丁香醛對釀酒酵母乙醇發(fā)酵過程和理化特性的影響

趙雪梅，伍時華，龍秀鋒*，易弋，曾令杰，袁瑞祥

1(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州，545006)2(廣西糖資源綠色加工重點試驗室，廣西 柳州，545006)

燃料乙醇是以生物質(zhì)為原料通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的，具有環(huán)保、清潔、可再生等諸多優(yōu)點，被認為是最具發(fā)展前景的石油替代能源[1]。釀酒酵母(Saccharomycescerevissiae)是生產(chǎn)乙醇最常使用的菌株，在工業(yè)上已經(jīng)形成完整的發(fā)酵體系，但在實際發(fā)酵過程中，釀酒酵母因受到高溫、高滲、有害物質(zhì)等多重脅迫的影響，其生長、繁殖與代謝能力會下降，導(dǎo)致糖利用率和乙醇終產(chǎn)量很難達到理論水平[2]。甘蔗糖蜜來源廣泛、價格低廉，含有酵母細胞生長所必須的碳源、氮源、無機鹽等諸多營養(yǎng)物質(zhì)，是生產(chǎn)乙醇較為理想的經(jīng)濟類原料[3]。但甘蔗糖蜜中含有大量膠體、灰分、金屬離子、酚類等多種抑制物，其中的酚類化合物丁香醛、阿魏酸、香草醛、丁香酸等[4-5]，會對多種細菌、真菌及酵母產(chǎn)生明顯的抑制作用[6]。

研究表明，酚類化合物可在糖制品如糖漿或糖蜜中存在，有學(xué)者運用LC-UV-ESI-MS技術(shù)對紅糖提取物中的酚類化合物進行檢測，顯示含有豐富的香草酸、香草醛和丁香醛等多酚化合物[7]。酚類化合物對細胞的毒性作用與其分子質(zhì)量、疏水性和甲氧基的數(shù)目及位置有關(guān)，它們可破壞細胞膜的完整性，通過抑制中心碳代謝的關(guān)鍵酶、干擾蛋白質(zhì)合成速率或增加用于修復(fù)細胞結(jié)構(gòu)損傷的ATP和NAD(P)H來影響酵母細胞的生長和代謝能力[8]，但這種毒性機制并不適用于所有微生物，其毒性強弱還與微生物自身的結(jié)構(gòu)及代謝有著密切的聯(lián)系[9]。

本文選取具有代表性的丁香醛作為實驗對象，通過外源添加不同質(zhì)量濃度的丁香醛，測定其對釀酒酵母細胞生長的抑制情況；以蔗糖代替甘蔗糖蜜中的可發(fā)酵性糖進行乙醇發(fā)酵實驗，探究丁香醛對釀酒酵母細胞生長、糖代謝和乙醇代謝的影響，并進一步通過測定丁香醛處理前后酵母細胞膜通透性和胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的變化，結(jié)合掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察酵母細胞形態(tài)變化、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR)分析細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)成分變化，探究丁香醛對釀酒酵母細胞的毒性機理，為實現(xiàn)甘蔗糖蜜高濃度乙醇發(fā)酵的生產(chǎn)水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種：釀酒酵母(S.cerevisiae)GJ2008由廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所保藏。

培養(yǎng)基：一(二)級種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20(50)，蛋白胨20，酵母浸粉10，pH自然，115 ℃蒸汽滅菌20 min；蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖250，蛋白胨20，酵母浸粉10，pH自然，121 ℃蒸汽滅菌20 min。

試劑：丁香醛(純度98%)，上海麥克林生化科技有限公司；蔗糖(AR)，南寧糖業(yè)股份有限公司；葡萄糖、果糖、戊二醛(AR)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜(AR)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯乙酸、硫酸(AR)，西隴科學(xué)股份有限公司；乙腈、乙醇(GR)，安徽時聯(lián)特種溶劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；ZWYR-C2402C疊式恒溫調(diào)速搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；HIMAC大容量冷凍離心機，日本株式會社日立制作所；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；賽里安456-GC氣相色譜儀，荷蘭賽里安儀器有限公司；HITACHI高效液相色譜分析儀，日立科學(xué)儀器(北京)有限公司；UV-8000S紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Alpha1-2LDplus真空冷凍干燥機，德國CHRIST公司；phenom(飛納)臺式掃描電鏡，復(fù)納科學(xué)儀器(上海)有限公司；Frontier傅里葉紅外光譜儀，興和儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液制備

