人發(fā)角蛋白透析純化研究

郭克兵 田湞楨 付艷紅 盧伊婷 季金茍 郝石磊

人發(fā)角蛋白透析純化研究

郭克兵1田湞楨1付艷紅1盧伊婷1季金茍1郝石磊2

（1.重慶大學化學化工學院，重慶 401331；2.重慶大學生物工程學院，重慶 401331）

為了了解透析純化過程中人發(fā)角蛋白二級結構的變化情況，用接觸角測定儀、圓二色譜儀（CD）和X-射線衍射儀（XRD）等對高溫氨解提取的人發(fā)角蛋白進行了分析。結果表明，透析0 h～36 h，角蛋白親水性減小，二硫鍵含量增加，α-螺旋含量顯著增高，無規(guī)則卷曲含量占比明顯減少；透析36 h～72 h，親水性依舊減少，二硫鍵含量基本不變，無規(guī)則卷曲占比顯著增大。透析過程對α-螺旋和β-折疊晶區(qū)基本沒有影響。

人發(fā)角蛋白；透析；純化；時間；結構

引言

人發(fā)角蛋白因其生物相容性、良好的組織黏附性被廣泛用于制作水凝膠、薄膜、支架等生物材料[1-3]。人發(fā)角蛋白通常從人發(fā)中提取而來[4,5]，因此人發(fā)角蛋白的提取純化過程受到越來越多的關注。

人發(fā)角蛋白是以α-螺旋為主要結構的α-角蛋白，屬于不溶性大分子，因此難以提取[6-8]。研究者們開發(fā)了包括機械法、還原法、氧化法等方法的提取方法[4,5]，但是提取過程往往包含透析純化步驟。純化是角蛋白應用前的必經步驟，通常透析純化大多固定在一定時間，對其研究較小。

透析技術是最簡便、最常用的分離純化技術之一，可以去除鹽、少量有機溶劑和小分子雜質，并使樣品濃縮和改變微量樣品的緩沖系統(tǒng)等。用透析袋透析簡單方便、廉價、可循環(huán)利用，即將生物大分子樣品溶液置入袋內，浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內，而鹽和小分子等物質不斷擴散透析到袋外，直到袋內、外兩邊的濃度達到平衡。一般認為，角蛋白在透析過程中其二級結構會發(fā)生一定的變化，但是對變化過程未有深入的了解，現(xiàn)代研究發(fā)生，角蛋白的二級結構對其生物應用具有重要影響，因此，本文采用高溫水氨解自制的人發(fā)角蛋白，對其透析純化過程進行相關研究。

1　材料與方法

1.1　試劑與儀器

人發(fā)（搜集于理發(fā)店）；聚氧乙烯辛基苯酚醚-10（OP-10）（成都科龍化工試劑廠）；氫氧化鈉、23%氨水、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）（重慶川東化工有限公司）；碳酸氫鈉（成都市科隆化學品有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（美國Sigma公司）；考馬斯亮藍R250、過硫酸銨，（上海生工生物工程股份有限公司）；醋酸（國藥集團化學試劑有限公司）。以上所有試劑均為分析純。二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB），生物試劑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。蛋白上樣緩沖液、彩色預染marker（11-180 kDa），生物試劑（上海源葉生物科技有限公司）。實驗用水為實驗室自制去離子水。

GFK-10-200型水熱合成反應釜（上海貝倫儀器設備有限公司）；DHG-9033A型電熱恒溫鼓風干燥箱（沙鷹科學儀器有限公司）；MD1444（8000-14000）型透析袋，上海源葉FD-IA-50型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器）；T6新世紀型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；Nicolet is50型傅立葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；1658001型電泳儀設備（美國Bio-Rad公司）；CHIRASCAN型圓二色光譜儀（英國Applied Photophysics）；XRD（Spectris公司）。

