超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中氯霉素及硝基咪唑類藥物殘留

倪楊 楊軍軍 石磊 張瑩瑩 熊融

（北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京 100093）

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是酰氨醇類抗生素，對革蘭氏陰性菌以及陽性菌都有很好抑制作用，常用于動物傳染性疾病的預(yù)防治療，由于其藥性穩(wěn)定且價格低廉，在蜂業(yè)養(yǎng)殖中常被非法使用，導(dǎo)致消費者可能長期低劑量攝入而危害健康，蜂蜜中CAP 殘留問題是影響蜂蜜食用安全和貿(mào)易的主要問題之一[1-3]。CAP 在人體內(nèi)過量蓄積能夠抑制骨髓造血功能，導(dǎo)致再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥、灰嬰綜合征等疾病，還可引起中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至誘使細(xì)胞癌變[4-6]。因此，世界上許多國家已禁止CAP 類藥物用于動物食品的生產(chǎn)，美國規(guī)定在動物性食品中不得檢出CAP，歐盟規(guī)定CAP 等多種抗生素藥物不再作為獸藥使用，我國在2002年已將CAP 列入《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第193 號）。

硝基咪唑類（nitroimidazoles，NMZs）藥物是一類具有5-硝基咪唑環(huán)共同結(jié)構(gòu)的合成抗菌類藥物，具有抗原蟲和抗厭氧菌活性，曾被廣泛用于蜜蜂孢子蟲病的預(yù)防和治療，造成該類藥物在蜂蜜中的殘留問題[7]。由于NMZs及其在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有潛在致癌性、致畸性和致突變性，且代謝物在動物體內(nèi)比原藥維持時間更長[8]，如果在動物源性食品中殘留、累積，則會對食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[9-10]。因此許多國家將NMZs 列為違禁藥物，我國已于2002年禁止NMZs 的使用，GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》明確規(guī)定，除二甲硝咪唑和甲硝唑允許用于治療，不得在動物性食品中檢出，其他NMZs 在所有食品動物中禁止使用，且不得檢出[11]。

鑒于抗生素的危害，國家監(jiān)管機(jī)構(gòu)曾加大對CAP、NMZs 等藥物殘留問題的監(jiān)督，但非法使用現(xiàn)象仍屢禁不止，蜂蜜抽檢不合格的事件時有發(fā)生[12-15]，因此有必要建立蜂蜜中CAP 和NMZs 的精準(zhǔn)定量檢測方法。目前，高效液相色譜法、超高效液相色譜法作為主流色譜技術(shù)的代表，尤其與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，憑借強(qiáng)大的分離能力和較好的靈敏度、準(zhǔn)確性，已經(jīng)發(fā)展成為藥物檢測領(lǐng)域最為可靠的定性定量分析方法。但農(nóng)產(chǎn)品中CAP、NMZs 的液質(zhì)檢測方法，前處理多使用固相萃取柱[2、11、16-17]進(jìn)行凈化，不但其選擇性和除雜富集效果有待提高，因其操作復(fù)雜、過柱時間長且成本較高，不適合大批量快速檢測。QuEChERS 作為一項新興的高效提取凈化方法，因其操作簡單、適用性廣、提取凈化效率高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于獸藥檢測之中。本研究綜合利用QuEChERS 方法和UPLCMS/MS 技術(shù)的優(yōu)勢，建立了UPLC-MS/MS 同時檢測蜂蜜中CAP 和NMZs 殘留量的方法，具有靈敏、簡便、高效的優(yōu)點，可滿足蜂蜜中多組分抗生素藥物殘留的監(jiān)測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣品：購于超市和集市，于-20℃保存；標(biāo)準(zhǔn)品：CAP、甲硝唑（Metronidazole，MNZ）、羥基甲硝唑（Metronidazole-OH，MNZOH）、二甲硝咪唑（Dimetridazole，DMZ）、羥基二甲硝咪唑（Hydroxydimetridazole，HMMNI）、異丙硝唑（Ipronidazole，IPZ）、羥基異丙硝唑（Ipronidazole-OH，IPZOH）、洛硝噠唑（Ronidazole，RNZ）純度＞98%，北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純） 美國Fisher 公司；甲酸、乙酸銨、氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉（分析純）上海麥克林生化科技有限公司；PSA、C18日本島津公司；微孔過濾膜（13 mm×0.22 μm，尼龍） 北京迪科馬科技有限公司；Acquity BEH C18色譜柱（2.1×100 mm，1.7 μm） 美國Waters 公司；ACQUITY HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美國Waters 公司；ACQUITY BEH HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美國Waters 公司；氬氣（純度＞99.9%） 北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司；實驗用水為超純水（電阻率大于18.2 MΩ·cm） 由Milli-Q 超純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC I-Class 液相色譜儀 美國Waters公司；Xevo TQ-S 質(zhì)譜儀（配有ESI 及Masslynx4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Waters 公司；Milli-Q 超純水機(jī)美國Millipore 公司；GL-20G-II 高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FE20 型實驗室pH 計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-600DB 超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；QL-8BB 旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；BSA224SCW 型電子天平 德國Sartorius 公司；PL2002 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取10 mg（精確到0.1 mg）標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線得到1000 μg/mL 的單標(biāo)儲備液，于-20 ℃冰箱中密封、避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：精密吸取單標(biāo)儲備液0.1 mL 于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線得到10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，4 ℃密封、避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液各0.05 mL 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線得到50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液0.02 mL于PE管中氮吹至近干，加入2 mL甲醇至濃度為100 g/L。用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋，配制不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。其中，CAP、MNZ、DMZ、IPZ、RNZ 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度分別為0.1、1、5、10、20、50 μg/L，MNZOH、HMMNI、IPZOH 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度分別為0.5、1、5、10、20、50 μg/L。1.3.2 樣品前處理