將保藏菌株釀酒酵母GJ2008接入一級種子培養(yǎng)基中活化，于搖床150 r/min、30 ℃培養(yǎng)12～14 h；以10%的接種量轉(zhuǎn)至新鮮一級種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6～8 h，調(diào)整菌懸液濃度為108CFU/mL，備用。

1.3.2 丁香醛對釀酒酵母細胞生長的影響

將種子液以10%接種量接入二級種子培養(yǎng)基中，分別添加不同質(zhì)量濃度丁香醛(0、0.5、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L)和1 mL的二甲基亞砜作為助溶劑[10]，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)，定時取樣，測定菌體在560 nm下的吸光度，以發(fā)酵時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.3 蔗糖乙醇發(fā)酵過程中糖與乙醇含量的測定

將種子液以10%接種量接至蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，根據(jù)1.3.2中的結(jié)果，于發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.4 g/L丁香醛，以未添加丁香醛的菌液為對照組，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)36 h，定時取樣，保留上清液，使用高效液相色譜儀和氣相色譜儀檢測糖和乙醇質(zhì)量濃度。按公式(1)～公式(8)計算糖變化速率、乙醇生成速率等。

高效液相色譜儀測糖條件：色譜柱Alltima 5 μm Amino(250 mm×4.6 mm)，配示差檢測器；流動相為V(純乙腈)∶V(超純水)=75∶25，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL。

氣相色譜儀測乙醇條件：TM-930色譜柱(25 m×0.53 mm×1 μm)，配FID檢測器和液體自動進樣系統(tǒng)；柱溫初始溫度40 ℃，以5 ℃/min的速率升至80 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至150 ℃，總運行15 min，檢測器溫度230 ℃；進樣量0.5 μL；分流比20∶1。

(1)

式中：m為發(fā)酵過程中糖減少量，g/L；t為取樣間隔時間，h。

(殘)總糖/(g·L-1)=(殘)果糖+(殘)葡萄糖+(殘)蔗糖×1.05

(2)

式中：1.05為1分子蔗糖(相對分子質(zhì)量為342)水解為1分子果糖(相對分子質(zhì)量180)和1分子葡萄糖(相對分子質(zhì)量180)，1.05=(180+180)/342。

(3)

式中：m為取樣間隔時間內(nèi)總糖消耗量，g/L；t為取樣間隔時間，h。

(4)

式中：m為取樣間隔時間內(nèi)乙醇生成量，g/L；t為取樣間隔時間，h。

(5)

式中：m1為蔗糖水解生成的葡萄糖或果糖量，g/L；m2為殘葡萄糖或果糖量，g/L；0.511為糖轉(zhuǎn)化為醇的最大理論值。

(6)

式中：m1為初總糖量，g/L；m2為殘總糖量，g/L。

(7)

式中：m1為初總糖量，g/L；m2為最終乙醇質(zhì)量濃度，g/L；0.511為糖轉(zhuǎn)化為醇的最大理論值。

(8)

式中：m1為初總糖量，g/L；m2為殘總糖量，g/L；m3最終乙醇質(zhì)量濃度，g/L；0.511為糖轉(zhuǎn)化為醇的最大理論值。

1.3.4 釀酒酵母細胞形態(tài)觀察

將種子液以10%接種量接種到蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)9 h，添加丁香醛使其終質(zhì)量濃度為1.4 g/L，以未添加丁香醛作為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，6 000 r/min、10 min收集菌體，加入2.5%(體積分數(shù))的戊二醛于4 ℃冰箱固定過夜；再以20%、50%、70%、80%、90%、100%(體積分數(shù))的乙醇梯度洗脫，收集菌體進行真空冷凍干燥，噴金，于掃描電子顯微鏡下觀察酵母細胞形態(tài)。

