BLA的神經(jīng)元總數(shù)量分別為(848±144)個(gè)和(376±34)個(gè)(圖1B右)；投射至CeA的CM神經(jīng)元與投射至BLA的CM神經(jīng)元總數(shù)量相似(

P

=0.588)，分別為(186±86)個(gè)和(114±56)個(gè)(圖1C右)；投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元較投射至BLA的Rh/Re神經(jīng)元總數(shù)量多，神經(jīng)元總數(shù)量分別為(258±24)個(gè)和(92±34)個(gè)(圖1D)。其中，在中線丘腦投射到CeA的神經(jīng)元中PVT神經(jīng)元占73.81% ，CM神經(jīng)元占8.51% ，Rh/Re神經(jīng)元占17.68% ；在中線丘腦投射到BLA的神經(jīng)元中PVT神經(jīng)元占66.34% ，CM神經(jīng)元占23.55% ，Rh/Re神經(jīng)元占10.11%(圖1E)。進(jìn)一步對(duì)投射至CeA和BLA的中線丘腦3個(gè)神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)RetroBeads陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)行比較(圖1F、G)，發(fā)現(xiàn)投射至CeA和BLA的中線丘腦神經(jīng)元主要分布在PVT(

P

<0.001)；投射至BLA的中線丘腦神經(jīng)元在CM分布也較多(

P

<0.05)。以上結(jié)果表明中線丘腦神經(jīng)核團(tuán)中的PVT與杏仁核聯(lián)系較緊密，其中PVT與CeA的聯(lián)系最為緊密。

2.2 PVT-CeA通路在覺醒/睡眠周期中的活動(dòng)模式

為了監(jiān)測(cè)PVT-CeA通路在覺醒/睡眠周期中的神經(jīng)元活動(dòng)特征，首先在CeA注射逆行標(biāo)記病毒AAV2/retro-Syn-Cre，同時(shí)在PVT注射Cre依賴的病毒AAV-EF1α-DIO-GCaMp7b(圖2A)，標(biāo)記特異性投射至CeA的PVT神經(jīng)元。3～4周后在PVT上方埋置光纖，同時(shí)在顱骨表面埋置EEG-EMG電極(圖2B)。手術(shù)恢復(fù)1周后，記錄腦肌電信號(hào)和神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)。分析特異性投射至CeA的PVT神經(jīng)元在Wake期、NREM睡眠期、REM睡眠期的鈣信號(hào)活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)該群神經(jīng)元在Wake期的ΔF/F為(0.91±0.09)%，在NREM期的ΔF/F為(0.46±0.08)%，在REM期的ΔF/F為(0.27±0.05)%(圖2D)。說(shuō)明在Wake期該群神經(jīng)元明顯活躍，NREM期和REM期神經(jīng)元活動(dòng)水平較低(

P

<0.05)。隨后分析覺醒/睡眠狀態(tài)轉(zhuǎn)換時(shí)鈣信號(hào)的變化，發(fā)現(xiàn)在Wake期向NREM期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)降低(圖2E)；NREM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)明顯升高(圖2F)；REM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)升高(圖2G)；在NREM期向REM期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)呈下降趨勢(shì)(圖2H)。以上結(jié)果說(shuō)明PVT-CeA通路在覺醒期活躍。

A：杏仁核內(nèi)注射逆行示蹤熒光微粒RetroBeads示意圖以及注射位點(diǎn)CeA、BLA內(nèi)RetroBeads表達(dá)情況；B：投射至CeA和BLA的PVT RetroBeads陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較 (n=5) 非配對(duì)t檢驗(yàn)，b: P<0.01，與CeA組比較；C：投射至CeA和BLA的CM RetroBeads陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較 (n=5) 非配對(duì)t檢驗(yàn)；D：投射至CeA和BLA的Rh/Re RetroBeads陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較 (n=5) 非配對(duì)t檢驗(yàn)，b: P<0.01，與CeA組比較； E：上圖為投射至CeA的中線丘腦神經(jīng)元分布情況，下圖為投射至BLA的中線丘腦神經(jīng)元分布情況；F、G：投射至CeA、BLA的PVT、CM、Rh/Re RetroBeads陽(yáng)性神經(jīng)元總數(shù)量對(duì)比(n=5)單因素方差分析， a: P<0.05，c: P<0.001，3組間兩兩比較

