明膠基高內(nèi)相乳液在辣椒素負(fù)載中的應(yīng)用

張櫸，杜杰，王洪霞，馮鑫，張宇昊,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(西南大學(xué)，生物學(xué)研究中心，重慶，400715)

辣椒素(capsaicin,CAP)是辣椒中呈現(xiàn)辣味的主要成分之一，本身不提供能量。近年來(lái)的研究證實(shí)辣椒素具有控制血壓、調(diào)節(jié)血脂、抑制脂肪堆積、鎮(zhèn)痛等多種功能，從而具有控制體重、改善由肥胖引起的糖耐受量受損及慢性疼痛等慢性疾病調(diào)理方面的應(yīng)用前景[1]。然而辣椒素的攝入會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的灼燒感，對(duì)鼻腔、食道及胃腸道黏膜造成刺激[2]，極大地限制了辣椒素在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，辣椒素的低水溶性導(dǎo)致其在水介質(zhì)中難以擴(kuò)散，胃腸消化中生物可及性低。因此降低其對(duì)機(jī)體的刺激性、提高辣椒素的生物可及性對(duì)辣椒素的應(yīng)用具有重要意義。利用O/W型乳液對(duì)脂溶性生物活性成分進(jìn)行包埋是活性成分保護(hù)和提高其生物利用率的有效途徑[3]。

本課題組前期的研究表明可以通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TG)改性明膠制備具有高熱穩(wěn)定性和良好貯存穩(wěn)定性的高內(nèi)相乳液(high internal phase emulsions，HIPEs)[4]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，將辣椒素溶解于大豆油中，制備負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs，探究負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs的外觀、微觀結(jié)構(gòu)及流變學(xué)特性，并研究了HIPEs包埋及TG酶交聯(lián)時(shí)間對(duì)辣椒素氣味的掩蓋作用。進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)態(tài)體外胃消化和靜態(tài)體外消化模擬實(shí)驗(yàn)研究了辣椒素在HIPEs中的釋放特性和生物可及性等，旨在為降低辣椒素刺激性并提高其生物可及性提供理論指導(dǎo)，并為明膠基HIPEs的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

A型明膠(來(lái)源于豬皮)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；大豆油(購(gòu)于重慶市永輝超市，未經(jīng)純化)，九三集團(tuán)；TG酶(標(biāo)稱酶活200 IU)，上海Foodchem化工有限公司；胃蛋白酶(1∶10 000)，德國(guó)BioFroxx生物試劑；脂肪酶(1∶100 000)，上海Macklin生化科技有限公司；辣椒素，上海笛柏生物科技有限公司；膽鹽，上海生工生物工程股份有限公司；無(wú)水乙醇，重慶市鈦新化工有限公司；氫氧化鈉、鹽酸，成都市科隆化學(xué)品有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA 3003B電子天平，上海精天電子儀器有限公司；QL 901 Vortex渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?，上海新諾儀器設(shè)備有限公司；PE 20實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Heraeus Multifuge X3R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；BX 53 正置熒光電子顯微鏡，日本OLYMPUS公司；T 18 高速分散器，美國(guó)IKA公司；MCR 302流變儀，澳大利亞ANTON PAAR公司；KQ-100B超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；DHSI-Ⅳ動(dòng)態(tài)仿生消化儀，蘇州曉東宜健儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 負(fù)載辣椒素的HIPEs的制備

將A型豬皮明膠加入去離子水中，在25 ℃下溶脹1 h后在60 ℃下攪拌孵育30 min。冷卻至室溫后用0.5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。將提前預(yù)熱至45 ℃的TG酶溶液(2 mg/mL)添加到明膠溶液中，TG酶與明膠的質(zhì)量比為0.002∶1，使體系中明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。在45 ℃下分別水浴0、1、2、4 h后，沸水浴處理10 min滅酶。最后使用0.5 mol/L HCl將混合物的pH值調(diào)節(jié)至5.0。以溶解有辣椒素的大豆油為油相，制備負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs，置于4 ℃冰箱中備用。根據(jù)不同TG酶交聯(lián)時(shí)間(0～4 h)，負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs樣品編碼為GT0-CAP、GT1-CAP、GT2-CAP和GT4-CAP，未負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs樣品編碼為GT0、GT1、GT2和GT4，溶解有相同辣椒素含量的大豆油編碼為free-CAP。