將蜂蜜樣品攪拌均勻，稱取5.00 g 置于50 mL 旋蓋離心管中，加入5 mL 超純水渦旋振蕩溶解，再加入15 mL 乙腈溶液超聲提取10 min，然后加入3 g 氯化鈉，渦旋振蕩1 min 后靜置分層。吸取3 mL 有機(jī)相置于內(nèi)含200 mg C18和200 mg PSA 的15 mL 離心管中，渦旋振蕩0.5 min 后，靜止3 min，過0.22 μm 有機(jī)濾膜于樣品瓶中，待測分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Acquity BEH C18（2.1×100 mm，1.7μm）；柱溫：40℃；流速：0.2 mL/min；流動相：A 為乙腈，B 為0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液；梯度洗脫程序：0～0.5 min、90% B，0.5～1.0 min、90%～40% B，1.0～3.0 min、40%～10% B，3.0～4.0 min、10% B，4.0～4.5 min、90% B；進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；掃描方式：正、負(fù)離子同時掃描；檢測模式：MRM；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔電壓：40 V；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；碰撞氣：氬氣。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Waters Masslynx 儀器配置工作站系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，利用Excel 軟件、R 語言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液直接進(jìn)樣進(jìn)行正負(fù)離子掃描，CAP 在負(fù)離子[M-H]-模式響應(yīng)最高，且得到的碎片離子信息最強(qiáng)。7 種NMZs 在正離子[M+H]+模式下響應(yīng)值最高，增加碰撞能量和錐孔電壓，獲得離子碎片信息。選擇相對較強(qiáng)的2 個離子作為定量和定性離子對，最后優(yōu)化裂解電壓、碰撞能量使目標(biāo)化合物響應(yīng)值達(dá)到最大，最終離子對、裂解電壓、碰撞能量等優(yōu)化參數(shù)如表1所示。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了CQUITY BEH C18柱、ACQUITY HSS T3柱和ACQUITY BEH HILIC 柱的靈敏度和分離效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSS T3 色譜柱不能很好地分離NMZs，會產(chǎn)生連續(xù)的色譜峰；使用BEH HILIC 色譜柱時，部分化合物不出峰，且整體峰形較差，響應(yīng)值較低；而BEH C18色譜柱能夠在3 min 內(nèi)較好的分離8 種化合物，且峰型更加對稱、尖銳，靈敏度更高，故選定CQUITY BEH C18柱作為分析色譜柱。

