基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子模擬的射干治療腦膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制

周 揚(yáng) ,姜東京 ,劉松柏 ,陸海峰 ,曾 峰 ,鐘其新 ,戴小蓉

(1.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,蘇州檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇蘇州 215009;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心,廣東廣州 510445;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研處,廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510405;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(福田),廣東深圳 518034)

腦膠質(zhì)瘤起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的27.7%[1],具有快速浸潤(rùn)生長(zhǎng)、增殖迅速、易復(fù)發(fā)等顯著特點(diǎn)[2],是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的疾病,也是目前臨床研究的熱點(diǎn)之一[3]。

射干始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,味苦,性寒,具有清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀之功效[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),其所含的異黃酮成分鳶尾苷(tectoridin)、鳶尾苷元(tectorigenin)、野鳶尾苷(iridin)和野鳶尾黃素(irigenin)等是其主要藥理活性成分。射干在抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等多種過(guò)程中有著廣泛的作用[5]。其有效成分野鳶尾黃素被報(bào)道在肝癌、胃癌、肺癌等多種人類(lèi)腫瘤中表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用[6-8],而射干對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的作用研究仍未有相關(guān)報(bào)道。

中藥存在多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用特點(diǎn)[9],傳統(tǒng)藥理學(xué)的單一性思維難以總結(jié)藥物作用于機(jī)體的機(jī)制,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)利用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”網(wǎng)絡(luò)探討藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制,為中藥復(fù)雜研究提供了新方向[10]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、分子對(duì)接技術(shù)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法對(duì)射干治療腦膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制進(jìn)行研究,以期為后續(xù)射干治療腦膠質(zhì)瘤的研究和臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 射干化學(xué)成分與靶點(diǎn)收集

1.2 腦膠質(zhì)瘤疾病靶點(diǎn)收集

通過(guò)GeneCards、OMIM、CTD 數(shù)據(jù)庫(kù),輸入關(guān)鍵詞“brain glioma”檢索疾病靶點(diǎn),篩選relevance score>20的來(lái)源于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)和有直接證據(jù)的CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn),將各數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果匯總后去重,獲得腦膠質(zhì)瘤疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 “化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

根據(jù)收集獲得的靶點(diǎn)信息,利用VENN DIAGRAMSR在線軟件,繪制藥物和疾病的Venn圖,獲得藥物和疾病的共同靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò),并利用CytoCNA 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué),并根據(jù)度值篩選關(guān)鍵藥效分子。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將射干治療腦膠質(zhì)瘤的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),物種限定為“Homo sapiens”,獲取高置信度(≥0.7)的蛋白質(zhì)相互作用信息。將其導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),利用CytoCNA 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,并根據(jù)度值篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析

利用R 語(yǔ)言ClusterProfiler包對(duì)治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG 通路富集分析,物種限定為Homo sapiens,閾值Pvalue<0.05,并利用R語(yǔ)言ggplot2包將結(jié)果可視化。對(duì)Pvalue前20的通路構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-通路圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

從Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取度值排名前10的關(guān)鍵藥效分子的三維結(jié)構(gòu)SDF格式文件,利用Py MOL軟件將其轉(zhuǎn)換為PDB 格式,利用AutoDock 軟件將其轉(zhuǎn)換為PDBQT 格式。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取度值排名前10 的核心靶點(diǎn)的PDB 格式文件,并使用Py MOL軟件對(duì)蛋白進(jìn)行去水、加氫、分離配體與受體等操作,利用AutoDock軟件計(jì)算配體Gridbox坐標(biāo)數(shù)據(jù),并將其轉(zhuǎn)換為PDBQT 格式。利用AutoDock vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬,通過(guò)結(jié)合能(Binding Energy,BE)對(duì)活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性進(jìn)行評(píng)價(jià),利用Py MOL軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器

射干飲片(規(guī)格:薄片,安徽道源堂中藥飲片有限公司);膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù));VEGF、MMP9、GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Annexin V-FITX/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);AMBION mir Vana PARIS Kit RNA 提取試劑盒(美國(guó)Life Technocologies公司);VEGF 上下游引物、MMP9 上下游引物、GAPDH 上下游引物(廣州銳博生物科技有限公司);5218R 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)eppendorf公司);Sartorius BSA224S-CW 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);Direct-Q3純水機(jī)(美國(guó)millipore公司);imark 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Power Pac Basic型蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Bioscience公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥

