人源內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)

張吉，吳志勇，朱玲玉，辛瑜，顧正華，石貴陽，張梁*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

內(nèi)皮抑素(endostatin,EDN)是一種抑制血管生成和腫瘤生長的內(nèi)源性抑制劑，最初在小鼠內(nèi)皮瘤細(xì)胞系的上清液中分離得到[1]。研究表明，EDN具有廣泛的抗實(shí)體瘤活性的作用，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管生成等功能，因此在血管增生性疾病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[2-4]。人源內(nèi)皮抑素(human endostatin,hEDN)是人源膠原蛋白XVⅢ型C-端的184個(gè)氨基酸片段，分子質(zhì)量約為22 kDa，其中酸性氨基酸16個(gè)，堿性氨基酸29個(gè)，半胱氨酸4個(gè)，疏水氨基酸占42%，等電點(diǎn)為9.3，與鼠源內(nèi)皮抑素具有很高的同源性，兩者約具有86%的相同氨基酸殘基[5]。研究表明，hEDN 中的N末端的1，3，11三個(gè)組氨酸殘基和76位的天門冬氨酸是4個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)[6]，hEDN與Zn2+結(jié)合對(duì)其抗血管生成活性具有很重要的作用[7]。

EDN作為一種功能性多肽，國內(nèi)外對(duì)其進(jìn)行了大量的研究。1999—2002年，由畢赤酵母表達(dá)的重組EDN在美國進(jìn)行了Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)，其中Ⅱ期驗(yàn)證了其安全性，但是這兩期研究的藥效學(xué)結(jié)果不太理想。在I期臨床試驗(yàn)中用EDN治療皮膚傷口和腫瘤后無法檢測(cè)到其血管的變化[8]；并且在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中用EDN治療腫瘤患者后發(fā)現(xiàn)并沒有抑制腫瘤細(xì)胞的生長[9]。2001—2005年，國內(nèi)對(duì)重組EDN進(jìn)行了總共三期的臨床試驗(yàn)，并通過在hEDN的N端增加氨基酸的方法來提高其可溶性和活性[10]。目前，EDN臨床應(yīng)用面臨著溶解性低、穩(wěn)定性差、價(jià)格昂貴、需要大劑量等問題[11]。因而，探索EDN的高效制備方法對(duì)拓展其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，生物表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于重組蛋白或多肽的表達(dá)和制備。目前，已有多種表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用于EDN的表達(dá)，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞[12]、畢赤酵母[13]和大腸桿菌系統(tǒng)[14-15]。盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母表達(dá)系統(tǒng)作為真核系統(tǒng)對(duì)真核細(xì)胞來源的蛋白或多肽的適用性更好，但成本較高且耗時(shí)長。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長速度快、遺傳背景好、表達(dá)水平高和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)重組蛋白較合適的系統(tǒng)之一[16]。喬路等[17]通過大腸桿菌(Escherichiacoli)實(shí)現(xiàn)了hEDN的原核表達(dá)，但是產(chǎn)物為包涵體。目前，雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了hEDN在大腸桿菌中的表達(dá)，但是其產(chǎn)物多為蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊而形成的不溶性包涵體，并且包涵體處理步驟復(fù)雜且復(fù)性成功率不高。因此，在大腸桿菌中探究hEDN的可溶性表達(dá)對(duì)實(shí)現(xiàn)其大量制備具有重要的意義。

融合標(biāo)簽在蛋白或多肽的表達(dá)過程中具有重要作用，如促進(jìn)目的蛋白可溶表達(dá)，緩解異源蛋白毒副作用等。常用的融合標(biāo)簽包括谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)標(biāo)簽[18]、硫氧還蛋白A (thioredoxin A,Trx A)標(biāo)簽[19]、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein,MBP)標(biāo)簽[20]和小分子泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)標(biāo)簽[21]等。值得注意的是，GST融合標(biāo)簽不僅是一種促溶標(biāo)簽，同時(shí)也是一種親和蛋白純化系統(tǒng)，通過在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)GST融合蛋白，并通過將GST結(jié)合特性應(yīng)用于谷胱甘肽來純化融合蛋白[22]。研究表明，這些促溶標(biāo)簽?zāi)艽蟠筇岣咧亟M蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)率[23]。因此，通過利用融合標(biāo)簽來促進(jìn)異源蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)是一種可行的策略。

