遠(yuǎn)東擬沙丁魚黃嘌呤氧化酶抑制肽的制備及其降尿酸活性的研究

詹蘇泓，吉宏武,2,3,4,5*，張迪，韋柳益，彭爍，陳銘，宋文奎，瞿瑜杉，劉書成,2,3,4,5,6

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)2(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088)3(廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088)4(廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524088)5(廣東省高等學(xué)校水產(chǎn)深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088)6(大連理工大學(xué)海鮮深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連，116034)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所致的一種代謝性疾病[1]，我國(guó)高尿酸血癥呈現(xiàn)高流行、年輕化、男性高于女性、沿海高于內(nèi)地的趨勢(shì)。據(jù)估算，全國(guó)患尿酸血癥的人數(shù)達(dá)1.2億，我國(guó)高尿酸血癥的患病率已經(jīng)高于糖尿病[2]，已成為繼高血壓、高血糖、高血脂之后的第四大健康風(fēng)險(xiǎn)因素[3]。目前降尿酸藥大致分為兩類，一類是促進(jìn)尿酸排泄藥物(丙磺舒、苯溴馬隆等)，一類是減少尿酸合成藥物(別嘌呤醇、非布司他等)[4]，其中別嘌呤醇是經(jīng)典的降尿酸藥物，其治療靶點(diǎn)為黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)，但這些藥物都有一定副作用，如皮疹、腎損害、心血管損害[5]等。近年來(lái)，食源性降尿酸活性肽逐漸成為研究熱點(diǎn)，其降尿酸機(jī)制的研究多集中在抑制XO活性。

XO是嘌呤代謝的關(guān)鍵酶[6]，能催化黃嘌呤或次黃嘌呤氧化為尿酸，在高尿酸血癥的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，從而可以通過(guò)抑制XO活性，降低尿酸的產(chǎn)生[7]。目前對(duì)食源性降尿酸物質(zhì)的研究多集中在抑制XO活性，具有降尿酸活性的物質(zhì)與XO相互作用，從而改變XO的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使酶的活性降低或使酶失活[8]。前人研究結(jié)果表明，食物來(lái)源的小分子肽[9]、黃酮類化合物[10]、多糖[11]等生物活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的降尿酸活性，小分子肽因其活性高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[12]，而受到人們高度關(guān)注。目前已從金槍魚[13]、鰹魚[14]、羅非魚皮[15]、鯊魚軟骨[16]、核桃粉[17]、大米[9]、牛奶[3]等多種材料中分離到多種具有降尿酸功效的活性肽。

遠(yuǎn)東擬沙丁魚(Sardinopssagax)又名斑點(diǎn)莎腦魚，主要分布于太平洋、大西洋東部海域以及我國(guó)的黃海海域，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉、生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。遠(yuǎn)東擬沙丁魚富含多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，DHA)，魚肉氨基酸組成廣泛，具有人類營(yíng)養(yǎng)和維持健康必需的優(yōu)良蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)道，遠(yuǎn)東擬沙丁魚蛋白肽具有降血壓、抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等多種生物活性，是制備生物活性肽的優(yōu)質(zhì)原料[19-20]。本文以遠(yuǎn)東擬沙丁魚為原料，采用堿性蛋白酶水解遠(yuǎn)東擬沙丁魚肉，通過(guò)膜分離與色譜相結(jié)合分離純化XO抑制肽，并以高尿酸細(xì)胞模型來(lái)評(píng)價(jià)XO抑制肽的降尿酸活性，為遠(yuǎn)東擬沙丁魚的高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠(yuǎn)東擬沙丁魚，廣東興億海洋生物工程有限公司；堿性蛋白酶：2×105u/g，南寧龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；XO、黃嘌呤、別嘌呤醇、乙腈，均為色譜純，美國(guó)Sigma公司；HK-2細(xì)胞，上海富衡生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基，PBS，0.25%胰蛋白酶，美國(guó)Gibco公司；胎牛血清，美國(guó)ZETA LIFE公司；戊烷磺酸鈉、次黃嘌呤、腺苷、肌苷、尿酸，均為色譜純，葡聚糖凝膠G-15，上海源葉生物科技有限公司；尿酸試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；Casp-1、GSDMD、NLRP3、IL-1β ELISA試劑盒，江蘇酶免生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，德國(guó)IKA公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；Lynx6000落地高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；陶瓷膜分離設(shè)備、卷式超濾膜設(shè)備，杭州沃騰膜工程有限公司；CA-2610旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA公司；FDU-1100真空冷凍干燥機(jī)，日本EYELA公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀Varioskan，美國(guó)Thermo Fisher公司；1200高效液相色譜儀、超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶解液的制備