1.3.5 核酸和蛋白質(zhì)的測定

按照1.3.4的細胞培養(yǎng)方法，分別取經(jīng)丁香醛(0、1.4 g/L)處理0、3、6 h的發(fā)酵液，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，于260、280 nm下分別測定核酸和蛋白質(zhì)的含量。

1.3.6 釀酒酵母胞內(nèi)MDA含量測定

按照1.3.4的細胞培養(yǎng)方法，分別取經(jīng)丁香醛處理0、3、6 h的菌體，加入適量10%(質(zhì)量分數(shù))三氯乙酸提取液和0.6%(質(zhì)量分數(shù))硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)試劑混勻，于100 ℃水浴煮沸15 min，迅速冷卻后8 000 r/min離心5 min，取上清液測定450、532、600 nm下的吸光度值，以0.6% TBA為空白對照；菌體烘干測定質(zhì)量，根據(jù)公式(9)、公式(10)計算MDA濃度。

MDA濃度/(μmol·L-1)=6.45(A532-A600)-0.56×A450

(9)

(10)

式中：V為提取液量，L；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.7 FTIR測定

按照1.3.4的細胞培養(yǎng)方法，收集丁香醛處理3 h的菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體3次，進行真空冷凍干燥，將凍干的酵母菌體2 mg與溴化鉀200 mg充分研磨混合均勻，壓片，于FTIR下測定丁香醛處理前后釀酒酵母紅外吸附光譜圖[11]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以上每個指標都采取3個平行實驗。實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(GraphPad Prism 8.1軟件)進行顯著性分析(P<0.05)，數(shù)據(jù)圖表由Origin 9.5軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香醛對釀酒酵母細胞生長的影響

通過在二級培養(yǎng)基中外源添加不同濃度的丁香醛，測定釀酒酵母GJ2008生長曲線，探究其對酵母細胞生長的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度丁香醛脅迫下釀酒酵母GJ2008生長曲線Fig.1 Growth curves of S.cerevisiae GJ2008 under different concentrations of syringaldehyde

由圖1可知，對照組無明顯延滯期，細胞能快速適應(yīng)環(huán)境進入生長期，在8 h達到穩(wěn)定期；添加0.5 g/L丁香醛時，酵母細胞生長趨勢與對照組相似，最終OD值略低于對照組；添加1.0、1.2 g/L的丁香醛時，酵母細胞達到穩(wěn)定期的時間延長2 h；而當(dāng)丁香醛質(zhì)量濃度在1.4～2.0 g/L時，細胞生長出現(xiàn)延滯期，到達穩(wěn)定期時間也由8 h延至10～16 h，最終OD值遠低于對照組。以上結(jié)果表明丁香醛會抑制釀酒酵母細胞的生長，且隨著丁香醛濃度的增加，細胞生長受抑制程度逐漸增強。因此，為進一步研究丁香醛對釀酒酵母細胞發(fā)酵和理化特性的影響，選取1.4 g/L丁香醛作為酵母細胞的脅迫質(zhì)量濃度。

2.2 丁香醛對蔗糖乙醇發(fā)酵過程中糖代謝和乙醇代謝的影響

2.2.1 丁香醛對蔗糖乙醇發(fā)酵過程中糖代謝的影響

探究在丁香醛脅迫下，殘蔗糖、殘葡萄糖與殘果糖的質(zhì)量濃度和蔗糖水解速率、葡萄糖與果糖消耗速率的變化對了解蔗糖發(fā)酵過程的糖代謝規(guī)律具有重要意義，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，SYD與CK相比，發(fā)酵過程中殘蔗糖、殘葡萄糖與殘果糖濃度變化趨勢相似，其中殘葡萄糖和殘果糖濃度曲線出現(xiàn)先上升后下降的情況，這跟蔗糖水解生成葡萄糖和果糖的量和同期的消耗量有關(guān)。在0～12 h，CK的葡萄糖和果糖消耗速率高于丁香醛處理組，而12～36 h則相反，發(fā)酵結(jié)束時最終殘葡萄糖和殘果糖濃度相差無幾，但SYD殘葡萄糖和殘果糖達到最高點的時間都比對照組延后了3 h，說明丁香醛影響了糖代謝的中間過程。值得注意的是，CK和SYD有一共同點，最終殘葡萄糖濃度都低于殘果糖濃度，且在0～21 h葡萄糖消耗速率大于果糖消耗速率，21～36 h由于葡萄糖基本消耗完全，果糖消耗速率開始大于葡萄糖消耗速率，產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因與發(fā)酵過程中酵母細胞己糖跨膜轉(zhuǎn)運對葡萄糖親和力優(yōu)于果糖有關(guān)[12]。由上述結(jié)果可知，在蔗糖乙醇發(fā)酵過程中添加1.4 g/L丁香醛雖然對總糖消耗影響不大，但卻會影響糖代謝的中間過程。