本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)分別構(gòu)建了hedn單基因表達(dá)質(zhì)粒、融合標(biāo)簽共表達(dá)質(zhì)粒和融合表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，搖瓶發(fā)酵并通過SDS-PAGE和串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/ ionization time of flight，MALDI-TOF/TOF)鑒定hEDN的表達(dá)情況，進(jìn)而探究hEDN的可溶性表達(dá)條件。進(jìn)一步地，在優(yōu)選的GST融合表達(dá)基礎(chǔ)上，對(duì)搖瓶發(fā)酵的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度和添加誘導(dǎo)劑的時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了hEDN融合蛋白的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 引物

本研究引物序列信息詳見表2。

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，115 ℃滅菌20 min。

TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24，胰蛋白胨12，甘油 5，KH2PO42.31，K2HPO412.54，115 ℃滅菌20 min。

主要試劑:限制性內(nèi)切酶，美國Thermo公司；GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker，上海Yeasen公司；T4DNA連接酶，大連Takara公司；重組PreScission Protease，上海源葉公司；2×TaqMaster Mix、2×PfuMaster Mix，杭州寶賽生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA提取、片段純化、凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；PrePack GSH Purose 4 Fast Flow預(yù)裝柱，江蘇千純公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

S100D型PCR儀、Chemi Doc凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司;DYY-6C核酸電泳儀，北京六一儀器廠;Pico17高速離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司;HYL-C型組合式搖床，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;Sonic VCX-750型超聲波細(xì)胞破碎儀，南京新辰生物科技有限公司;SCG蛋白純化系統(tǒng)，蘇州賽譜儀器有限公司;MALDI-TOF/TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人源內(nèi)皮抑素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 單基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

UniProt (www.uniprot.org)中查詢得到人源內(nèi)皮抑素氨基酸序列(Identifier:P39060)，基于大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，交由上海生工生物工程有限公司合成基因并將人源內(nèi)皮抑素基因humanendostatin(hedn)序列克隆在pUC57質(zhì)粒上，記為pUC57-hedn。以質(zhì)粒pUC57-hedn為模板，利用PCR擴(kuò)增片段，通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化、菌落PCR、測(cè)序等分子生物學(xué)手段，最終得到E.coliBL21(DE3)/ pET28a-hedn重組菌株。

1.2.1.2 融合標(biāo)簽共表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建方法同1.2.1.1,最終得到E.coliBL21(DE3)/pTIG-hedn重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-TrxA-hedn重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-hedn-TrxA重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-mbp-hedn重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-hedn-mbp重組菌株。

1.2.1.3 融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建方法同1.2.1.1,最終得到E.coliBL21(DE3)/ pET-32a-hedn重組菌株、E.coliBL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn重組菌株。

1.2.2 人源內(nèi)皮抑素的誘導(dǎo)表達(dá)及質(zhì)譜鑒定

將上述重組大腸桿菌分別劃線于卡那霉素、氨芐青霉素抗性平板上37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落，接種于15 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，以1∶50體積比接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.4～1.6時(shí)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)至終濃度為0.2 mmol/L，在16 ℃，200 r/min條件下，誘導(dǎo)發(fā)酵24 h，12 000 r/min，5 min離心棄上清液收集菌體，用pH 8.0 PBS緩沖液(140 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.8 mmol/L KH2PO4)洗滌3次，將重懸后的菌體用超聲破碎儀破碎，破碎條件:破1 s，停2 s，總時(shí)間24 min，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，取上清液和沉淀，通過SDS-PAGE分析其表達(dá)情況。

將成功表達(dá)的SDS-PAGE凝膠條帶切割后置于1.5 mL EP管中，然后對(duì)凝膠進(jìn)行脫色、溶化、消化等預(yù)處理，利用MALDI-TOF/TOF分析。