將遠(yuǎn)東擬沙丁魚魚肉以料液比1∶2(質(zhì)量比)加入蒸餾水，勻漿后，將pH調(diào)至9，以0.15(堿性蛋白酶)∶100(魚肉)(質(zhì)量比)加入堿性蛋白酶，在60 ℃下恒溫水浴振蕩酶解4 h，隨后在沸水中滅酶15 min，冷卻后以8 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液進(jìn)行陶瓷膜分離，除去懸浮物和大分子物質(zhì)，即得到酶解液。

1.3.2 遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解液的超濾分離

將酶解液依次通過(guò)截留分子質(zhì)量為10、5、1 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾分為4個(gè)組分：>10 kDa、10～5 kDa、5～1 kDa、<1 kDa，分別測(cè)定其XO抑制率。

1.3.3 凝膠色譜分離

從4個(gè)超濾組分選擇其中XO抑制率最高的組分進(jìn)行凝膠色譜分離，檢測(cè)214 nm處的波長(zhǎng)，普通玻璃層析柱26 mm×100 cm，G-15凝膠高度為85 cm，確定最佳條件為：上樣量8 mL，上樣質(zhì)量濃度20 g/L，流速為1.1 mL/min。收集并濃縮各洗脫峰，測(cè)出XO抑制率(根據(jù)1.2.3中的方法)，活性最高的組分繼續(xù)用反相液相色譜進(jìn)行純化分離。

1.3.4 反相高效液相色譜(reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)分離

色譜柱：Phenomenex Synergi 4 μm Hydro-RP(150 mm×10 mm)，流動(dòng)相A：含0.1%三氟乙酸的超純水，流動(dòng)相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈(色譜純)，在25 min內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣量50 μL，進(jìn)樣質(zhì)量濃度2 g/L，流速2 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，多次重復(fù)進(jìn)樣收集各洗脫峰，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后調(diào)至一致濃度測(cè)XO抑制率。

1.3.5 超高效液相串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time of flight tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)鑒定

將樣品用去離子水稀釋至50 μg/mL。進(jìn)樣條件：進(jìn)樣量20 μL，流速10 μL/min；離子源條件：毛細(xì)管電壓3.0 k，錐孔電壓40 V，偏差控制80，正離子模式，噴霧溫度400 ℃，二級(jí)質(zhì)譜電壓源25.0 kV。

1.3.6 XO抑制率的測(cè)定

于96孔板中每孔加入50 μL待測(cè)樣品及50 μL濃度為0.05 U/mL的XO溶液，振蕩30 s，于25 ℃條件下保溫5 min，再加入150 μL 0.48 mmol/L的黃嘌呤溶液，振蕩30 s后，于25 ℃條件下保溫25 min，測(cè)定290 nm處的吸光度值[14]。XO抑制率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：D1，加酶樣品溶液的吸光度值；D2，不加酶樣品溶液的吸光度值；D3，用緩沖液代替樣品溶液的空白組的吸光度值；D4，不加酶空白組的吸光度值。

1.3.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞從-80 ℃冰箱取出后，立即放入37 ℃水浴鍋中解凍，移入盛有1 mL完全培養(yǎng)基[DMEM/F12+10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清+1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗]的15 mL離心管中，在1 000 r/min、4 ℃下離心5 min，棄去上清液，加入1 mL完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，隨后移入25 cm培養(yǎng)瓶，再加入4 mL完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打均勻，放入含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，每48 h換1次培養(yǎng)基。

1.3.7.2 反相液相法檢測(cè)細(xì)胞上清液中尿酸及其前體物質(zhì)的含量

取細(xì)胞上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，使用Waters Symmetry C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱進(jìn)行分析，流動(dòng)相A：0.2 mol/L KH2PO4、0.52 mmol/L戊烷磺酸鈉；流動(dòng)相B：0.2 mol/L KH2PO4、0.52 mmol/L戊烷磺酸鈉、10%乙腈；在50 min內(nèi)梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速0.8 mL/min。

