羅伊氏乳桿菌CCFM8631對由膽堿導(dǎo)致的血漿氧化三甲胺和盲腸三甲胺水平升高的影響

王茜茜，張婷，梁明*，趙建新，張灝，王剛*，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州，510645)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)主要包括缺血性心臟病和中風(fēng)等，是造成人類死亡的主要原因，也是致殘的重要因素[1-2]。我國是全球CVDs死亡人數(shù)最高的國家，并呈逐年上升的趨勢。在針對我國各省健康情況的全球疾病負(fù)擔(dān)2017中指出，我國死亡率最高的疾病是中風(fēng)和缺血性心臟病，中風(fēng)從1990年的第三位上升為2017年的首位，缺血性心臟病從1990年的第七位上升到2017年的第二位[3]。2016年，約400萬人死于CVDs[4]。目前CVDs已經(jīng)成為一種全球性的疾病。

最近的證據(jù)表明，腸道微生物能夠通過調(diào)節(jié)宿主代謝和炎癥的方式進(jìn)一步促進(jìn)或預(yù)防CVDs以及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物的組成會影響宿主的新陳代謝[5]。紅肉、貝類、雞蛋中含有豐富的膽堿、磷脂酰膽堿和L-肉堿[6]。這些食品經(jīng)過腸道菌群的作用，生成三甲胺(trimethylamine，TMA)，然后在肝臟中在黃素單氧化酶(flavin-containing monooxygenase，F(xiàn)MO)(特別是FMO1和FMO3)的作用下被轉(zhuǎn)化成氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)[7]。最近的研究表明，TMAO能夠促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，是CVDs的始動因素[8-9]。TMAO與心血管事件、預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)均相關(guān)[10]。

隨著腸道菌群與慢性疾病的研究不斷增多，服用益生菌作為一種潛在的緩解及預(yù)防方式，越來越多地受到人們的關(guān)注。QIU等的研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ZDY04[11]和產(chǎn)氣腸桿菌ZDY01[12]可以通過改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的方式減少血漿TMAO和盲腸TMA含量，進(jìn)而減少CVDs的發(fā)生。本研究選取3株不同種的乳桿菌，通過高膽堿飲食模型，評價(jià)它們降低血漿TMAO和盲腸TMA的效果，以期為CVDs防治開發(fā)新的功能性乳桿菌。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

TMAO、TMA，Sigma-Aldrich公司；D9-TMAO，Cambridge公司；D9-TMA，Toronto Research Chemicals公司；小鼠肝臟FMO3、法尼酯X受體(recombinant farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)的ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；膠回收試劑盒，杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司；PCR引物，上海生工生物工程有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒，美國MP Biomedicals公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate,BCA)蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

5424R高速離心機(jī)，德國艾本德股份公司；HPLC-MS/MS，賽默飛世爾科技公司；MiSeq測序儀，美國Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)使用的3株乳桿菌均來自江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心，菌株信息見表1。

表1 乳桿菌信息表Table 1 Lactobacillus strains information

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及飼料

7周齡的無特定病原體級(specific pathogen-free，SPF)雌性C57BL/6 J小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，適應(yīng)1周后，開始進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期是4周[11]。小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料(LAD 3001M，膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%)，1.0%膽堿飼料(LAD 3001M，膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%)，購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng)及懸浮液的制備

本動物實(shí)驗(yàn)所用到的3株乳桿菌均利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行活化，使用之前以3%的接種量進(jìn)行菌體活化，連續(xù)活化3代，活化之后擴(kuò)大培養(yǎng)，6 000×g離心15 min收取乳桿菌的菌體。用預(yù)冷的0.9%生理鹽水對乳桿菌的菌體清洗3次，以同樣的離心條件收取乳桿菌的菌體。獲得的菌體利用預(yù)冷的30%的蔗糖溶液重懸，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，保存于-80 ℃冰箱備用。使用時用預(yù)冷的無菌生理鹽水對乳桿菌菌體清洗3次，并用無菌生理鹽水將菌液稀釋到活菌數(shù)為1×109CFU/mL。