a-250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過程中殘蔗糖、殘果糖和殘葡萄糖質(zhì)量濃度曲線；b-250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過程中蔗糖水解速率、葡萄糖和果糖消耗速率圖2 丁香醛對蔗糖乙醇發(fā)酵過程中糖代謝的影響Fig.2 Effects of syringaldehyde on sugar metabolism during ethanol fermentation with sucrose注：CK表示對照組；SYD表示1.4 g/L丁香醛處理組(下同)

2.2.2 丁香醛對蔗糖乙醇發(fā)酵過程中細胞生物量、殘總糖和乙醇濃度的影響

在乙醇發(fā)酵過程中，細胞生長、總糖消耗和乙醇生成這3個指標是衡量發(fā)酵過程好壞的重要因素。根據(jù)氣、液相測定的實驗數(shù)據(jù)以及通過1.3.3公式計算糖和醇的變化速率，繪制曲線如圖3所示。

由圖3可知，SYD與CK相比，最終殘總糖濃度無明顯差異，但OD值和最終乙醇濃度均減少18.65%，說明丁香醛影響了酵母細胞生長和發(fā)酵產(chǎn)乙醇的性能。從總糖消耗速率與乙醇生成速率的角度分析，SYD在0～12 h總糖消耗速率低于CK，而12～36 h卻又高于CK，使得最終糖消耗基本相同。SYD乙醇生成速率在0～15 h處于劣勢，雖在15～27 h以微小的優(yōu)勢略高于CK，但最終乙醇質(zhì)量濃度(99.81 g/L)遠低于對照組(122.69 g/L)，分析原因是丁香醛滲透到細胞膜內(nèi)，抑制細胞的生長，減緩了總糖消耗速率，影響了細胞膜作為選擇性屏障及酶基質(zhì)的功能，使得產(chǎn)乙醇性能顯著降低[13]。以上結(jié)果說明，丁香醛抑制了細胞的生長，降低了乙醇生成速率和最終乙醇濃度，使得酵母細胞產(chǎn)乙醇性能下降。

a-250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過程中生物量、殘總糖和乙醇生成曲線；b-250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過程中總糖消耗速率與乙醇生成速率圖3 丁香醛對蔗糖乙醇發(fā)酵過程中細胞生物量、殘總糖和乙醇的影響Fig.3 Effects of syringaldehyde on biomass,total residual sugar and ethanol production during ethanol fermentation with sucrose

2.2.3 丁香醛對蔗糖乙醇發(fā)酵效果的影響

將氣相色譜儀、高效液相色譜儀測出的乙醇與葡萄糖、果糖、蔗糖數(shù)據(jù)根據(jù)1.3.3的公式計算得到表1。

表1 250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵結(jié)果Table 1 The results of ethanol fermentation with 250 g/L sucrose

由表1可知，添加1.4 g/L SYD與CK相比，最終乙醇濃度、總糖發(fā)酵效率、耗糖發(fā)酵效率和糖醇轉(zhuǎn)化率分別降低了18.65%、17.64%、17.26%、17.26%。酵母細胞消耗的總糖可用于菌體生長、繁殖、代謝產(chǎn)乙醇及其他高級醇等副產(chǎn)物，而本文SYD糖醇轉(zhuǎn)化率和耗糖發(fā)酵效率較低，其原因可能是酵母細胞為應(yīng)對脅迫環(huán)境，發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)向雜醇油等其他副產(chǎn)物[14]。綜上可知，在蔗糖乙醇發(fā)酵過程中外源添加1.4 g/L丁香醛會使最終乙醇生成濃度與糖醇轉(zhuǎn)化率降低。