1.3.7.3 高尿酸模型的建立

將細(xì)胞于2×105cell/mL接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入含1 mmol/L腺苷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再0.05 U/mL XO培養(yǎng)2 h，取上清液檢測(cè)。

1.3.7.4 苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸(Phe-Leu-Arg，F(xiàn)LR)與精氨酸-脯氨酸-賴氨酸(Arg-Pro-Lys，RPK)對(duì)高尿酸細(xì)胞的降尿酸作用

實(shí)驗(yàn)分為9組：空白組、模型組、FLR高劑量組、FLR中劑量組、FLR低劑量組、RPK高劑量組、RPK中劑量組、RPK低劑量組、陽(yáng)性組(別嘌呤醇組)。將細(xì)胞以2×105cell/mL接種于6孔板，培養(yǎng)至貼壁穩(wěn)定后，第一步空白組、模型組加入完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性組加入含0.1 mmol/L別嘌呤醇的完全培養(yǎng)基，樣品組(肽組)分別加入含高(2 mmol/L)、中(1 mmol/L)、低(0.5 mmol/L)3種濃度的肽溶液完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，第二步空白組加入完全培養(yǎng)基，其余8組加入含2.0 mmol/L腺苷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再加入0.05 U/mol XO培養(yǎng)2 h，取上清液測(cè)定尿酸含量。

1.3.7.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以1×105cell/mL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度多肽培養(yǎng)24 h，再加入10 μL CCK8溶液培養(yǎng)1 h，測(cè)450 nm處吸光度，細(xì)胞存活率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A樣，加入多肽的吸光度；A空，不加多肽的吸光度。

1.3.7.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

提取細(xì)胞總蛋白，提取方法：棄去上清液，用預(yù)冷PBS清洗3次，每孔加入200 μL細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮快速將細(xì)胞刮下來(lái)，移入1.5 mL PE管中，置于冰上裂解30～40 min，裂解中途用旋渦振蕩器振蕩1～2次，每次5～10 s，使細(xì)胞充分裂解，以12 000 r/min、15 min離心，小心取上清液檢測(cè)。凋亡相關(guān)指標(biāo)Casp-1、GSDMD、IL-1β、NLRP3的含量根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明(江蘇酶免生物技術(shù)有限公司的ELISA試劑盒)，按步驟操作。其原理是利用抗原抗體之間專一性結(jié)合的特征，對(duì)樣本進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.3.7.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用Graphpad prism統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05表示差異顯著。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾組分的XO抑制活性

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多肽活性與分子質(zhì)量大小緊密相關(guān)，XO抑制肽通常為2～10個(gè)氨基酸組成，且分子質(zhì)量<1 kDa的肽[21]。盛周煌[15]利用5 kDa和3 kDa的超濾膜對(duì)羅非魚皮膠原蛋白酶解液進(jìn)行分離，收集到3個(gè)組分：>5 kDa、5～3 kDa、<3 kDa，發(fā)現(xiàn)<3 kDa組分的XO抑制率最佳。遠(yuǎn)東擬沙丁魚酶解液經(jīng)過(guò)超濾膜分離獲得4個(gè)組分，即>10 kDa、10～5 kDa、5～1 kDa、<1 kDa，XO抑制活性的IC50值分別為62.51、51.06、45.65、15.89 g/L；因此，選擇<1 kDa XO抑制活性最強(qiáng)組分進(jìn)行進(jìn)一步譜分離純化。HE等[13]從鰹魚酶解物中分離鑒定出13種具有XO抑制活性的二肽和三肽。MUROTA等[16]發(fā)現(xiàn)鯊魚軟骨水提物中分子質(zhì)量為686.64 Da的五肽YLDNY，口服和靜脈注射均顯示出顯著的降尿酸活性。本研究結(jié)果與其上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，小分子肽的XO抑制活性更強(qiáng)。