1.3.2 辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參考GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)測(cè)定方法》及高艷[5]測(cè)定辣椒素的方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)樣品中的辣椒素含量進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，辣椒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=0.200 7x+0.005，R2=0.999 9。

辣椒素濃度的計(jì)算方法見(jiàn)公式(1)：

(1)

式中：W為樣品中辣椒素含量，mg/mL；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查到的辣椒素含量，μg/mL；50為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 乳液的外觀及微觀結(jié)構(gòu)

觀察并拍攝乳液的外觀圖像，從宏觀相行為角度評(píng)估乳液形成好壞程度。將乳液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，使用正置熒光光學(xué)顯微鏡(BX53，OLYMPUS)觀察和拍攝HIPEs的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.4 流變學(xué)行為測(cè)定

使用流變儀對(duì)乳液進(jìn)行流變學(xué)測(cè)量。在所有實(shí)驗(yàn)中均使用鋼板(直徑25 mm，間隙1 mm)，頻率為1 Hz，溫度為25 ℃。穩(wěn)態(tài)剪切測(cè)試：固定溫度為25 ℃，在0.1～100 s-1的剪切速率下進(jìn)行穩(wěn)態(tài)剪切測(cè)試以獲得HIPEs的黏度變化曲線。頻率掃描測(cè)試：設(shè)置溫度恒定為25 ℃，應(yīng)變值恒定為0.5%，在0.1～100 rad/s的角頻率范圍內(nèi)對(duì)HIPEs進(jìn)行小振幅振蕩頻率掃描測(cè)試。

1.3.5 電子鼻測(cè)定

參照李穎慧等[6]的方法，取free-CAP(7.5 mL)和辣椒素HIPEs(10 mL)于30 mL進(jìn)樣瓶中，在25 ℃下平衡30 min后測(cè)試，測(cè)試流速為1 mL/min，清洗和測(cè)試時(shí)間均為60 s。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定4次，使用電子鼻設(shè)備自帶的軟件enose進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括主成分分析(principal component analysis,PCA)和線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)。

1.3.6 動(dòng)態(tài)體外胃消化模擬模型及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

參考體內(nèi)消化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)動(dòng)態(tài)體外胃消化模擬模型參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，相關(guān)儀器運(yùn)行參數(shù)如下：

實(shí)驗(yàn)溫度為37 ℃。模擬胃液的配方參考靜態(tài)體外消化實(shí)驗(yàn)中使用的胃模擬液，胃蛋白酶于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前加入，即配即用。消化過(guò)程中的其他參數(shù)如表1所示。消化過(guò)程中每30 min收集一次消化樣品，立即測(cè)定其pH值，記錄消化過(guò)程中胃糜樣品的pH值變化情況。同時(shí)記錄每次消化樣品的重量以得到胃排空曲線，計(jì)算消化過(guò)程中排出的樣品占用樣品初始總質(zhì)量的比值，得到胃內(nèi)剩余樣品的占比，計(jì)算公式見(jiàn)公式(2)：

表1 動(dòng)態(tài)仿生消化設(shè)備運(yùn)行參數(shù)Table 1 Operating parameters of dynamic bionic digestion equipment

(2)

式中：m1表示累計(jì)排出的胃糜液體的質(zhì)量，g；m2表示用于動(dòng)態(tài)體外消化的樣品總質(zhì)量，g；V表示取樣時(shí)累計(jì)加入的消化液的體積，mL；ρ表示消化液的密度，g/mL。

參照1.3.2中的方法測(cè)定釋放至消化液中的辣椒素含量。

1.3.7 靜態(tài)體外消化模擬模型

參照WINUPRASITH等[7]的方法配制模擬胃腸液：模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)pH 2.0，模擬腸液(simulated intestinal fluid，SIF)pH 7.0。