2.3 丁香醛對釀酒酵母細胞形態(tài)的影響

為探究丁香醛是否會對釀酒酵母的形態(tài)造成損傷，本文通過SEM觀察了1.4 g/L丁香醛脅迫下釀酒酵母細胞形態(tài)的變化，結(jié)果如圖4所示。對照組酵母細胞表面光滑、飽滿，平整、緊湊，沒有出現(xiàn)破裂或孔現(xiàn)象；而丁香醛處理組酵母細胞出現(xiàn)些許空洞、胞間粘連、部分細胞內(nèi)容物外泄的情況，使得部分細胞受到損傷甚至死亡。

a-對照組；b-丁香醛處理組(3 h)圖4 對照組和丁香醛處理組中釀酒酵母GJ2008的SEM(×8 000)Fig.4 SEM (×8 000) images of S.cerevisiae GJ2008 in control group and syringaldehydes treatment group

2.4 丁香醛對釀酒酵母細胞膜通透性的影響

測定發(fā)酵上清液中的OD260值和OD280值不僅可反映核酸和蛋白質(zhì)的泄漏情況，且可間接反映細胞膜損傷的程度[15]。由圖5可知，酵母細胞經(jīng)1.4 g/L丁香醛脅迫處理后，其胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)外泄量顯著性增加(P<0.05)，且隨著處理時間的增加，其外泄量就越多；與CK相比，SYD在處理6 h后，核酸和蛋白質(zhì)外泄量分別增加了56.39%、58.29%。以上結(jié)果說明，丁香醛破壞了部分酵母細胞膜的完整性，增大了細胞膜通透性，使得胞內(nèi)物外泄，影響細胞正常的生理功能。

2.5 丁香醛對釀酒酵母細胞內(nèi)MDA含量的影響

測定丁香醛脅迫下酵母胞內(nèi)MDA含量的變化不僅可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，還可間接反映細胞受到活性氧(reactive oxygen species,ROS)攻擊后的損傷程度[16]，結(jié)果如圖6所示。

圖6 丁香醛脅迫下釀酒酵母GJ2008胞內(nèi)MDA含量的變化Fig.6 Changes of intracellular MDA content of S.cerevisiae GJ2008 under syringaldehydes stress

由圖6可知，與CK相比，SYD胞內(nèi)MDA含量顯著性增加(P<0.05)，且隨著處理時間的延長而逐漸增加，結(jié)果與2.4中核酸與蛋白質(zhì)外泄量隨著時間增加而增加呈高度相似性；胞內(nèi)MDA值在經(jīng)丁香醛處理3 h和6 h后分別增加了3.47和4.13倍。酵母在正常的生理狀態(tài)下，菌體生長迅速，代謝能力強，其體內(nèi)的抗氧化酶能夠及時的清除氧化代謝產(chǎn)物，但當(dāng)處于嚴重的脅迫環(huán)境時，產(chǎn)生的過多氧自由基會對部分酵母造成氧化損傷，使得過氧化產(chǎn)物MDA含量增加并積累。以上研究結(jié)果表明，釀酒酵母在1.4 g/L丁香醛脅迫下會造成細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA含量顯著性增加，胞內(nèi)自由基過多積累，細胞受損。

2.6 FTIR結(jié)果分析

本文采用FTIR間接表征了1.4 g/L丁香醛處理前后釀酒酵母細胞結(jié)構(gòu)中活性基團變化情況，結(jié)果如圖7所示。參考相關(guān)文獻[17-19]，可將釀酒酵母中主要紅外峰位進行歸屬，如表2所示。

表2 釀酒酵母GJ2008主要紅外峰位可能的歸屬Table 2 The possible attribution of the main infrared peaks of S.cerevisiae GJ2008