2.2 凝膠、高效液相色譜分離

通過(guò)超濾得到的<1 kDa的組分經(jīng)G-15葡聚凝膠進(jìn)行分離，結(jié)果如圖1-a所示，凝膠色譜分離出5個(gè)洗脫峰，分別標(biāo)記為F1、F2、F3、F4、F5，將F1～F5分別收集，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，調(diào)至同一濃度后測(cè)定其XO抑制率，組分F2的抑制活性最高，IC50值為6.099 g/L，與<1 kDa組分相比，XO抑制活性提高了2.6倍。鄒琳等[14]將鰹魚酶解液經(jīng)膜分離純化后，分子質(zhì)量在600～1 000 Da的組分XO抑制活性最高，其IC50值為9.18 g/L。因此選擇組分F2繼續(xù)進(jìn)行RP-HPLC分離。

凝膠組分F2經(jīng)過(guò)RP-HPLC分離，結(jié)果如圖1-b所示，主要收集到6個(gè)吸收峰，標(biāo)記為F2-1、F2-2、F2-3、F2-4、F2-5、F2-6，把6個(gè)組分收集濃縮，測(cè)得XO抑制率，結(jié)果顯示，組分F2-1的抑制活性最高，IC50值為0.499 g/L；組分F2-4抑制活性次之，IC50值為0.712 g/L。并且F2-1和F2-4的峰面積占6個(gè)組分的70.62%，為凝膠組分F2的主要成分。MUROTA等[16]通過(guò)RP-HPLC對(duì)鯊魚軟骨堿性蛋白酶消化液進(jìn)行分離純化，收集具有大吸收峰的組分進(jìn)行下一步質(zhì)譜鑒定。因此選擇組分F2-1、F2-4進(jìn)行UPLC-MS/MS結(jié)構(gòu)鑒定。

a-凝膠過(guò)濾分離色譜圖；b-反相高效液相分離色譜圖圖1 <1 kDa組分的色譜分離圖Fig.1 Chromatogram of component less than 1 kDa

2.3 氨基酸序列鑒定

質(zhì)譜鑒定主要根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜中信號(hào)峰的相對(duì)豐度或者信號(hào)峰的質(zhì)荷比選擇母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，母離子通常為相對(duì)豐度最大或質(zhì)荷比值最高的信號(hào)峰。將組分F2-1和F2-4用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2、圖3所示，組分F2-1的一級(jí)質(zhì)譜圖如圖2-a所示，質(zhì)荷比(m/z)為435.28的峰對(duì)應(yīng)母離子[M+H]+的信號(hào)，隨后選擇豐度最高的母離子[M+H]+(m/z=435.28)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。組分F2-4的一級(jí)質(zhì)譜圖如圖3-a所示，選擇質(zhì)荷比最大(m/z=400.21)的信號(hào)峰作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。

a-組分F2-1一級(jí)質(zhì)譜圖；b-組分F2-1二級(jí)質(zhì)譜圖圖2 F2-1質(zhì)譜鑒定圖Fig.2 Mass spectrum of F2-1

a-組分F2-4一級(jí)質(zhì)譜圖;b-組分F2-4二級(jí)質(zhì)譜圖圖3 F2-4質(zhì)譜鑒定圖Fig.3 Mass spectrum of F2-4

在串聯(lián)質(zhì)譜中，主要通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子來(lái)推測(cè)氨基酸序列，碎片離子主要分為C-端(由x、y、z代表)和N-端(由a、b、c代表)[22]。多肽鏈中酰胺鍵更容易斷裂，所以更大幾率出現(xiàn)b型和y型的離子[23]。由此來(lái)推測(cè)母離子[M+H]+(m/z=435.28)和母離子[M+H]+(m/z=400.21)的氨基酸序列。如圖2-b所示，碎片離子y1的m/z=175.118 8，對(duì)應(yīng)片段-Arg的相對(duì)分子質(zhì)量，碎片離子y2的m/z=271.177 3，對(duì)應(yīng)片段-Leu-Arg的相對(duì)分子質(zhì)量，碎片離子b1的m/z=166.08，對(duì)應(yīng)為Phe-的相對(duì)分子質(zhì)量，所以鑒定其氨基酸序列為苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸(Phe-Leu-Arg(FLR)，Mw=435.2U)。同理，如圖3-b所示，碎片離子b1的m/z=178.134 1，對(duì)應(yīng)片段Arg-的相對(duì)分子質(zhì)量，碎片離子b2的m/z=251.150 8，對(duì)應(yīng)片段Arg-Pro-的相對(duì)分子質(zhì)量，碎片離子y2的m/z=223.155 7，對(duì)應(yīng)片段-Pro-Lys的相對(duì)分子質(zhì)量，所以鑒定其氨基酸序列為精氨酸-脯氨酸-賴氨酸(Arg-Pro-Lys(RPK)，Mw=400.21 U)。LI等[8]從金槍魚魚水解物中提取鑒定出三肽WML，具有較高的XO活性，通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)主要是其中的疏水氨基酸進(jìn)入XO活性中心的疏水區(qū)，從而抑制XO的活性。MUROTA等[16]鑒定出具有XO抑制活性的13個(gè)二肽和三肽均含芳香族氨基酸：酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸，其中苯丙氨酸、色氨酸均為疏水氨基酸，而酪氨酸與苯丙氨酸結(jié)構(gòu)相似。本研究與其他研究者結(jié)果一致，鑒定出的2個(gè)三肽均含疏水氨基酸，其中FLR含苯丙氨酸、亮氨酸，RPK含脯氨酸。