1.2.3 人源內(nèi)皮抑素誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

確定能成功表達(dá)hEDN的重組菌株后，使用TB培養(yǎng)基37 ℃，200 r/min條件搖瓶發(fā)酵24 h，每2 h取樣，測(cè)OD600值，描繪該重組菌株的生長曲線。根據(jù)菌株生長曲線改變其搖瓶發(fā)酵的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度及加入誘導(dǎo)劑IPTG的時(shí)間，通過SDS-PAGE分析hEDN表達(dá)情況，篩選最佳發(fā)酵條件。

1.2.3.1 誘導(dǎo)溫度

挑取重組菌株的單菌落，接種于15 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，以1∶50體積比接種于TB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.4～1.6時(shí)加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，分成3組，分別于16、20、25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)36 h，其他條件保持一致，12 000 r/min，5 min收集菌體。

1.2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間

挑取重組菌株的單菌落，接種于15 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，以1∶50體積比接種于TB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.4～1.6時(shí)加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，分成3組，分別于20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36 h，其他條件保持一致，12 000 r/min，5 min收集菌體。

1.2.3.3 誘導(dǎo)劑IPTG的濃度

挑取重組菌株的單菌落，接種于15 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，以1∶50體積比接種于TB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.4～1.6時(shí)加入IPTG，分成5組，每組加入IPTG分別至終濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L，20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)36 h，其他條件保持一致。

1.2.3.4 加入誘導(dǎo)劑IPTG的時(shí)間

挑取重組菌株的單菌落，接種于15 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，以1∶50體積比接種于TB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)，分成6組，每組加入誘導(dǎo)劑IPTG的時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12 h，加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L，20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)36 h，其他條件保持一致。

1.2.4 人源內(nèi)皮抑素蛋白的純化

1.2.4.1 人源內(nèi)皮抑素融合蛋白的純化

用2 mL/min去離子水清洗PrePack GSH Purose 4 Fast Flow預(yù)裝柱約20 min，去除乙醇；以2 mL/min流速、pH 8.0 PBS (140 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.8 mmol/L KH2PO4)平衡柱料約20 min；將過膜的hEDN融合蛋白上清液以1 mL/min的流速進(jìn)樣，以2 mL/min的流速用pH 8.0 PBS再次平衡柱料約20 min；然后以1 mL/min的流速用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L還原型谷胱甘肽,pH 8.0)進(jìn)行洗脫約20 min，分別收集洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE分析。另將得到的上述洗脫液進(jìn)行超濾濃縮并且置換溶液，置換成50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.0)，便于后期PreScission 蛋白酶(PreScission protease，PPase)酶切處理。

1.2.4.2 重組PPase切割融合蛋白及質(zhì)譜鑒定

重組PPase是由human rhinovirus type 14 3C protease和GST組成的融合蛋白，該蛋白酶可在低溫下特異識(shí)別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切。

PPase酶活力定義(U):在5 ℃條件下反應(yīng)16 h，能夠切割10 μg的GST標(biāo)簽的融合蛋白達(dá)90%以上所需的酶量定義為1個(gè)活性單位。

將PPase以20 U酶活力的量加入到含有200 μg的hEDN融合蛋白中，反應(yīng)體系包含50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA和1 mmol/L DTT的緩沖液，在5 ℃條件下進(jìn)行酶切，16 h 和24 h后取樣，SDS-PAGE檢測(cè)酶切效果。

回收SDS-PAGE凝膠GST標(biāo)簽及hEDN條帶置于1.5 mL EP管中，然后對(duì)凝膠進(jìn)行脫色、孵育、凍干、消化、點(diǎn)樣等預(yù)處理，用MALDI-TOF/TOF分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人源內(nèi)皮抑素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

2.1.1 單基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

按照1.2.1.1的方法成功構(gòu)建了單基因表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hedn。酶切結(jié)果如圖1-a所示。