A：PVT和CeA病毒注射示意圖；B:光纖及腦肌電電極埋置示意圖；C：PVT內(nèi)感染GCamp7b及光纖記錄典型代表圖；D：特異性投射至CeA的PVT神經(jīng)元在覺醒/睡眠各狀態(tài)下鈣信號(hào)活動(dòng)平均值 Kruskal-Wallis單因素秩方差分析，a：P<0.05 , 3組之間兩兩比較；E：Wake期向NREM期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的PVT神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較；F：NREM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的PVT神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較；G: REM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的PVT神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較；H：NREM期向REM期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的PVT神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 配對(duì)t檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較

2.3 CM-CeA通路在覺醒/睡眠周期中的活動(dòng)模式

為了觀察CM-CeA通路在覺醒/睡眠周期中的神經(jīng)元活動(dòng)特征，在CeA注射逆行標(biāo)記病毒AAV2/retro-Syn-Cre，同時(shí)在CM注射Cre依賴的病毒AAV-EF1α-DIO-GCaMp7b(圖3A)，標(biāo)記特異性投射至CeA的CM神經(jīng)元，并在病毒感染3～4周后在CM上方埋置光纖插芯用來(lái)記錄神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)，在顱骨表面埋置EEG-EMG電極記錄腦肌電信號(hào)(圖3B)。發(fā)現(xiàn)投射至CeA的CM神經(jīng)元在Wake期ΔF/F為(1.08±0.12)%，在NREM期ΔF/F為(0.58±0.07)%，在REM期ΔF/F為(0.89±0.12)%(圖3D)。表明該群神經(jīng)元在Wake期和REM期活躍，在NREM期活動(dòng)水平較低(

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<0.05)。分析覺醒/睡眠轉(zhuǎn)換期間的神經(jīng)元活動(dòng)變化，發(fā)現(xiàn)在Wake期向NREM期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)降低(圖3E)；NREM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)明顯升高(圖3F)；REM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)降低(圖3G)；在NREM期向REM期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)上升(圖3H)。以上結(jié)果表明CM-CeA通路在覺醒期和快速眼動(dòng)睡眠期活躍。

A：CM和CeA病毒注射示意圖；B:光纖及腦肌電電極埋置示意圖；C：CM內(nèi)感染GCamp7b及光纖記錄典型代表圖；D：特異性投射至CeA的CM神經(jīng)元在覺醒/睡眠各狀態(tài)下鈣信號(hào)活動(dòng)平均值 Kruskal-Wallis單因素秩方差分析， a: P<0.05，3組之間兩兩比較；E：Wake期向NREM期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的CM神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較；F：NREM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的CM神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較；G: REM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的CM神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 配對(duì)t檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60s比較；H：NREM期向REM期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的CM神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較

2.4 Rh/Re-CeA通路在覺醒/睡眠周期中的活動(dòng)模式

為了探索Rh/Re -CeA通路在覺醒/睡眠周期中的神經(jīng)元活動(dòng)特征，在CeA注射逆行標(biāo)記病毒AAV2/retro-Syn-Cre，同時(shí)在菱形核與連接核(Rh/Re)注射Cre依賴的病毒AAV-EF1α-DIO-GCaMp7b(圖4A)，標(biāo)記特異性投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元，并在病毒感染3～4周后在Rh/Re上方埋置光纖插芯用來(lái)記錄神經(jīng)元鈣活動(dòng)(圖4B)。在記錄腦肌電的同時(shí)記錄神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元在Wake期ΔF/F為(0.29±0.02)%，在NREM期ΔF/F為(0.12±0.01)%，在REM期ΔF/F為(0.24±0.01)%(圖4D)。證明該群神經(jīng)元在Wake期和REM期活躍，在NREM期活動(dòng)水平較低(

P

<0.05)。分析覺醒/睡眠轉(zhuǎn)換期間的神經(jīng)元活動(dòng)變化，發(fā)現(xiàn)在Wake期向NREM期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)降低(圖4E)；NREM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)明顯升高(圖4F)；REM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)降低(圖4G)；在NREM期向REM期轉(zhuǎn)換時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)上升(圖4H)。以上結(jié)果表明Rh/Re -CeA通路在覺醒期和快速眼動(dòng)睡眠期活躍。