1.4.2 動物分組與處理?xiàng)l件

實(shí)驗(yàn)動物方案見表2。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級屏障中的IVC籠盒中[溫度為(25±2) ℃，濕度為(50±5)%，循環(huán)光照，其中12 h光照，12 h黑暗]，實(shí)驗(yàn)過程中所有小鼠均自由飲食飲水。所有動物實(shí)驗(yàn)均通過江南大學(xué)倫理委員會審閱和批準(zhǔn)，且符合歐盟保護(hù)實(shí)驗(yàn)動物條例(2010/63/EU)，所有實(shí)驗(yàn)均在江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心完成。倫理審核編號為：JN.No20181215c0900530[270]。

表2 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Animal experimental scheme

1.4.3 動物解剖及組織處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前收集小鼠糞便保存于-80 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)最后階段，小鼠禁食禁水過夜后在小鼠腹腔注射100 mg/kg體重的1%的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，摘眼球取血，靜置30 min后，3 000×g離心20 min取血漿，分裝后置于-80 ℃保存。小鼠解剖后，肝臟、腎臟和脾臟稱重后被迅速放入液氮中。計(jì)算小鼠肝臟、腎臟、脾臟的臟器指數(shù)，如公式(1)所示：

(1)

1.4.4 小鼠血漿TMAO的樣品處理

取20 μL血漿樣品加入80 μL(體積比1∶4)乙腈沉淀血漿樣品中的蛋白質(zhì)，同時加入終濃度為2.0 μmol/L的D9-TMAO到血漿樣品中作為內(nèi)標(biāo)。混勻，-80 ℃靜置2 h，在4 ℃條件下12 000×g離心15 min，吸取上清液至進(jìn)樣瓶中，保存在-80 ℃冰箱備用。采用HPLC-MS/MS進(jìn)行血漿TMAO的測定[13-14]。

1.4.5 小鼠盲腸TMA的樣品處理

稱取小鼠盲腸內(nèi)容物，1 mg盲腸內(nèi)容物加入20 μLV(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=40∶40∶20的混合溶液，同時加入終濃度為2.0 μmol/L的D9-TMA到盲腸樣品中作為內(nèi)標(biāo)，振蕩混勻后在-80 ℃靜置2 h，在4 ℃ 條件下12 000×g離心15 min，吸取上清液至進(jìn)樣瓶中，保存在-80 ℃冰箱，采用HPLC-MS/MS進(jìn)行盲腸TMA的測定[11]。TMA是極易揮發(fā)的小分子。在樣品制備和檢測過程中應(yīng)快速操作，整個過程應(yīng)保持低溫。樣本隨機(jī)檢測，以盡量減少由于處理時間造成的誤差。

1.4.6 HPLC-MS/MS檢測TMAO、TMA、D9-TMAO以及D9-TMA含量

參考之前文獻(xiàn)報(bào)道的方法[13-14]，利用Q Exactive的HPLC-MS/MS分析TMAO、TMA、D9-TMAO以及D9-TMA含量。液相色譜采用Amide色譜柱進(jìn)行分離，流動相A：0.1 mmol/L的甲酸銨(pH 3.5)，流動相B：乙腈，流速：0.3 mL/min。采用梯度洗脫的方式進(jìn)行洗脫。質(zhì)譜參數(shù)如下：離子源：ESI；多反應(yīng)監(jiān)測；正離子掃描。樣品檢測參數(shù)如表3所示。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品檢測參數(shù)Table 3 Standard testing parameters