2.1.2 融合標(biāo)簽共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

按照1.2.1.2的方法成功構(gòu)建了融合標(biāo)簽共表達(dá)質(zhì)粒pTIG-hedn、pETDuet-1-TrxA-hedn、pETDuet-1-hedn-TrxA、pETDuet-1-mbp-hedn、pETDuet-1-hedn-mbp。酶切結(jié)果如圖1-b～圖1-f所示。

2.1.3 融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

按照1.2.1.3的方法成功構(gòu)建了融合表達(dá)質(zhì)粒pET32a-hedn、pGEX-6p-1-hedn。酶切結(jié)果如圖1-g和圖1-h所示。

M-Marker,DL-10 000(Takara);1-重組質(zhì)粒酶切結(jié)果a-pET28a-hedn；b-pTIG-hedn；c-pETDuet-1-Trx A-hedn；d-pETDuet-1-hedn-Trx A；e-pETDuet-1-mbp-hedn；f-pETDuet-1-hedn-mbp；g-pET32a-hedn；h-pGEX-6p-1-hedn圖1 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmids

2.2 人源內(nèi)皮抑素的誘導(dǎo)表達(dá)及質(zhì)譜鑒定

將上述含有hedn表達(dá)質(zhì)粒的菌株及對(duì)應(yīng)空載菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，16 ℃，200 r/min，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)24 h，將破碎后的上清液及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示。本文構(gòu)建的所有單基因表達(dá)菌株及融合標(biāo)簽共表達(dá)菌株發(fā)酵培養(yǎng)獲得的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析均未得到與hEDN分子質(zhì)量理論值22 kDa相一致的條帶，結(jié)果如圖2-a～圖2-f所示。融合表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)/pET32a-hedn理論上表達(dá)的融合蛋白大小應(yīng)約為44 kDa，但是并未檢測(cè)到相應(yīng)大小的條帶，如圖2-g所示。融合表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn得到了與理論值相一致的融合蛋白，大小約為47 kDa，且對(duì)照組未檢測(cè)到相應(yīng)條帶，如圖2-h所示。根據(jù)上述結(jié)果，初步確定僅有E.coliBL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn能成功表達(dá)hEDN。進(jìn)一步通過MALDI-TOF/TOF鑒定，結(jié)果如圖3所示，破碎后上清液蛋白得分為128，破碎后沉淀蛋白得分為161，并且得分在質(zhì)譜結(jié)果中排名靠前，表明結(jié)果可信，進(jìn)一步確認(rèn)hEDN的成功表達(dá)。

M-Marker；1-空載破碎后上清液；2-空載破碎后沉淀；3-重組菌株破碎后上清液；4-重組菌株破碎后沉淀a-E.coli BL21/pET28a-hedn;b-E.coli BL21/pTIG-hedn;c-E.coli BL21/pETDuet-1-Trx A-hedn;d-E.coli BL21/pETDuet-1-hedn-Trx A;e-E.coli BL21/pETDuet-1-mbp-hedn;f-E.coli BL21/pETDuet-1-hedn-mbp;g-E.coli BL21/pET32a-hedn;h-E.coli BL21/pGEX-6p-1-hedn圖2 不同重組菌株的蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expression of different recombinant strains

a-hEDN融合蛋白破碎后上清液;b-hEDN融合蛋白破碎后沉淀圖3 hEDN融合蛋白的MALDI-TOF/TOF結(jié)果分析Fig.3 MALDI-TOF/TOF analysis of hEDN fusion protein

2.3 人源內(nèi)皮抑素融合蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

E.coliBL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn菌株生長曲線如圖4所示，該菌株在16 h左右基本進(jìn)入穩(wěn)定期。依據(jù)該菌株的生長曲線，分別對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑IPTG濃度及加入誘導(dǎo)劑IPTG濃度條件進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。

圖4 重組菌株的生長曲線Fig.4 Growth curve of the recombinant strain

2.3.1 誘導(dǎo)溫度

按照1.2.3.1方法，結(jié)果如圖5-a和圖5-b所示，細(xì)胞破碎上清液中明顯16 ℃表達(dá)量最少，20 ℃和25 ℃無明顯差別；但是這3個(gè)溫度中25 ℃表達(dá)的包涵體明顯是最多的，所以選擇20 ℃作為最佳誘導(dǎo)溫度。