將射干飲片粉碎過(guò)80目篩后,稱(chēng)取一定量飲片粉末加入700 m L/L乙醇回流提取2次。第1次加8倍量乙醇,第2次加6倍量,每次提取50 min,提取完成后趁熱過(guò)濾,合并兩次提取液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇,將提取液濃縮成稠膏,冷凍干燥,得到射干乙醇提取物凍干粉。干粉用PBS配制成100 mg/m L的貯存液,使用0.22μm 的微孔濾膜過(guò)濾除菌,于4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ四X膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞用含有100 m L/L胎牛血清和10 g/L青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在37℃和50 m L/L CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。培養(yǎng)液每2 d更換1次。細(xì)胞經(jīng)3次傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)分為空白組(只含培養(yǎng)基)、射干提取物8 mg/m L組和16 mg/m L組,用相應(yīng)濃度的藥物預(yù)處理細(xì)胞48 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(1)以中青年教師為主。獨(dú)立學(xué)院由于建校時(shí)間不長(zhǎng)，自有引進(jìn)教師主要為應(yīng)屆畢業(yè)生，進(jìn)校時(shí)年齡普遍集中在 30 歲以下，而且所占比例一般都超過(guò)了50%以上。

1.9 蛋白免疫印跡(Western Blotting)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF、MMP9和PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取各組細(xì)胞上清液加入裂解液,冰上裂解30 min后低溫高速離心取上清液,收集細(xì)胞總蛋白,采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度,用100 m L/L SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,電泳完成后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h。然后加入稀釋的相應(yīng)一抗,將膜與一級(jí)抗體于低溫4℃孵育過(guò)夜,用TBS-5洗膜5次,然后在室溫下用二級(jí)抗體孵育2 h,再用TBS-T洗膜5次,最后加入配好的顯色液進(jìn)行顯色。使用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.10 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將實(shí)驗(yàn)分為8 組,分別為空白組和射干提取物2、4、8、16、32、64、128 mg/m L 濃度組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的速度接種在96孔板中。24 h貼壁后棄去上清,用相應(yīng)濃度的射干提取物預(yù)處理細(xì)胞48 h,空白組只加等量培養(yǎng)基,每孔重復(fù)3次,添加CCK8溶液并培養(yǎng)2 h,之后于450 nm 測(cè)定A值,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,選擇合適的射干提取物濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

吸棄原培養(yǎng)基,收集各組細(xì)胞,然后用PBS洗滌2次,加入500μL 的Binding緩沖液重新懸浮細(xì)胞。在避光條件下,將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到檢測(cè)管中,分別加入5μL Annexin V和5μL Propidium Iodide(PI),輕輕吹打混勻,室溫下孵育30 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平,進(jìn)行結(jié)果分析。

1.12 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中VEGF和MMP9基因mRNA的表達(dá)

取適量各組細(xì)胞,根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟依次選用試劑提取總RNA并測(cè)定其含量、合成cDNA、PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min,95℃變性15 s,60℃退火30 s,72℃延伸40 s,共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參、cDNA 為模板擴(kuò)增,所得數(shù)據(jù)采用2-△△ct法計(jì)算目的基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,計(jì)量資料多組間采用單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 射干的活性成分與靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP、TCMID、ETCM 和數(shù)據(jù)挖掘共得到32個(gè)活性成分(表1),通過(guò)Swiss Target Prediction共收集到射干的潛在靶點(diǎn)484個(gè)。

表1 射干活性成分基本信息Tab.1 Basic information of active ingredients in Belamcanda chinensis

2.2 腦膠質(zhì)瘤疾病靶點(diǎn)及其與藥物共有靶點(diǎn)

通過(guò)GeneCards、OMIM、CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到137個(gè)、209個(gè)、236個(gè)腦膠質(zhì)瘤疾病靶點(diǎn),去重后共獲得464個(gè)腦膠質(zhì)瘤疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將射干藥物靶點(diǎn)與腦膠質(zhì)瘤疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射,得到射干治療腦膠質(zhì)瘤共62個(gè)靶點(diǎn),繪制Venn圖(圖1)。

圖1 射干藥物靶點(diǎn)與腦膠質(zhì)瘤疾病靶點(diǎn)Venn圖Fig.1 Venn map of drug targets of Belamcanda chinensis and glioma disease targets

2.3 “化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)模型(圖2)。高度值的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中相互作用的節(jié)點(diǎn)較多,在網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位。網(wǎng)絡(luò)藥物節(jié)點(diǎn)度值中位數(shù)為6,篩選度值大于或等于兩倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵藥效分子,共獲得12個(gè)關(guān)鍵藥效分子,按度值由大到小編號(hào)分別為SG20、SG11、SG26、SG9、SG21、SG23、SG6、SG27、SG4、SG8、SG1 和SG3。

圖2 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Compound-target-disease network map

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

基于STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件構(gòu)建射干治療腦膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值中位數(shù)為7,篩選度值大于或等于兩倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)作為核心靶點(diǎn),共獲得17 個(gè)核心靶點(diǎn),分別為AKT1、STAT3、HRAS、VEGFA、MAPK1、PIK3CA、EGFR、PTPN11、MTOR、PTGS2、ESR1、PTK2、ERBB2、MMP9、APP、AR、TNF。