2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

收集鑒定出的2個(gè)三肽，需確定它們的安全無(wú)毒性，如果對(duì)細(xì)胞有毒副作用，使用后影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，便失去了小分子活性肽無(wú)毒、易吸收等優(yōu)點(diǎn)的意義，則不能繼續(xù)使用。由圖4可知，經(jīng)過(guò)不同濃度肽、陽(yáng)性藥物處理的細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明在一定的濃度范圍內(nèi)給藥對(duì)HK-2無(wú)明顯細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞活力，后續(xù)實(shí)驗(yàn)在此濃度下進(jìn)行無(wú)藥物毒性影響。

圖4 不同濃度肽對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of different concentration peptides on cell survival注：未使用同一字母連接的水平存在顯著差異(P<0.05)(下同)

2.5 FLR、RPK對(duì)細(xì)胞上清液中尿酸及其前體物質(zhì)水平的影響

目前，對(duì)高尿酸細(xì)胞模型的研究中，通過(guò)添加尿酸前體物很難構(gòu)建高尿酸細(xì)胞模型，需另添加外源酶催化前體物以顯著增加尿酸含量。HOU等[24]通過(guò)單因素試驗(yàn)，篩選用于構(gòu)建高尿酸細(xì)胞模型的物質(zhì)，最終采用腺苷和XO聯(lián)合構(gòu)建高尿酸細(xì)胞模型，顯著增加尿酸及其前體物質(zhì)含量。李寧娟[25]同樣通過(guò)外源性XO結(jié)合腺苷構(gòu)建高尿酸細(xì)胞模型，檢測(cè)得細(xì)胞上清液尿酸水平為(1.52±0.02) mmol/L，達(dá)到高尿酸血癥患者的尿酸水平。圖5-a為細(xì)胞上清液中嘌呤相關(guān)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品圖，對(duì)應(yīng)圖5-c中正常細(xì)胞上清液中尿酸及次黃嘌呤的含量，通過(guò)腺苷和XO聯(lián)合造模后，根據(jù)圖5-d可以看出尿酸和次黃嘌呤的含量明顯增加，上清液中尿酸水平為735.92 μmol/L，達(dá)到高尿酸血癥患者的尿酸水平，并且出現(xiàn)了通過(guò)XO催化次黃嘌呤產(chǎn)生的黃嘌呤，說(shuō)明造模成功。圖5-b顯示，樣品組(肽組)尿酸含量顯著低于模型組，其中FLR和RPK的中、低劑量組降尿酸效果均優(yōu)于其高劑量組，并且FLR低劑量組的尿酸含量顯著低于空白組，與別嘌呤醇的降尿酸效果無(wú)顯著性差異，顯示出優(yōu)越的降尿酸活性。說(shuō)明FLR、RPK的降尿酸效果無(wú)劑量依賴性。

a-尿酸及其前體物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；b-各組尿酸含量；c-正常細(xì)胞上清液尿酸及其前體物含量；d-模型組細(xì)胞上清液尿酸及其前體物含量圖5 細(xì)胞上清液中嘌呤相關(guān)物質(zhì)含量Fig.5 Purine related substances in cell supernatant