1.2　方法

1.2.1人發(fā)角蛋白提取

按實驗室已有方法提取人發(fā)角蛋白。稱取一定量人發(fā)，剪至0.5 cm～1 cm，按1︰2︰2（w/v/v）的比例向燒杯中依次加入4% OP-10和5% NaOH，室溫下攪拌2 h。用去離子水沖洗6次，置于60℃烘箱過夜干燥。稱取2 g已預處理的人發(fā)，置于200 mL水熱合成反應釜內膽內，加入8 mL 23%氨水，將反應釜放入烘箱，185℃反應30 min。加入50 mL去離子水，室溫下攪拌1.5 h，四號篩網過濾，收集濾液。濾液調pH至7.4，靜置后在4 ℃下12000 rpm離心20 min，合并上清液。上清液調pH至4.0～4.2，在4℃下6000 rpm離心20 min，留沉淀。角蛋白沉淀分散于1 mol·L-1碳酸氫鈉中，放入透析袋（截留分子量3500 Da）中透析，透析外液為去離子水，每12 h更換一次。

取不同透析時的角蛋白，冷凍干燥，得淺黃色粉末。

1.2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

參照Kadathur等[9]方法并稍作修改。配置12%的分離膠：1.6 mL去離子水、2 mL 30%丙烯酰胺溶液、1.3 mL 1.5 mol·L-1Tris（pH8.8）、0.05 mL 10% SDS溶液、0.05 mL 10%過硫酸銨和0.002 mL四甲基乙二胺。5%濃縮膠：2.1 mL去離子水、0.5 mL 30%丙烯酰胺混合溶液、0.38 mL 1.0 mol·L-1Tris（pH6.8）、0.03 mL 10% SDS溶液、0.03 mL 10%過硫酸銨和0.003 mL四甲基乙二胺。取20 μL角蛋白樣品（15 mg·mL-1）加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min。取煮沸冷卻后的樣品10 μL和Marker 5 μL，上樣。80 V電壓下進行電泳，待Marker條帶出現(xiàn)后，增大電壓至110 V，直至電泳分離結束。考馬斯亮藍R250染色，乙醇-醋酸脫色至無背景色。

1.2.3傅里葉紅外光譜（FT-IR）

將溴化鉀在紅外燈下于研缽中研磨成均勻粉末，再將角蛋白樣品與溴化鉀以1∶100的比例混合均勻后，研磨成粉。壓片機20 MPa壓制1 min～2 min成透明薄片，用FT-IR在400 cm-1～4000 cm-1掃描。

1.2.4接觸角

將角蛋白樣品壓片，置于接觸角測試儀平臺的玻璃片上，緩慢轉動旋鈕，將水滴滴在在樣品上，記錄結果。

1.2.5二硫鍵含量的測定

參照Zhang等[10]方法。將角蛋白樣品各稱量10 mg。游離巰基含量測定：角蛋白樣品加入0.8 mL緩沖液A，室溫下震蕩2 h，加入0.2 mL緩沖液B，繼續(xù)震蕩1 h，在4 ℃下10000 rpm離心10 min。上清液稀釋至合適濃度，測量在412 nm的吸光度。空白參比為0.8 mL緩沖液A＋0.2 mL緩沖液B。總巰基含量測定：參照游離巰基的測定方法。用緩沖液C和D替代緩沖液A和B。上述反應在避光條件下進行。計算時，摩爾消光系數(shù)取13600 M-1·cm-1，游離巰基或總巰基含量計算公式為：

式中：A412為412 nm下角蛋白的吸光度值。二硫鍵含量計算公式為：

二硫鍵含量 =（總巰基含量-游離巰基含量）/2

1.2.6圓二色譜（CD）

參照Kadathur等[11]方法。用圓二色分光光度計對濃度為0.5 mg·mL-1的角蛋白樣品進行圓二色性分析。25℃，以1 nm的光譜分辨率收集數(shù)據(jù)，平均時間為1 s，掃描速率為100 nm·min-1，掃描范圍190 nm～250 nm，每個樣品重復測量三次。使用BeStSel服務器（http://bestsel.elte.hu）計算二級結構。