胃消化階段：將4 mL辣椒素HIPEs與16 mL SGF混合在一起，將混合體系pH調(diào)節(jié)至2.0后加入胃蛋白酶(3.2 mg/mL)，在恒溫水浴搖床中以100 r/min的轉(zhuǎn)速連續(xù)旋轉(zhuǎn)2 h。腸消化階段：將胃消化后的樣品pH調(diào)至7.0結(jié)束胃消化。加入6.0 mL SIF和14 mL 膽汁鹽(5.0 mg/mL)，調(diào)節(jié)體系pH至7.0，5 min 后加入脂肪酶(1.6 mg/mL)，使用磁力攪拌以100 r/min的轉(zhuǎn)速模擬腸道蠕動(dòng)。腸消化期間持續(xù)監(jiān)測(cè)體系pH，每隔5 min使用0.15 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH，使pH維持在7.0，并記錄消耗的NaOH的體積持續(xù)3 h。整個(gè)胃、腸消化階段體系溫度保持在37 ℃。

1.3.8 脂質(zhì)消化的測(cè)定

脂質(zhì)消化測(cè)定方法參考BELLESI等[8]的方法。通過(guò)腸消化階段中所用的NaOH溶液量計(jì)算得到從乳液中釋放出的游離脂肪酸含量(free fatty acid,FFA)，計(jì)算方法見(jiàn)公式(3)：

(3)

式中：CNaOH為使用的NaOH溶液的摩爾濃度，mol/L；VNaOH為消耗的NaOH溶液的體積，mL；Mw為該油的平均摩爾量，880 g/mol；m為HIPEs中大豆油的總質(zhì)量，g。

1.3.9 辣椒素生物可及性測(cè)定

參考古成[9]的方法測(cè)定辣椒素的生物可及性。將消化后的混合物在4 ℃下10 000 r/min離心30 min，中間的清液層為混合膠束相。一般認(rèn)為經(jīng)過(guò)消化后溶解于混合膠束相的辣椒素可以穿過(guò)黏液層輸送到上皮細(xì)胞，因此測(cè)定混合膠束相中的辣椒素含量可用于分析辣椒素的生物可及性，計(jì)算方法見(jiàn)公式(4)：

生物可及性/%

(4)

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件IBM SPSS 19.0進(jìn)行分析數(shù)據(jù)，Origin 9.0用于繪制圖形。每次實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，同時(shí)采用Duncan檢驗(yàn)結(jié)果分析數(shù)據(jù)之間的差異(P<0.05則數(shù)據(jù)間存在顯著性差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs的外觀和微觀圖像分析

前期研究已經(jīng)證明，2%的明膠微凝膠制備的油相為75%的HIPEs較為穩(wěn)定[4]。由圖1可觀察到負(fù)載了辣椒素的明膠基HIPEs仍舊具有較高的黏度，倒置時(shí)保持在玻璃瓶底部而不流動(dòng)。由光鏡圖可知，乳液的液滴尺寸分布均一，與未負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs對(duì)比，3 mg/mL辣椒素的荷載對(duì)HIPEs的粒徑略有降低，這可能是因?yàn)槔苯匪氐奶砑邮垢嗟拿髂z在界面排布，進(jìn)一步減小了液滴尺寸。還可觀察到TG酶交聯(lián)時(shí)間對(duì)乳液液滴尺寸無(wú)明顯影響。

a～c-負(fù)載;d-未負(fù)載圖1 負(fù)載與未負(fù)載辣椒素明膠基HIPEs的外觀和微觀圖像Fig.1 Appearance and microscopic images of gelatin-based HIPEs loadedand unloadedcapsaicin

2.2 負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs的流變學(xué)行為分析

由圖2可以看到，明膠基HIPEs的黏度隨著剪切速率的升高逐漸降低，呈現(xiàn)出剪切變稀的特征，屬于非牛頓流體。辣椒素的添加及TG酶交聯(lián)時(shí)間對(duì)明膠基HIPEs黏度沒(méi)有明顯影響，與宏觀觀察的結(jié)果一致，可能的原因是油相含量高(>74%)，而明膠連續(xù)相(<26%)、辣椒素(3 mg/mL)的占比相對(duì)較低，因此TG酶、辣椒素對(duì)乳液黏度的影響可以忽略不計(jì)。

a-交聯(lián)時(shí)間為0 h；b-交聯(lián)時(shí)間為1 h；c-交聯(lián)時(shí)間為2 h；d-交聯(lián)時(shí)間為4 h圖2 負(fù)載與未負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs的黏度變化曲線Fig.2 Viscosity of gelatin based HIPEs loaded and unloaded with capsaicin