2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間

按照1.2.3.2方法，結(jié)果如圖5-c和圖5-d所示，細(xì)胞破碎上清液中誘導(dǎo)12 h表達(dá)量最少，誘導(dǎo)36 h表達(dá)最多；并且誘導(dǎo)12 h包涵體最多，誘導(dǎo)36 h包涵體最少，因此選擇誘導(dǎo)36 h 最為合適。

2.3.3 誘導(dǎo)劑IPTG濃度

按照1.2.3.3方法，結(jié)果如圖5-e和圖5-f所示，從不同濃度IPTG誘導(dǎo)的效果來看，hEDN融合蛋白包涵體的表達(dá)無明顯差別，但細(xì)胞破碎上清液是有細(xì)微區(qū)別的，0.3 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)效果稍好一些，因此選擇0.3 mmol/L IPTG作為最佳誘導(dǎo)劑濃度。

M-Marker;a,b-1-16 ℃,2-20 ℃,3-25 ℃,c,d-1-12 h,2-24 h,3-36 h,e,f-1-0.1 mmol/L,2-0.2 mmol/L,3-0.3 mmol/L,4-0.4 mmol/L,5-0.5 mmol/L,g,h-1-2 h,2-4 h,3-6 h,4-8 h,5-10 h,6-12 ha-誘導(dǎo)溫度-破碎后上清液;b-誘導(dǎo)溫度-破碎后沉淀;c-誘導(dǎo)時(shí)間-破碎后上清液;d-誘導(dǎo)時(shí)間-破碎后沉淀;e-誘導(dǎo)劑濃度-破碎后上清液;f-誘導(dǎo)劑濃度-破碎后沉淀;g-加入誘導(dǎo)劑時(shí)間-破碎后上清液;h-加入誘導(dǎo)劑時(shí)間-破碎后沉淀圖5 發(fā)酵優(yōu)化SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis results of fermentation optimization

2.3.4 加入誘導(dǎo)劑IPTG時(shí)間

按照1.2.3.4方法，結(jié)果如圖5-g和圖5-h所示，在2～12 h添加誘導(dǎo)劑時(shí)，hEDN融合蛋白包涵體的表達(dá)無明顯差別，而8、10、12 h添加誘導(dǎo)劑時(shí)細(xì)胞破碎上清液中hEDN融合蛋白的表達(dá)效果優(yōu)于2、4、6 h添加誘導(dǎo)劑，且在8、10、12 h添加誘導(dǎo)劑時(shí)上清液中hEDN融合蛋白的表達(dá)無明顯差異。

2.4 人源內(nèi)皮抑素蛋白純化

2.4.1 人源內(nèi)皮抑素融合蛋白純化

因hEDN和GST標(biāo)簽融合表達(dá)，所以可溶性部分先過1次PrePack GSH Purose 4 Fast Flow預(yù)裝柱初步純化，SDS-PAGE分析顯示在47 kDa處得到相應(yīng)的理論值條帶，表明初步純化得到hEDN融合蛋白，但同時(shí)SDS-PAGE結(jié)果顯示在約25 kDa處出現(xiàn)1條明顯條帶，飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定為GST標(biāo)簽蛋白條帶(圖6-a、圖6-c、圖6-d)。

M-Marker；a-1-空載破碎后上清液;2-hEDN融合蛋白破碎后上清液;3-穿透液;4～9-收集液;b-1-收集液濃縮；2-酶切16 h；3-酶切24 ha-純化后的hEDN融合蛋白的SDS-PAGE分析;b-hEDN融合蛋白酶切后的SDS-PAGE分析;c-鑒定GST標(biāo)簽結(jié)果;d-鑒定GST標(biāo)簽氨基酸序列結(jié)果圖6 hEDN融合蛋白純化及酶切后結(jié)果分析Fig.6 The results of the purified hEDN fusion protein and its enzymatic hydrolysate by the PPase

將純化收集得到的樣品進(jìn)行超濾濃縮且置換成50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.0)，為下一步切除GST標(biāo)簽做準(zhǔn)備。