為了獲得最佳的色譜分離效果以及提高目標(biāo)化合物的靈敏度，實驗對流動相進(jìn)行優(yōu)化。甲醇和乙腈是色譜檢測中常用的有機(jī)系流動相，研究比較了甲醇-水、乙腈-水作為流動相的效果，發(fā)現(xiàn)乙腈作為流動相時，目標(biāo)化合物的出峰時間適中、峰寬較小、響應(yīng)值較高。由于降低流動相pH 值可以改善峰形、提高質(zhì)譜離子化效率，實驗選用0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液作為水相，通過優(yōu)化梯度洗脫程序，在流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃條件下，各化合物峰形對稱性明顯得到改善，并且響應(yīng)值增強(qiáng)，色譜條件優(yōu)化后的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 MRM色譜圖

2.3 提取條件的優(yōu)化

由于蜂蜜不易溶于有機(jī)溶劑，因此通常用純水溶解蜂蜜樣品。甲醇、乙腈是目前最常用的提取劑[18]，甲醇比乙腈具有更好的溶解性，易將樣品中的糖、酸、色素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)提取出來，致使提取液中雜質(zhì)較多，不利于后續(xù)的鹽析和凈化，而乙腈對蛋白的沉淀作用較強(qiáng)且共提物少，因此選擇乙腈作為提取劑。

提取過程中加入無機(jī)鹽可以促進(jìn)目標(biāo)化合物由水相分配至有機(jī)相，利于水相與有機(jī)相分層。實驗對比NaCl、無水MgSO4、無水Na2SO4對8 種獸藥回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加3 g NaCl，渦旋振蕩1 min 后靜置，即可使兩相溶液分層完全、清透，且對目標(biāo)化合物的回收率最好。

在目標(biāo)物提取過程中，蜂蜜中的糖、酸、色素等組分也會被部分提取，不僅影響痕量目標(biāo)物的檢測，也會對色譜、質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染，為降低基質(zhì)效應(yīng)，需要對提取液進(jìn)行凈化除雜。QuEChERS 方法常用的凈化劑以C18、PSA 為主，C18可有效除去脂肪和脂類等非極性有機(jī)物，PSA 能夠吸附多種極性有機(jī)酸、極性色素以及部分糖類和脂肪酸，動物源性食品基質(zhì)較為復(fù)雜，為獲得理想的凈化效果，本方法同時使用C18、PSA 2 種吸附劑。實驗以空白蜂蜜樣品的加標(biāo)回收實驗，比較了不同比例吸附劑混用對8 種獸藥凈化回收的影響（n=3）。通過對2 種吸附劑的用量配比進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，C18和PSA 2 個因素各取3 個水平（100 mg、200 mg、300 mg），比較50 μg/L 加標(biāo)水平下各因素組合的回收率來選擇最佳配比組合。正交試驗因素見表2，結(jié)果表明，使用200 mg C18和200 mg PSA 組成凈化劑可以獲得良好的回收效果，回收率為88.6%～95.3%。

表2 C18、PSA用量配比的正交試驗因素水平

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

為評價基質(zhì)效應(yīng)，以基質(zhì)標(biāo)與溶劑標(biāo)曲線斜率的比值考察8 種獸藥在蜂蜜中的信號增強(qiáng)/抑制程度（signal suppression/enhancement,SSE），SSE值大于1.2表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于0.8 表示基質(zhì)抑制效應(yīng)，在0.8～1.2 之間則視為基質(zhì)效應(yīng)影響不大。由表3得知，在蜂蜜基質(zhì)中，所有化合物的SSE 值均低于1.2，但MNZOH、DMZ 和IPZOH 的SSE 值在1.15～1.20 范圍內(nèi)，屬于弱增強(qiáng)效應(yīng)，因此，采用基質(zhì)匹配標(biāo)樣來對蜂蜜中的目標(biāo)化合物進(jìn)行定性和定量分析。