圖3展示了HIPEs的模量隨角頻率變化的曲線，G′基本高于G″，表明HIPEs具有較強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，體系由彈性結(jié)構(gòu)主導(dǎo)，頻率依賴性變化較小。由圖3可知，TG酶交聯(lián)提升了乳液的模量，因?yàn)門G酶交聯(lián)增加了明膠鏈的長(zhǎng)度，水相明膠分子鏈纏結(jié)增加，從而明顯增強(qiáng)了乳液網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；當(dāng)負(fù)載辣椒素后，辣椒素中含有羥基等活性基團(tuán)，可能與明膠存在相互作用，導(dǎo)致吸附至界面的明膠增加，連續(xù)相中明膠含量減少，因此負(fù)載辣椒素的未交聯(lián)乳液表現(xiàn)出更低的模量；對(duì)比負(fù)載辣椒素的未交聯(lián)乳液模量和負(fù)載辣椒素的交聯(lián)乳液模量，可以發(fā)現(xiàn)隨著交聯(lián)度的增加，乳液的模量與未負(fù)載辣椒素的乳液模量逐漸接近，這可能是因?yàn)榻宦?lián)可能使界面明膠由膠體軟顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)檫B續(xù)的膠體層，從而限制了更多連續(xù)相中明膠向界面遷移，從而增加了負(fù)載辣椒素的交聯(lián)乳液的模量。整體上，明膠基辣椒素HIPEs仍舊表現(xiàn)為具有彈性主導(dǎo)的高黏彈性體系，GT1-CAP、GT2-CAP和GT4-CAP表現(xiàn)出較低的頻率依賴性。

a-交聯(lián)時(shí)間為0 h；b-交聯(lián)時(shí)間為1 h；c-交聯(lián)時(shí)間為2 h；d-交聯(lián)時(shí)間為4 h圖3 負(fù)載與未負(fù)載辣椒素的明膠基HIPEs的模量隨角頻率(0.1～100 rad/s)的變化曲線(G′為實(shí)心符號(hào)曲線，G″為空心符號(hào)曲線)Fig.3 The modulus of gelatin based HIPEs loaded and unloaded with capsaicin varies with angular frequency (0.1-100 rad/s)

2.3 電子鼻分析

電子鼻是一種快速檢測(cè)樣品中揮發(fā)性成分的新型人鼻模擬仿生氣味掃描儀，具有快速、客觀、重現(xiàn)性好、便捷等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于食品的分析檢測(cè)[10]。圖4展示了分別使用PCA和LDA分析的結(jié)果，第一主成分和第二主成分的累積貢獻(xiàn)率大于92%，基本可以代表樣品的主要?dú)馕缎畔ⅰD4中每個(gè)三角形分別代表不同樣品的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)，三角形在圖中的距離遠(yuǎn)近代表樣品間的氣味差異大小[11]。由圖4-a可知，GT0-CAP和GT1-CAP存在部分重疊，說(shuō)明這2組樣品間氣味相似，同樣的情況也出現(xiàn)在GT2-CAP和GT4-CAP之間，但乳液組與溶解有辣椒素的游離大豆油組(free-CAP)相互獨(dú)立，說(shuō)明使用明膠基HIPEs包埋后的辣椒素氣味與溶解在大豆油中的游離辣椒素有明顯差異。由圖4-b可知，與PCA相比，LDA得到的結(jié)果更加集中，對(duì)不同的樣品分類更明顯，這樣的現(xiàn)象在先前的研究中也有出現(xiàn)[6]。由于第一主成分的貢獻(xiàn)率大于99%，樣品間的差異主要體現(xiàn)在橫軸方向上的距離大小[12]。值得注意的是，隨著TG酶交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，辣椒素HIPEs的氣味與游離辣椒素的氣味之間的差別逐漸增大，GT4-CAP與free-CAP的差距最大。這可能是因?yàn)門G酶催化的靶向共價(jià)交聯(lián)導(dǎo)致連續(xù)相結(jié)構(gòu)更緊密，對(duì)內(nèi)部油滴中荷載的辣椒素氣味的封閉效果更好。通過(guò)比較樣品間的距離可發(fā)現(xiàn)，HIPEs包埋對(duì)辣椒素的氣味有明顯的掩蓋作用，且交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)有利于形成更緊密的連續(xù)相結(jié)構(gòu)，從而對(duì)辣椒素的氣味進(jìn)行更好地掩蓋，這為辣椒素的應(yīng)用模式提供了依據(jù)。

a-PCA圖;b-LDA圖圖4 溶解在大豆油中的游離辣椒素(free-CAP)和具有不同TG酶交聯(lián)時(shí)間(0～4 h)的明膠基辣椒素HIPEs的電子鼻分析Fig.4 Electronic nose analysis of free capsaicin (free-CAP) and capsaicin-loaded HIPEs stabilized by gelatin with different TG crosslinking time (0～4 h)