1.2.7粉末X射線衍射（XRD）

取適量角蛋白樣品，研磨成細粉，過200目篩，進行粉末X射線衍射測試。

1.3　數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad軟件（Insight Science公司）進行統(tǒng)計分析。顯著性水平設為α=0.05；用最小顯著性差異法檢驗數(shù)據(jù)間的差異顯著性，用＜0.05表示。

2　結果與討論

2.1　提取的人發(fā)角蛋白表征

2.1.1聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

取透析了36 h所得的人發(fā)角蛋白，按照2.2.2方法，用SDS-PAGE測定其質分子量，見圖1。

圖1　角蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

從圖1可以看出，提取所得角蛋白分布在25 kDa以下、35 kDa～56 kDa、75 kDa～135 kDa，分子量分布廣泛，與文獻基本一致[11-13]。

2.1.2傅里葉紅外光譜（FT-IR）

取透析了36 h所得的人發(fā)角蛋白，進行FT-IR分析，并和人發(fā)纖維相比較，見圖2。

a.人發(fā)纖維；b.角蛋白

從圖2可以看出，天然人發(fā)纖維與提取的人發(fā)角蛋白在3200 cm-1～3400 cm-1均具有肽鍵酰胺A帶，1638 cm-1～1657 cm-1的酰胺I帶，1534 cm-1～1545 cm-1的酰胺II帶，1240 cm-1～1245 cm-1的酰胺III帶，說明兩者均具有典型的蛋白質結構[14,15]，提取所得角蛋白與天然人發(fā)纖維分子結構相同。

綜上可見，本文采用高溫水氨解自制的人發(fā)角蛋白，分子量分布為25 kDa以下、35 kDa～56 kDa、75 kDa～135 kDa，具有典型的角蛋白結構。

2.2　透析時間對角蛋白的影響

角蛋白結構是影響角蛋白應用的重要因素[16]。因此，采用提取所得角蛋白，透析不同時間，研究對接觸角、二硫鍵和分子二級結構的影響。

2.2.1接觸角

為了解角蛋白親水性的變化，采用接觸角測量來直觀定量。

圖3　角蛋白和人皮膚的接觸角圖

從圖3可以看出，透析時間的增加會使接觸角增大，角蛋白親水性降低。一般認為，蛋白質親水性的好壞主要取決于分子的表面結構，如果分子表面帶電氨基酸多，則親水性高，如果疏水殘基增多，則親水性變差。之所以會發(fā)生隨著透析時間增長，親水性變差，可能是因為隨著透析時間增加，一些吸水性鹽被透析，或分子表面親水殘基內卷。對水的親和能力極大地反映了角蛋白的應用前景，正常皮膚的水接觸角為51.4°左右，過高或過低都不有利于其在生物修復材料中的應用，36 h和72 h角蛋白的水接觸角都與正常皮膚的接觸角相差不大。

2.2.2二硫鍵

因角蛋白的提取過程往往涉及二硫鍵的斷裂，且二硫鍵在角蛋白結構中起著重要作用，所以這里測量了二硫鍵含量變化。

圖4　角蛋白的二硫鍵含量

從圖4可以看出，0 h～36 h，二硫鍵含量顯著增高；36 h～72 h，二硫鍵含量基本不變。這可能是因為角蛋白提取涉及二硫鍵的斷裂，初始時未含二硫鍵的小分子量角蛋白較多，被透析至透析外液，36 h后幾乎透析干凈，故36 h～72 h二硫鍵含量基本不變。這也提示，高溫水氨解提取的人發(fā)角蛋白，透析提純可取36 h即可，而不用透析純化過長時間[17-19]。

2.2.3二級結構的影響

為了進一步了解透析時間對角蛋白結構的影響，用圓二色光譜（CD）對不同透析時間的角蛋白的二級結構進行了分析[21]，見圖5。

圖5　不同透析時間角蛋白的二級結構

蛋白質空間結構預測的第一步通常為預測二級結構，即判斷每一個氨基酸殘基是否處于α-螺旋、β-折疊和或其它狀態(tài)。每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級結構的傾向。從圖5（A）可以看出，不同角蛋白樣品均在200 nm～210 nm有一個負峰，可能是α-螺旋與無規(guī)則卷曲的復合峰；在222 nm有一個負峰，屬于α-螺旋。使用BeStSel服務器（http://bestsel.elte.hu）得到圖5（B），可以看出，在0 h時，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲各占17.5%、38.6%、43.9%；在36 h時，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲各占31.2%、37.6%、31.2%；在72 h時，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲各占20.5%、12.0%、67.5%。