1.4.7 小鼠肝臟FMO3和FXR蛋白的測定

小鼠肝臟FMO3和FXR的蛋白含量按照Elisa試劑盒(上海酶聯(lián))的操作手冊進(jìn)行測定。

1.4.8 小鼠肝臟FMO酶活力的測定

按照之前文獻(xiàn)報(bào)道的方法檢測肝臟FMOs的活性[15]。具體操作如下：小鼠肝臟組織在含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液中破碎勻漿，待肝臟組織裂解完全，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒的操作說明測定蛋白質(zhì)含量。取1.0 mg肝臟蛋白質(zhì)加入D9-TMA使其終濃度為100 μmol/L，同時加入100 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸混合均勻，最后加入10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH 7.4)緩沖液得到250 μL反應(yīng)體系。37 ℃孵育8 h后，加入0.2 mol甲酸終止反應(yīng)，隨后過濾樣品(ValueLab filter PTFE-Q 0.2 μm，安捷倫)轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶，保存在-80 ℃冰箱，采用HPLC-MS/MS檢測生成的D9-TMAO的含量。

1.4.9 16S rDNA擴(kuò)增子測序

小鼠糞便DNA按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，細(xì)菌的16S rDNA的擴(kuò)增、純化、定量、混樣、文庫構(gòu)建及測序分析等參考之前的研究[16]。測序完成后，在QIIME2(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，QIIME2,version 2019.7,https://view.qiime 2.org/)[17]進(jìn)行物種分類注釋，并利用在線網(wǎng)站進(jìn)行微生物群落的α多樣性和β多樣性分析[18]、線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)[19]及菌群與TMAO/TMA之間的相關(guān)性分析[20]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本論文中，所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，通過GraphPad Prism 6.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)分析圖，通過SPSS(IBM SPSS Statistics 22)對各組平均值的差異進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時，數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌的攝入對高膽堿飼料飼養(yǎng)小鼠臟器指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，比較了不同組之間小鼠的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。如圖1所示，對照組與膽堿組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，乳桿菌的攝入對膽堿飼料飼養(yǎng)小鼠的臟器指數(shù)也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的影響。

a-肝臟指數(shù)；b-腎臟指數(shù)；c-脾臟指數(shù)圖1 小鼠臟器指數(shù)Fig.1 Organ indices of mice

2.2 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對高膽堿飼料飼養(yǎng)的小鼠血漿TMAO和盲腸TMA水平的影響

如圖2所示，與對照組相比，膽堿組血漿TMAO水平和盲腸TMA水平顯著升高，乳桿菌的攝入對血漿TMAO水平和盲腸TMA水平的影響各不相同，表現(xiàn)出菌種的特異性[21]。其中，羅伊氏乳桿菌CCFM8631可以顯著降低血漿TMAO水平和盲腸TMA水平。這也預(yù)示著羅伊氏乳桿菌CCFM8631具有降低CVDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的潛力。

2.3 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對高膽堿飼料飼養(yǎng)的小鼠肝臟FMO3和FXR的蛋白表達(dá)和FMOs酶活力的影響

如圖3所示，對照組和膽堿組之間，肝臟FMO3和FXR的蛋白表達(dá)沒有差異，乳桿菌的攝入，也沒有顯著影響FMO3和FXR的蛋白表達(dá)。進(jìn)一步測定肝臟FMOs的活性,如圖3-c所示，對照組和膽堿組的肝臟FMOs酶的活性沒有顯著差異。與膽堿組相比，乳桿菌的攝入，也沒有顯著影響肝臟FMOs酶的活性。

a-血漿TMAO水平；b-盲腸TMA水平圖2 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對降低血漿TMAO和盲腸TMA水平的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on decrease the levels of plasma TMAO and cecal TMA in mice注：與膽堿組相比，*表示P<0.05，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1(下同)

2.4 羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入對高膽堿飼料飼養(yǎng)的小鼠糞便菌群的影響