2.4 辣椒素的動(dòng)態(tài)胃消化分析

辣椒素對(duì)胃的灼傷作用限制了其在醫(yī)療、食品等方向的應(yīng)用，降低和減緩辣椒素在胃中的釋放有利于保護(hù)胃黏膜免受辣椒素的灼傷。已有研究表明，微膠囊和乳液等包埋手段可以有效減緩辣椒素的釋放，減輕辣椒素對(duì)小鼠胃黏膜的刺激作用[13-14]。為進(jìn)一步探究明膠基辣椒素HIPEs在胃消化過(guò)程中其微觀結(jié)構(gòu)的變化情況及其對(duì)辣椒素的緩釋作用，采用動(dòng)態(tài)仿生胃消化儀器進(jìn)行了動(dòng)態(tài)體外胃消化研究，設(shè)備具體示意圖如圖5-a所示。

消化過(guò)程中胃內(nèi)食糜的pH值根據(jù)所攝取食物的量和食物本身的緩沖能力而變化[15]，胃排空和胃液分泌將有助于消化過(guò)程中胃內(nèi)食糜pH值的持續(xù)降低[16]。如圖5-b所示，食物的攝入導(dǎo)致前期(0～30 min)胃中的pH值從2.0上升至3.5左右，這與攝入食物的稀釋作用有關(guān)。隨著胃排空作用和胃液的持續(xù)分泌，胃中pH值逐漸下降，到消化終止時(shí)恢復(fù)至禁食狀態(tài)(pH 2.0左右)，與先前的研究結(jié)果基本一致[17]。

動(dòng)態(tài)胃消化過(guò)程胃內(nèi)剩余樣品質(zhì)量隨時(shí)間的變化曲線如圖5-c所示。各組樣品均在消化60 min內(nèi)完成半數(shù)排空，胃消化的前30 min，大豆油的排空速度最快，隨著消化的進(jìn)行，各組樣品的排空速率逐漸降低，總體排空趨勢(shì)相似。在消化終止時(shí)，胃內(nèi)剩余量均低于20%，基本符合先前報(bào)道的體內(nèi)排空曲線[18]。胃內(nèi)食糜pH變化曲線和胃內(nèi)剩余量變化曲線符合已報(bào)道的體內(nèi)變化規(guī)律，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的運(yùn)動(dòng)參數(shù)下，DHSI-IV動(dòng)態(tài)仿生胃系統(tǒng)能夠較為準(zhǔn)確地模擬動(dòng)態(tài)胃消化過(guò)程。

a-動(dòng)態(tài)仿生胃設(shè)備示意圖;b-動(dòng)態(tài)胃消化過(guò)程中胃內(nèi)食糜pH值隨時(shí)間的變化曲線;c-動(dòng)態(tài)胃消化過(guò)程中胃內(nèi)剩余量曲線圖5 動(dòng)態(tài)仿生胃設(shè)備示意圖、動(dòng)態(tài)胃消化過(guò)程中胃內(nèi)食糜pH值隨時(shí)間的變化曲線和動(dòng)態(tài)胃消化過(guò)程中胃內(nèi)剩余量曲線Fig.5 Schematic diagram of dynamic bionic stomach equipment,variation curve of pH value of gastric chyme with time during dynamic gastric digestion and gastric retention curve during dynamic gastric digestion