2.5 不同中線丘腦-CeA通路在覺醒/睡眠周期中活動(dòng)模式差異性的比較

在對(duì)投射至CeA的中線丘腦各群神經(jīng)元的光纖記錄數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)不同神經(jīng)元在覺醒/睡眠周期中的活動(dòng)模式不同。在Wake期，投射至CeA的PVT和CM神經(jīng)元活動(dòng)水平較高；在NREM期投射至CeA的PVT和CM神經(jīng)元活動(dòng)水平比投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元活動(dòng)水平高；在REM期投射至CeA的CM神經(jīng)元活動(dòng)水平明顯高于PVT和Rh/Re神經(jīng)元活動(dòng)水平(圖5A)。以上結(jié)果表明在Wake期PVT-CeA通路和CM-CeA通路比較活躍，在REM期CM-CeA通路更加活躍。與投射至CeA的PVT神經(jīng)元和CM神經(jīng)元相比，投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元總體活動(dòng)水平較低，可能是由于投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元數(shù)量較少。

進(jìn)一步對(duì)3條通路在覺醒/睡眠轉(zhuǎn)換時(shí)神經(jīng)元的鈣信號(hào)變化模式進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在Wake期向NREM期轉(zhuǎn)換時(shí)，各群神經(jīng)元活動(dòng)均下降；在NREM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)，投射至CeA的PVT神經(jīng)元和CM神經(jīng)元活動(dòng)升高；在REM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)，投射至CeA的PVT神經(jīng)元活動(dòng)升高，投射至CeA的CM神經(jīng)元和Rh/Re神經(jīng)元活動(dòng)均下降，說(shuō)明PVT神經(jīng)元在Wake期比REM期的活動(dòng)更高，而CM和Rh/Re神經(jīng)元在REM期的活動(dòng)水平比Wake期更高；在NREM期向REM期轉(zhuǎn)換時(shí)，投射至CeA的PVT神經(jīng)元活動(dòng)下降，投射至CeA的CM神經(jīng)元和Rh/Re神經(jīng)元活動(dòng)均上升，且CM神經(jīng)元活動(dòng)升高更明顯(圖5B)。以上結(jié)果可以提示PVT-CeA通路在覺醒期更活躍；CM-CeA通路在覺醒期和快速眼動(dòng)睡眠期都活躍，且在快速眼動(dòng)睡眠期更活躍；Rh/Re-CeA通路整體活動(dòng)水平較低，但在快速眼動(dòng)睡眠期較活躍。

A：Rh/Re和CeA病毒注射示意圖；B:光纖及腦肌電電極埋置示意圖；C：Rh/Re內(nèi)感染GCamp7b及光纖記錄典型代表圖；D：特異性投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元在覺醒/睡眠各狀態(tài)下鈣信號(hào)活動(dòng)平均值 Kruskal-Wallis單因素秩方差分析， a: P<0.05，3組之間兩兩比較；E：Wake期向NREM期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60s比較；F：NREM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較；G: REM期向Wake期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較；H：NREM期向REM期轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化 配對(duì)t檢驗(yàn)，c：P<0.001，狀態(tài)轉(zhuǎn)換前后60 s比較

A：在覺醒/睡眠周期不同狀態(tài)下投射至CeA的中線丘腦各核團(tuán)神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)模式對(duì)比；B：在覺醒/睡眠不同狀態(tài)轉(zhuǎn)換時(shí)投射至CeA的中線丘腦各核團(tuán)神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化特征對(duì)比 a: P<0.05

3 討論

覺醒作為人與其他動(dòng)物進(jìn)化上高度 保守的行為，為其他活動(dòng)提供基礎(chǔ)支撐。覺醒由彌散分布于全腦的覺醒調(diào)控系統(tǒng)活動(dòng)控制，其中中線丘腦在維持覺醒中起著至關(guān)重要的作用。情緒活動(dòng)是影響覺醒/睡眠狀態(tài)的重要因素之一。如恐懼、焦慮、抑郁等覺醒依賴情緒信息可在REM睡眠期得以鞏固，進(jìn)而影響正常覺醒/睡眠周期。臨床研究表明，負(fù)性情緒與睡眠障礙存在惡性循環(huán)關(guān)系，直接導(dǎo)致日間覺醒不良。杏仁核作為情緒整合的關(guān)鍵核團(tuán)，是中線丘腦的重要輸出靶區(qū)之一。本研究首先利用逆行神經(jīng)示蹤技術(shù)，探究中線丘腦各神經(jīng)核團(tuán)和杏仁核各亞區(qū)之間形態(tài)學(xué)聯(lián)系特征，并進(jìn)一步記錄了投射到CeA的中線丘腦不同神經(jīng)元在覺醒/睡眠周期中的活動(dòng)模式，為中線丘腦-杏仁核通路在覺醒/睡眠周期中的作用機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。