2.4.1 小鼠糞便菌群多樣性分析

為了探究羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入對膽堿飼料飼養(yǎng)的小鼠腸道菌群的影響，我們對小鼠的糞便樣品進(jìn)行了16S rDNA分析。由圖4-a可知，通過對小鼠糞便菌群進(jìn)行α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，膽堿組在觀測物種豐富度指數(shù)，香農(nóng)多樣性指數(shù)，Pielou均勻度指數(shù)和Faith系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)方面均沒有顯著性差異，這預(yù)示著膽堿飼料并未影響糞便菌群的α多樣性。但是乳桿菌的攝入影響了糞便菌群的α多樣性，羅伊氏乳桿菌CCFM8631顯著升高了觀測物種豐富度指數(shù)。這也預(yù)示著羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入增加了腸道內(nèi)菌群的豐富度。通過對小鼠糞便菌群進(jìn)行β多樣性分析，由圖4-b可知，不同組之間分布較集中，沒有顯著的差異，說明膽堿飼料和羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入對菌群的組成結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響。

2.4.2 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對小鼠腸道菌群門水平相對豐度的影響

在門水平上，如圖5所示，在所有實(shí)驗(yàn)組中，相對豐度較高的門是一致的，均是厚壁菌門(Firmicutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，放線菌門(Actinobacteria)。說明膽堿飼料和羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入對小鼠腸道菌群門水平的相對豐度沒有影響。

a-肝臟FMO3蛋白表達(dá)水平；b-肝臟FXR蛋白表達(dá)水平；c-肝臟FMOs酶活力圖3 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對小鼠肝臟FMO3和FXR的蛋白表達(dá)和FMOs活性的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on affect the expression levels of FMO3 and FXR and the enzyme activity of hepatic FMOs

2.4.3 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對小鼠腸道菌群屬水平相對豐度的影響

通過Galaxy軟件對小鼠糞便菌群進(jìn)行LEfSe分析，設(shè)定差異閾值為LDA>2，P<0.05，共鑒定出具有顯著性差異的屬8個，如圖6-a、圖6-b所示，它們分別分布在對照組和CCFM8631組中。將篩選出具有顯著性差異的8個屬與血漿TMAO和盲腸TMA進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，如圖6-c所示，可以看出RuminococcaceaeUCG-013的豐度與盲腸TMA水平呈顯著正相關(guān)，Parasutterella的豐度與血漿TMAO水平呈顯著負(fù)相關(guān)，并且與盲腸TMA也表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的趨勢。具有相關(guān)性趨勢的屬的相對豐度如圖6-d所示，可以看出，在屬水平上，與對照組相比，膽堿組顯著提高了RuminococcaceaeUCG-013的相對豐度，顯著降低了Parasutterella的相對豐度，但是羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入改善了這一變化。

a-α多樣性分析；b-β多樣性分析圖4 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對菌群多樣性的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on the diversity of gut microbiota

3 討論

膽堿是一種人體必需的微量營養(yǎng)素，在人體代謝中發(fā)揮著廣泛的作用，參與了磷脂相關(guān)的細(xì)胞膜信號、與脂蛋白相關(guān)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、與同型半胱氨酸減少相關(guān)的甲基代謝以及與乙酰膽堿相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)合成[22-23]。含膽堿食物(如雞蛋、紅肉、魚類、貝類等)中的膽堿可以被腸道吸收[22]。長期缺乏或過量攝入膽堿均會對人體健康造成損害。例如，長期缺乏膽堿會損害肝功能，導(dǎo)致線粒體功能障礙、活性氧介導(dǎo)的DNA損傷、脂質(zhì)代謝紊亂和磷脂酰膽堿合成[24-25]。但是，長期過量累積膽堿會增加CVDs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。膽堿是含有三甲胺基團(tuán)的化合物，經(jīng)腸道微生物代謝產(chǎn)生TMA，TMA經(jīng)肝臟FMO的作用迅速進(jìn)一步氧化成TMAO，這會導(dǎo)致動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生，增加CVDs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6]。如今，新出現(xiàn)的證據(jù)表明，對人體有害的可能是有毒性的TMA，而不是TMAO[26]。有效降低血漿TMAO和盲腸TMA濃度的益生菌可能為預(yù)防動脈粥樣硬化和降低TMA引起的毒性提供有效且安全的方法。

a-門水平上的微生物分布；b-門水平上相對豐度圖5 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對門水平的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on phylum level of gut microbiota