由圖6-a可以看到，直接溶解于大豆油中的辣椒素在胃消化前期大量釋放，而包埋于明膠基HIPEs中的辣椒素在胃消化過(guò)程中的釋放率顯著降低，這可能是因?yàn)橹苯尤苡诖蠖褂椭械睦苯匪厝狈θ橐航Y(jié)構(gòu)中外層蛋白的保護(hù)，從而在動(dòng)態(tài)胃消化過(guò)程中的模擬胃蠕動(dòng)下更易釋放至消化液中；同時(shí)HIPEs的高黏度也限制了胃蛋白酶的擴(kuò)散和液滴中辣椒素的擴(kuò)散速率。另外，TG酶交聯(lián)后的明膠穩(wěn)定的辣椒素HIPEs對(duì)辣椒素的緩釋作用顯著優(yōu)于未交聯(lián)明膠穩(wěn)定的HIPEs，這避免了辣椒素在胃中的突釋，對(duì)保護(hù)胃黏膜免受辣椒素刺激、促進(jìn)辣椒素的應(yīng)用有重要意義，與GUO等[19]的研究結(jié)果一致。

胃消化過(guò)程中，由于部分界面蛋白被胃蛋白酶水解，內(nèi)部油滴泄露，在仿生胃的蠕動(dòng)下液滴碰撞，泄露的油滴聚結(jié)在一起形成大的油滴[20]，從而導(dǎo)致乳液的失穩(wěn)。動(dòng)態(tài)體外消化過(guò)程中不同時(shí)間下樣品的外觀和微觀結(jié)構(gòu)圖像如圖6-b所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，胃消化30 min后，各組樣品的微觀和外觀無(wú)明顯變化，僅GT0-CAP的液滴間距離增大，這可能與連續(xù)相蛋白被部分降解及消化液的稀釋作用有關(guān)。主要的差異體現(xiàn)在胃消化60 min后，各組樣品均出現(xiàn)了不同程度的液滴聚結(jié)，同時(shí)伴有大油滴的產(chǎn)生，GT0-CAP液滴聚結(jié)程度最高。辣椒素的釋放曲線也顯示胃消化60 min后，GT0-CAP的釋放率明顯高于其余3組。從排出的食糜外觀照片可以看到，在消化后期(90～120 min)，由于胃排空作用，大部分乳液被排出，胃內(nèi)剩余的乳液較少，排出的食糜大部分為消化液。因此在光學(xué)顯微鏡下觀察到的液滴較少，GT4-CAP的液滴仍保持相對(duì)較小的狀態(tài)。這可能是因?yàn)門G酶交聯(lián)通過(guò)催化明膠中的靶向共價(jià)交聯(lián)促進(jìn)了緊密明膠共價(jià)骨架網(wǎng)絡(luò)的形成，在胃消化過(guò)程中其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)形成的空間位阻和更大的黏度阻礙了胃蛋白酶在界面的吸附，從而有效保護(hù)乳液液滴不被胃蛋白酶破壞，進(jìn)一步阻礙了辣椒素在胃中的釋放。

2.5 明膠基辣椒素HPIEs體外脂質(zhì)消化分析

為進(jìn)一步研究辣椒素在腸道內(nèi)的消化吸收情況，通過(guò)靜態(tài)體外消化模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)明膠基辣椒素HIPEs的脂質(zhì)消化過(guò)程進(jìn)行分析。脂質(zhì)在腸道中被脂肪酶水解為FFA，因此常采用FFA的釋放描述脂質(zhì)的消化情況，圖6-c展示了樣品在消化過(guò)程中的FFA釋放曲線。由圖6-c可以看到，F(xiàn)FA釋放發(fā)生在腸消化的整個(gè)階段，且隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)FA釋放量逐漸增加。經(jīng)過(guò)3 h的腸階段模擬消化后，含有辣椒素的游離大豆油的FFA釋放速率和釋放量最高(40.4%)，乳液樣品中GT0-CAP的FFA釋放量最高，為29.12%，并且隨著TG酶交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)FA釋放速率降低，最終釋放量也逐漸降低。原因可能是游離大豆油缺乏外層蛋白的保護(hù)，在膽鹽的乳化作用下更易與脂肪酶接觸，從而表現(xiàn)出更高的FFA釋放率。而在乳液體系中膽鹽需要先取代界面蛋白，脂肪酶才能進(jìn)一步與內(nèi)部的油滴接觸，在界面蛋白的保護(hù)下，內(nèi)部的油滴更難被水解，從而表現(xiàn)出比游離大豆油更低的FFA釋放率[8]。TG酶催化的靶向共價(jià)交聯(lián)促進(jìn)了HIPEs連續(xù)相形成更致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，延緩了膽鹽取代界面蛋白的速率，阻礙了內(nèi)部油滴與脂肪酶的接觸，從而降低了HIPEs中FFA的釋放速率和釋放量[21]。此外，從整體分析，無(wú)論是HIPEs還是游離的大豆油，其脂質(zhì)消化程度都較低，這與大豆油中較高的長(zhǎng)鏈脂肪酸含量有關(guān)，類似的結(jié)果在其他長(zhǎng)鏈油(如玉米油)的脂質(zhì)消化實(shí)驗(yàn)中也有報(bào)道[22]。