0～36 h透析過程中，α-螺旋含量增加，無規(guī)則卷曲減少，β-折疊含量幾乎未變，這可能是因為前期透析過程中，無規(guī)則卷曲程度高的低分子量角蛋白擴散至透析外液，使無規(guī)則卷曲減少，且α-螺旋結構可能比β-折疊更穩(wěn)定，故α-螺旋含量顯著增高。

36 h～72 h透析過程中，無規(guī)則卷曲含量大幅度增加，可能說明在透析液中，無規(guī)則卷曲穩(wěn)定性最大，由于α-螺旋相比β-折疊又更穩(wěn)定，故在72 h后，無規(guī)則卷曲占比最大，α-螺旋次之，β-折疊最少。角蛋白的α-螺旋和β-折疊在長時間透析中有向無規(guī)則卷曲靠攏的趨勢。結合圖3說明，無規(guī)則卷曲可能主要通過內部的親水性基團相互作用，從而使角蛋白表面疏水性增大，也變得更加穩(wěn)定。

2.2.4晶型的影響

圖6為角蛋白透析0 h、36 h、72 h和人發(fā)纖維的XRD圖譜。

透析時間：a-0 h，b-36 h，c-72 h，d-人發(fā)纖維

在角蛋白的XRD圖譜中，9°和20°左右會存在兩個特征峰，9°的峰歸屬于α-螺旋和β-折疊，20°左右的峰則歸屬于β-折疊[20]。角蛋白提取物在9°和20°左右對應的峰的尖銳程度都遠低于人發(fā)纖維，表明晶體化程度低。從透析0 h，36 h和72 h的XRD圖可以看出，0 h和36 h的略有差別，主要表現(xiàn)在9°的峰形上，這可能是由于透析前的部分雜質所引起；而36 h和72 h的XRD圖幾乎完全一致，結合圖5說明，α-螺旋或β-折疊向無規(guī)則卷曲變化過程中，α-螺旋和β-折疊晶區(qū)仍然會保留。

3　結論

本文提取人發(fā)角蛋白后，分別透析純化0 h、36 h、72 h。結果表明，隨著透析時間增加，角蛋白疏水性和二硫鍵均增加，透析至36 h后基本不變；隨著透析的進行，α-螺旋和β-折疊，尤其是β-折疊易向無規(guī)則卷曲轉變；XRD結果顯示，這一轉變，對α-螺旋和β-折疊微晶區(qū)基本沒有影響。了解和掌握角蛋白二級結構的變化情況，對角蛋白的生物應用具有一定的指導意義。

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Study on Dialysis and Purification of Human Hair Keratin

In order to understand the changes of the secondary structure of human hair keratin during dialysis and purification, the human hair keratin extracted by high temperature ammonolysis was analyzed by contact angle analyzer, circular dichroism (CD) and X-ray diffraction (XRD). The results showed that during 0 h -36 h of dialysis, the hydrophilicity of keratin decreased, and the content of disulfide bond increased. The α-helix content increased significantly, and the proportion of random curl content decreased significantly. During 36 h -72 h of dialysis, the hydrophilicity still decreased, the disulfide bond content remained basically unchanged, and the proportion of irregular curl increased significantly. The dialysis process had little effect on α-helix and β-folded crystal region.

human hair keratin; dialysis; purification; time; structure

Q518.1

A

1008-1151(2022)08-0043-04

2022-06-08

郭克兵（1996－），女，河北邢臺人，重慶大學化學化工學院學生，研究方向為角蛋白提取機理。

季金茍（1962－），男，江西南昌人，重慶大學化學化工學院教授，研究方向為生物材料。