表3 基質(zhì)效應(yīng)

2.4.2 線性關(guān)系、LODs 與LOQs

取空白蜂蜜樣品，按照1.3.2 進(jìn)行樣品前處理，分別配制一系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)測定后，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制8 種獸藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以定性通道的3 倍信噪比（S/N=3）、定量通道的10 倍信噪比（S/N=10）確定各化合物的LODs 和LOQs。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R2≥0.9986），LODs和LOQs 分別為0.09～1.50 μg/kg、0.20～3.00 μg/kg，本方法具有良好的定性和定量分析能力。

2.4.3 回收率與精密度

空白蜂蜜樣品中添加3 個濃度水平（LOQ、3×LOQ、10×LOQ）的目標(biāo)化合物，每個濃度做6 個平行樣，以本文上述方法處理樣品并測定濃度，計算加標(biāo)回收率和RSDs?；厥章手冈诜涿劭瞻讟悠诽砑右欢ㄙ|(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后再進(jìn)行前處理，用空白樣品提取液配制的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算回收率；精密度是測定蜂蜜樣品3 個添加水平6 個重復(fù)的回收率，以RSD 表示。結(jié)果見表5，8 種獸藥在低水平添加量下的平均回收率為81.2%～92.3%，RSDs 為2.2%～4.2%；中水平添加量下的平均回收率為83.6%～93.3%，RSDs 為1.2%～4.1%；高水平添加量下的平均回收率為88.8%～95.5%，RSDs為2.0%～3.6%。檢測結(jié)果滿足GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的相關(guān)要求。

表5 回收率和RSDs（n=6）

2.5 實際樣品測定

為驗證本方法的適用性，選取超市蜂蜜樣品10份、蜂農(nóng)自產(chǎn)自銷蜂蜜樣品5 份進(jìn)行分析。其中，超市售賣的蜂蜜中，有1 份樣品檢出MNZ，含量為0.86 μg/kg；而蜂農(nóng)銷售的蜂蜜中，有2 份樣品只檢出MNZ，含量為1.17 μg/kg、2.83 μg/kg，1 份樣品同時檢出CAP 和MNZ，含量分別為1.47 μg/kg 和5.36 μg/kg。根據(jù)GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，CAP 和MNZ 不得在動物性食品中檢出，本次抽檢結(jié)果應(yīng)給予持續(xù)關(guān)注。

表4 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、LODs和LOQs（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC-MS/MS 同時測定蜂蜜中CAP 和NMZs 的快速檢測方法。實驗優(yōu)化了前處理方法及色譜質(zhì)譜條件，使目標(biāo)化合物擁有較好的分離效果和較高的檢測靈敏度。樣品以ACQUITY BEH C18色譜柱分離，在ESI 正、負(fù)離子切換掃描模式下，采用MRM 模式測定，8 種獸藥在3 min 內(nèi)完成色譜分離分析。在0.1～50 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，8 種獸藥在蜂蜜中均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R2≥0.9986），其中CAP 的LOD、LOQ 分別為0.09 μg/kg 和0.20 μg/kg，7 種NMZs 的LODs 和LOQs 分別為0.50～1.50 μg/kg 和1.50～3.00 μg/kg。以蜂蜜基質(zhì)分別在低、中、高3 個添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，平均回收率為81.2%～95.5%，RSDs 為1.2%～4.2%，滿足檢測方法確認(rèn)的相關(guān)要求。該方法操作簡單、精密度好、靈敏度高、分析速度快，可廣泛應(yīng)用于蜂蜜中CAP 和NMZs 的測定，為監(jiān)測、評估蜂蜜中多組分獸藥的污染風(fēng)險評估和確證檢測提供參考方法。