2.6 辣椒素生物可及性分析

先前的研究已證實(shí)，與直接將活性成分溶解在游離的油中相比，使用乳液荷載可更有效地提高活性成分的生物可及性[23]。如圖6-d所示，直接溶解在大豆油中的辣椒素的生物可及性最低(30.48%)，包埋在乳液體系中的辣椒素的生物可及性顯著升高(P<0.05)。一般認(rèn)為，活性成分從油相中的釋放與脂肪的水解密切相關(guān)，然而具有最高FFA釋放率的游離大豆油在生物可及性測(cè)定中卻表現(xiàn)出最低的生物可及性。同時(shí)乳液體系中，F(xiàn)FA釋放率隨TG酶交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但是其負(fù)載的辣椒素生物可及性卻并未如預(yù)期一樣逐漸降低，反而是GT0-CAP表現(xiàn)出最低的生物可及性。這可能歸因于TG酶交聯(lián)形成的高彈性乳液具有緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，減少了釋放油滴在消化過(guò)程中的聚集，從而增加了辣椒素在膠束相的保留量[24]，但是該改善作用與TG酶交聯(lián)時(shí)間無(wú)相關(guān)性。馮鑫[24]在由明膠納米顆粒穩(wěn)定的乳液對(duì)β-胡蘿卜素的包埋釋放研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的生物可及性與FFA釋放率不一致的現(xiàn)象。TAN等[25]認(rèn)為生物可及性與FFA釋放率的不一致的原因可能是殘留在體系中的明膠在膠束化過(guò)程中作為乳化劑促進(jìn)了活性成分的膠束化，從而提高其生物可及性。

a-辣椒素的釋放率;b-乳液外觀和微觀圖像;c-FFA釋放曲線;d-生物可及性圖6 動(dòng)態(tài)胃消化過(guò)程中辣椒素的釋放率、乳液外觀和微觀圖像、負(fù)載辣椒素的大豆油與具有不同TG酶交聯(lián)時(shí)間的明膠基辣椒素HIPEs的FFA釋放曲線和辣椒素的生物可及性Fig.6 Release rate of capsaicin and the appearance and microscopic images of the emulsion during dynamic stomach digestion,FFA release curve of capsaicin-loaded soybean oil and capsaicin-loaded HIPEs stabilized by gelatin with different TG crosslinking time and bioavailability of capsaicin 注：圖6-d中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

(1)明膠基HIPEs在負(fù)載辣椒素后乳液外觀、液滴分布和尺寸沒(méi)有明顯變化；辣椒素的負(fù)載輕微降低了明膠基HIPEs的模量，但對(duì)黏度及頻率依賴性沒(méi)有明顯影響，明膠基HIPEs仍表現(xiàn)為具有高黏度和較低頻率依賴性的彈性結(jié)構(gòu)主導(dǎo)體系。

(2)明膠基HIPEs包埋對(duì)辣椒素的氣味有明顯的掩蓋作用而且可顯著降低辣椒素在胃中的釋放量，TG酶交聯(lián)增強(qiáng)了HIPEs對(duì)辣椒素氣味的掩蓋作用，且可更好地防止辣椒素在胃中的突釋。

(3)與未交聯(lián)明膠穩(wěn)定的HIPEs相比，TG酶交聯(lián)明膠穩(wěn)定的HIPEs具有更致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，降低了膽鹽對(duì)界面蛋白的取代速率，阻礙了脂肪酶與油滴的接觸，從而降低了乳液體系中大豆油的脂質(zhì)消化率。另一方面，更強(qiáng)的凝膠結(jié)構(gòu)和更穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)減緩了液滴聚結(jié)，增加了辣椒素在膠束相中的保留率，從而使得辣椒素的生物利用率提高。