由圖7和表2可知，比較對照組和丁香醛處理組釀酒酵母紅外圖譜，沒有出現(xiàn)新的紅外吸收峰，說明釀酒酵母在丁香醛脅迫下仍保持原有的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。值得注意的是，在3 500～3 100 cm-1有一個強而寬的吸收峰，這是基團N—H變形振動和分子內(nèi)或分子間氫鍵O—H伸縮振動產(chǎn)生的，酵母經(jīng)丁香醛脅迫后，3 355 cm-1處的強寬峰藍移至3 371 cm-1，說明酵母細胞膜上的多糖、脂肪酸及蛋白質(zhì)的O—H和N—H基團可能發(fā)生了變化；在2 928 cm-1處有一較強的吸收峰，這是由三酰基甘油中脂肪酸的C—H基團的非對稱振動引起的，而丁香醛處理組此基團的吸收峰移至2 933 cm-1，表明脂肪酸的C—H基團發(fā)生了位移。綜上，丁香醛通過影響細胞膜上脂肪酸、蛋白質(zhì)和多糖結(jié)構(gòu)，改變了細胞膜通透性，進而引起部分細胞損傷甚至死亡。

3 結(jié)論與討論

釀酒酵母是甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵的主體微生物，在將糖轉(zhuǎn)化成乙醇的過程中會面對各種環(huán)境脅迫，酵母也會對脅迫條件做出應(yīng)答。為揭示發(fā)酵過程中丁香醛對釀酒酵母的影響，本研究以耐高糖的優(yōu)良釀酒酵母GJ2008為出發(fā)菌株，250 g/L蔗糖替代甘蔗糖蜜中的可發(fā)酵性糖作為發(fā)酵體系，考察不同濃度丁香醛對釀酒酵母細胞生長的影響，并系統(tǒng)的探究釀酒酵母在1.4 g/L丁香醛脅迫下的毒性機理。

隨著丁香醛濃度的增大釀酒酵母細胞生長受抑制程度不斷增強。在酵母蔗糖乙醇發(fā)酵過程中，丁香醛處理組與對照組糖消耗速率和乙醇生成速率均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，說明發(fā)酵剛開始時，酵母活性較高且營養(yǎng)物質(zhì)豐富，使得生長代謝速度加快，乙醇生成速率也比較快；而發(fā)酵后期，由于發(fā)酵液中乙醇和其他副產(chǎn)物含量的增多造成酵母活性降低、乙醇生成速率減慢。值得注意的是，丁香醛處理組與對照組相比，最大乙醇生成速率的發(fā)酵時間向后延長了3 h，分析原因是丁香醛可改變細胞膜上蛋白與脂質(zhì)的比例，干擾離子通道、ATP合成，從而擾亂細胞膜的功能，抑制細胞生長，造成乙醇發(fā)酵效率降低、最終乙醇濃度不高等不良現(xiàn)象[20]。此結(jié)論與兒茶酚對釀酒酵母細胞發(fā)酵過程中糖和乙醇代謝影響的結(jié)論相似[21]。研究表明，細胞在外界脅迫下，會改變細胞形態(tài)、增大細胞膜通透性、破壞膜流動性與穩(wěn)定性[22]；同時，會在胞內(nèi)累積ROS[23]，雖然適量ROS是細胞生長、繁殖所必需的，但是過多的ROS會攻擊膜和蛋白質(zhì)[24-25]，使細胞質(zhì)膜發(fā)生過氧化反應(yīng)，引起膜氧化損傷[26]，細胞膜表面上的蛋白質(zhì)和酶表達系統(tǒng)受到抑制[27]，進而影響細胞正常生長與代謝。而本研究表明釀酒酵母在丁香醛脅迫下，部分細胞發(fā)生皺褶、空洞、胞內(nèi)物外泄，出現(xiàn)胞間粘連在一起的現(xiàn)象；同時，MDA含量的顯著增加和細胞膜脂肪酸、蛋白質(zhì)、多糖成分中部分基團的改變也證明了丁香醛破壞了酵母細胞膜的完整性，這也從理化特性的角度解釋了糖醇代謝受阻的原因。后期可通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)手段進行深層次分析丁香醛對釀酒酵母乙醇發(fā)酵的影響機制。

本文通過對丁香醛脅迫下釀酒酵母的生長、發(fā)酵過程和理化特性進行研究，揭示了丁香醛對酵母細胞的毒性機理，為后期培育耐受型菌株并提高糖蜜乙醇發(fā)酵能力，實現(xiàn)糖蜜高濃度乙醇發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。