2.6 細(xì)胞凋亡情況

高尿酸血癥往往伴隨著炎癥的發(fā)生，是由于高尿酸導(dǎo)致炎癥體Caspase-1/4/5/11的激活，切割一個(gè)叫做GSDMD的蛋白而誘發(fā)細(xì)胞凋亡(細(xì)胞膜破裂)，從而釋放大量炎性因子(IL-18、IL-1β、NLRP3等)[26]，造成炎癥。由圖6-a可知，模型組Caspase-1含量顯著高于其他組，其中FLR高、中、低劑量組、RPK低劑量組Caspase-1含量無(wú)顯著性差異，RPK高劑量組Caspase-1含量顯著高于中劑量組，中劑量組顯著高于低劑量組，陽(yáng)性組Caspase-1含量顯著低于肽組，說(shuō)明FLR、RPK各濃度均能顯著降低Caspase-1含量，但RPK高、中劑量組效果沒(méi)有低劑量組效果好。由圖6-b可知，模型組和RPK高劑量組的GSDMD含量顯著高于其他組，RPK高劑量組不能顯著降低GSDMD含量，說(shuō)明FLR高、中、低劑量、RPK中、低劑量均能顯著降低GSDMD含量，降低效果與陽(yáng)性藥物無(wú)顯著性差異。由圖6-c可知，模型組IL-1β含量顯著高于其他組，其中FLR中、低劑量組、RPK低劑量組、陽(yáng)性組IL-1β含量顯著低于FLR高劑量組、RPK高、中劑量組、空白組，說(shuō)明FLR、RPK各濃度、陽(yáng)性藥物均能顯著降低(P<0.05)IL-1β含量，其中FLR高劑量、RPK高、中劑量能將IL-1β含量降低至空白組水平，F(xiàn)LR中、低劑量、RPK低劑量、陽(yáng)性藥物能將IL-1β含量降低至空白組水平以下。由圖6-d可知，模型組NLRP3含量顯著高于其他組，F(xiàn)LR高、中、低劑量組中NLRP3含量顯著低于空白組，其中FLR高、中劑量?jī)?yōu)于低劑量，RPK高劑量組NLRP3含量顯著低于模型組，但顯著高于空白組，RPK中劑量組NLRP3含量與空白組無(wú)顯著性差異，RPK低劑量組NLRP3含量顯著低于空白組，說(shuō)明FLR高、中劑量組降低NLRP3含量效果最優(yōu)，其次依次是RPK低劑量組、FLR低劑量組、陽(yáng)性組、RPK中劑量組，RPK高劑量組不能將NLRP3含量將至空白組水平。FLR、RPK對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白均有抑制作用，各劑量的抑制效果有或多或少的差異，總的來(lái)說(shuō)低劑量組優(yōu)于中、高劑量組。

a-Casp-1的含量；b-GSDMD的含量；c-IL-1β的含量；d-NLRP3的含量圖6 FLR、RPK對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響Fig.6 Effects of FLR and RPK on related apoptosis indexes

3 結(jié)論

遠(yuǎn)東擬沙丁魚肉加入堿性蛋白酶酶解，酶解液中XO抑制肽主要分布在分子質(zhì)量<1 000 Da的超濾組分中；通過(guò)凝膠色譜分離、反相高效液相分離對(duì)分子質(zhì)量<1 000 Da的超濾組分進(jìn)行分離純化，UPLC-MS/MS進(jìn)行氨基酸序列鑒定，得到兩個(gè)XO抑制肽，一個(gè)為FLR，分子質(zhì)量435.28 Da，IC50值為0.499 g/L；另一個(gè)為RPK，分子質(zhì)量400.21 Da，IC50值為0.712 g/L，與<1 000 Da的超濾組分相比，IC50值提高了20～30倍。通過(guò)高尿酸細(xì)胞模型進(jìn)一步驗(yàn)證了FLR、RPK具有顯著降尿酸活性，檢測(cè)胞漿內(nèi)炎癥小體、炎癥因子的水平，結(jié)果顯示FLR、RPK具有改善炎癥的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為遠(yuǎn)東擬沙丁魚的高值化利用提供理論依據(jù)，同時(shí)也為食源性降尿酸肽的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)遠(yuǎn)東擬沙丁魚XO抑制肽的體外活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，下一步應(yīng)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)XO抑制肽的體內(nèi)降尿酸活性。