杏仁核主要由CeA和BLA組成，其中CeA是恐懼信號(hào)生成和傳導(dǎo)的中繼站和輸出站。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)投射到CeA的中線丘腦核團(tuán)(PVT與Rh/Re)神經(jīng)元數(shù)量明顯高于投射到BLA的神經(jīng)元數(shù)量，提示中線丘腦與CeA形成了更為緊密的聯(lián)系。光纖記錄研究投射到CeA的中線丘腦神經(jīng)元在自然覺醒/睡眠周期中活動(dòng)模式，發(fā)現(xiàn)PVT-CeA通路在覺醒期活躍，其覺醒期活動(dòng)水平顯著高于NREM睡眠期與REM睡眠期。PVT-CeA通路與多種生理和病理相關(guān)情緒活動(dòng)密切相關(guān)，如恐懼、應(yīng)激、獎(jiǎng)賞、藥物成癮和抑郁等。由于情緒活動(dòng)通常伴隨覺醒水平變化， PVT-CeA通路在覺醒期的選擇性高活動(dòng)水平可能為該通路在調(diào)節(jié)覺醒依賴行為中發(fā)揮作用提供基礎(chǔ)。電生理記錄結(jié)果表明CM神經(jīng)元在覺醒期和REM睡眠期神經(jīng)元活動(dòng)均較強(qiáng)，且REM期更為活躍。CM神經(jīng)元的REM睡眠高活動(dòng)驅(qū)動(dòng)背內(nèi)側(cè)前額葉皮層微環(huán)路興奮/抑制平衡變化，從而鞏固REM睡眠相關(guān)的情緒記憶(Paradoxical somatodendritic decoupling supports cortical plasticity during REM sleep)。我們發(fā)現(xiàn)CM-CeA通路除在覺醒期表現(xiàn)出較高水平的活動(dòng)外，其REM睡眠期活動(dòng)水平明顯高于NREM睡眠期，提示CM-CeA通路可能參與REM睡眠期的情緒記憶鞏固。Rh/Re作為腹側(cè)中線丘腦的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)饑餓、應(yīng)激、焦慮及光照周期相關(guān)行為(Importance of the ventral__midline thalamus in driving hippocampal functions)。此外，Rh/Re與認(rèn)知系統(tǒng)重要結(jié)構(gòu)海馬及前額葉皮層形成雙向聯(lián)系，將前額葉皮層的輸出信息中繼至海馬，從而協(xié)調(diào)前額葉皮層與海馬之間的信息流動(dòng)，完成睡眠期的記憶鞏固。Rh/Re-CeA通路在覺醒期與REM睡眠期均表現(xiàn)出較高的活動(dòng)水平，提示該通路可能同時(shí)參與Rh/Re調(diào)節(jié)的覺醒與睡眠相關(guān)行為功能。

本研究主要探討了中線丘腦-杏仁核通路形態(tài)學(xué)特征并重點(diǎn)研究了中線丘腦-CeA通路在睡眠/覺醒周期中的活動(dòng)模式。值得注意的是，中線丘腦同時(shí)也投射至BLA并參與調(diào)節(jié)重要的行為功能。例如，化學(xué)遺傳學(xué)激活Rh/Re-BLA通路增加視覺天敵威脅誘發(fā)的本能防御反應(yīng)，如凍結(jié)行為等。然而，中線丘腦-BLA通路在睡眠/覺醒周期中的活動(dòng)模式有待闡明。此外，本研究的逆行示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明投射至CeA的Rh/Re與 CM神經(jīng)元數(shù)量相似，但是CM-CeA通路鈣信號(hào)活動(dòng)水平明顯高于Rh/Re-CeA通路活動(dòng)水平。這可能是由于投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元主要集中于Re近腹側(cè)近第三腦室的位置，而GCaMP7b標(biāo)記的投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元集中于Re背側(cè)部，從而導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量偏少，鈣信號(hào)活動(dòng)水平偏低。在未來(lái)的研究中，需進(jìn)一步標(biāo)記全部投射至CeA的Rh/Re神經(jīng)元并記錄其活動(dòng)模式。

綜上所述，本研究利用逆行神經(jīng)示蹤技術(shù)，觀察了中線丘腦各神經(jīng)核團(tuán)與杏仁核各亞區(qū)之間的形態(tài)學(xué)聯(lián)系特征，以及投射至CeA的中線丘腦各核團(tuán)神經(jīng)元在覺醒/睡眠中的活動(dòng)模式。研究結(jié)果為中線丘腦在覺醒調(diào)控中的地位提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，為情緒調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致的覺醒/睡眠障礙提供了新的環(huán)路方向。