肝臟FMO3在TMA生成TMAO的過程中起著極其重要的作用，肝臟FMO3過表達(dá)可以顯著增加血漿的TMAO水平。FMO3的表達(dá)受膽汁酸的影響，其中包括膽汁酸激活核受體FXR[15]。在本研究中，血漿TMAO水平和盲腸TMA水平的降低與小鼠肝臟FMO3和FXR的蛋白表達(dá)和FMOs的活力無關(guān)，最可能的原因是乳桿菌的攝入導(dǎo)致了小鼠腸道菌群的變化，影響了代謝生成TMA的菌群豐度，導(dǎo)致小鼠盲腸TMA水平的降低和血漿TMAO水平的降低。

羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入增加了腸道內(nèi)菌群的豐富度，雖然對門水平?jīng)]有影響，但可以顯著提高Parasutterella屬的相對豐度。Parasutterella是胃腸道健康人群糞便中的核心菌群[27]，羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入顯著提高了糞便Parasutterella的相對豐度，這也預(yù)示著該乳桿菌的攝入有助于腸道菌群向著更健康的方向發(fā)展。Ruminococcaceae中的成員可以將植物多糖降解為葡萄糖和短鏈脂肪酸，從而刺激葡萄糖和肝臟甘油三酯的產(chǎn)生，增加循環(huán)系統(tǒng)中的葡萄糖和脂質(zhì)水平[28]。有研究指出，Ruminococcaceae的豐度與apoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[29]，與血液免疫球蛋白M水平和結(jié)腸炎炎癥水平呈正相關(guān)[30]。經(jīng)過膽堿飼料喂養(yǎng)的小鼠，糞便RuminococcaceaeUCG-013的豐度與盲腸TMA水平變化呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢，羅伊氏乳桿菌CCFM8631的攝入減少了RuminococcaceaeUCG-013的相對豐度，雖然尚無直接證據(jù)證明RuminococcaceaeUCG-013能夠代謝膽堿產(chǎn)生TMA，但RuminococcaceaeUCG-013豐度的變化可能調(diào)節(jié)了腸道內(nèi)的免疫平衡，維持腸道的健康狀態(tài)，減少動脈粥樣硬化的發(fā)生。

a-LEfSe結(jié)果圖；b-LEfSe分支圖；c-血漿TMAO和盲腸TMA與顯著差異的屬之間的相關(guān)性分析；d-屬水平上的相對豐度圖6 羅伊氏乳桿菌CCFM8631對屬水平的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus reuteri CCFM8631 on genus level of gut microbiota

4 結(jié)論

本研究分別用3株不同種的乳桿菌處理膽堿飼料喂養(yǎng)的小鼠4周，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌CCFM8631可以顯著緩解由膽堿導(dǎo)致的血漿TMAO和盲腸TMA含量的升高，這個緩解作用并不是通過影響肝臟FMO3和FXR蛋白的表達(dá)以及肝臟FMO的活性實(shí)現(xiàn)的，但羅伊氏乳桿菌CCFM8631顯著提高了糞便中Parasutterella屬的相對豐度并降低了RuminococcaceaeUCG-013屬的相對豐度，相關(guān)性分析提示這兩個屬的微生物的豐度均與TMA的含量相關(guān)，提示羅伊氏乳桿菌CCFM8631可能通過影響了這兩個屬微生物的豐度實(shí)現(xiàn)了TMA的降低。雖然本研究中發(fā)現(xiàn)了可以減少血漿TMAO和盲腸TMA的生成的羅伊氏乳桿菌CCFM8631，為預(yù)防動脈粥樣硬化提供了新的資源，但本研究使用的乳桿菌的種類和數(shù)量較少，尚無法得出不同種屬在該功能上的特點(diǎn)。在未來的研究中，要擴(kuò)大菌株的類別和來源，在開發(fā)新的功能性益生菌的同時，對其緩解動脈粥樣硬化的機(jī)制進(jìn)行更深入的探索。