2.4.2 重組PPase切割融合蛋白

初步得到的純化樣品是包含hEDN和GST標(biāo)簽的融合蛋白，需要將GST標(biāo)簽切掉通過再次純化得到hEDN。PPase是能夠切割GST標(biāo)簽的蛋白酶，酶切16 h后經(jīng)SDS-PAGE分析在25 kDa以下檢測(cè)到兩條條帶(hEDN-1和hEDN-2)，如圖6-b所示，這兩條帶從上到下的質(zhì)譜結(jié)果依次如圖7所示，結(jié)果顯示這兩條帶都是hEDN。

a-鑒定GST標(biāo)簽結(jié)果;b-鑒定GST標(biāo)簽氨基酸序列結(jié)果;c-鑒定hEDN-1結(jié)果;d-鑒定hEDN-1氨基酸序列結(jié)果;e-鑒定hEDN-2結(jié)果;f-鑒定hEDN-2氨基酸序列結(jié)果圖7 hEDN融合蛋白酶切后的MALDI-TOF/TOF結(jié)果分析Fig.7 MALDI-TOF/TOF results of hEDN fusion protein after digestion by the PPase

3 討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有良好的遺傳背景、低成本培養(yǎng)和高生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是重組蛋白表達(dá)的首選[16]。然而，重組hEDN在大腸桿菌中容易形成包涵體。為了探究hEDN可溶性表達(dá)條件，本研究嘗試在大腸桿菌中建立不同的表達(dá)體系，最終在所構(gòu)建的重組菌株中僅有GST融合標(biāo)簽成功實(shí)現(xiàn)了hEDN的可溶性表達(dá)。值得注意的是，E.coliBL21(DE3)/pETDuet-1-mbp-hedn菌株轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基較澄清，表明該菌株并沒有生長。hEDN較難在大腸桿菌中異源表達(dá)，可能是由于hEDN對(duì)細(xì)胞具有毒副作用，此外hEDN的表達(dá)依賴于胞內(nèi)細(xì)胞器，而大腸桿菌中缺乏能促進(jìn)蛋白成功表達(dá)的細(xì)胞器[24]。本文GST標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了hEDN的可溶性表達(dá)，并通過優(yōu)化hEDN融合蛋白的發(fā)酵條件可知，重組菌處于對(duì)數(shù)生長后期時(shí)再加入誘導(dǎo)劑會(huì)增加hEDN融合蛋白的表達(dá)量。將細(xì)胞破碎上清液經(jīng)過GST親和層析初步得到hEDN融合蛋白，同時(shí)也得到了較濃的GST標(biāo)簽蛋白，可能是因?yàn)槿诤系鞍撞环€(wěn)定斷裂或胞內(nèi)蛋白酶切割造成的[25]。此外，hEDN融合蛋白經(jīng)PPase酶切后理論上應(yīng)得到hEDN，GST標(biāo)簽和PPase 3個(gè)部分，但是在SDS-PAGE分析中在15～25 kDa中得到兩條條帶，經(jīng)過MALDI-TOF/TOF鑒定這兩條帶均為hEDN，這可能是由于PPase不正確切割所致，因?yàn)镻Pase對(duì)切割位點(diǎn)識(shí)別的敏感性受到核心區(qū)域兩端氨基酸殘基的影響[26]，或者是由于不適宜的酶切條件引起二次切割所導(dǎo)致的[27]，后續(xù)可對(duì)酶切條件進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

本文利用GST融合標(biāo)簽表達(dá)策略實(shí)現(xiàn)了hEDN的可溶性表達(dá)，并通過發(fā)酵優(yōu)化進(jìn)一步確定了hEDN融合蛋白的最佳表達(dá)條件(8～12 h添加終濃度0.3 mmol/L IPTG,20 ℃誘導(dǎo)36 h)。該研究為人源多肽的可溶性表達(dá)與純化提供了研究思路，同時(shí)對(duì)微生物發(fā)酵制備功能性多肽具有一定的借鑒意義。下一步，將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)hEDN功能進(jìn)行驗(yàn)證。