圖3 射干治療腦膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of therapeutic targets of Belamcanda chinensis in the treatment of glioma

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

基于R 語(yǔ)言Cluster Profiler包對(duì)治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析(圖4、圖5)。GO功能富集分析共富集到1 667個(gè)生物過(guò)程(Biological Process,BP)條目,主要涉及肽基絲氨酸磷酸化、蛋白激酶B 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基絲氨酸修改等;富集到56個(gè)細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)條目,主要涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)域等;富集到64個(gè)分子功能(Molecular Function,MF)條目,主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性;KEGG 通路富集分析富集到79條相關(guān)通路,主要涉及PI3K/Akt信號(hào)通路、Glioma神經(jīng)膠質(zhì)瘤、Rap1 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路等。

圖4 GO 功能富集分析條形圖Fig.4 Go function enrichment analysis

圖5 KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接分析

利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核心靶點(diǎn)蛋白(表2),利用AutoDock vina軟件對(duì)度值前10的關(guān)鍵藥效分子和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接模擬(圖6)。最低結(jié)合能越小,說(shuō)明二者結(jié)合活性越好,一般認(rèn)為最低結(jié)合能小于-5 kal/mol,說(shuō)明兩者能夠自發(fā)結(jié)合并結(jié)合較好[12]。圖6中大部分關(guān)鍵藥效分子與核心靶點(diǎn)最低結(jié)合能小于-5 kal/mol,說(shuō)明兩者具有良好的結(jié)合活性。利用Py MOL對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化(圖7),由示例可見(jiàn)靶點(diǎn)蛋白與活性成分通過(guò)氫鍵能分子間作用力相結(jié)合,進(jìn)一步說(shuō)明活性成分和靶點(diǎn)蛋白之間具有良好的結(jié)合能力。

圖6 分子對(duì)接最低結(jié)合能熱圖Fig.6 Heat map of minimum binding energy for molecular docking

圖7 分子對(duì)接模式示例Fig.7 Examples of molecular docking models

表2 核心靶點(diǎn)受體蛋白與配體信息Tab.2 Information of core target receptor proteins and ligands

2.7 射干提取物對(duì)LN229細(xì)胞活力的影響

結(jié)果見(jiàn)圖8。與空白對(duì)照組比較,2～128 mg/m L射干提取物組的U87細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05或P<0.001),且呈濃度依賴(lài)性。射干提取物給藥量為8 mg/m L和16 mg/m L時(shí),細(xì)胞存活率分別為(61±4.58)%和(51.33±4.04)%,給藥量為16 mg/mL時(shí)有將近半數(shù)細(xì)胞死亡,因此在進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí),選取8 mg/mL和16 mg/mL這兩個(gè)給藥濃度。

圖8 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Cell viability experiment results

2.8 射干提取物對(duì)U87 細(xì)胞VEGF、MMP9 和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

采用相應(yīng)濃度的射干提取物干預(yù)48 h后,空白對(duì)照組和射干提取物8 mg/m L 和16 mg/m L 實(shí)驗(yàn)組的U87細(xì)胞中VEGF 和MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)見(jiàn)圖9。與空白對(duì)照組相比,射干提取物8 mg/m L 和16 mg/m L組中U87細(xì)胞的VEGF 和MMP9蛋白水平顯著降低(P<0.01或P<0.001),并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性?？瞻讓?duì)照組和射干提取物8 mg/m L 和16 mg/m L實(shí)驗(yàn)組的U87 細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT 和AKT 的蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖10。與空白對(duì)照組比較,射干提取物16 mg/m L 組的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 比值均顯著降低(P<0.01)。

圖9 VEGF和MMP9蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.9 The protein expressions of VEGF and MMP9

圖10 PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.10 The expressions of PI3K/Akt pathway related proteins

2.9 射干提取物對(duì)U87細(xì)胞VEGF和MMP9基因mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見(jiàn)表3,與空白對(duì)照組比較,射干提取物8 mg/m L和16 mg/m L給藥組的VEGF和MMP9基因mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.001或P<0.000 1)。

2.10 射干提取物對(duì)U87細(xì)胞早期凋亡的影響

結(jié)果見(jiàn)表4,與空白對(duì)照組相比,射干提取物8 mg/m L和16 mg/m L 組的早期凋亡率顯著增高(P<0.01或P<0.001)。

3 討 論

近年來(lái)射干在抗腫瘤方面的研究逐漸增多。已有研究表明射干能夠有效抑制結(jié)腸癌[13]、宮頸癌[14]等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),但其對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制作用尚未有相關(guān)報(bào)道,其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制仍待研究。

本研究通過(guò)構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)篩選出異-德國(guó)鳶尾醛、3-甲基鼠李素、高車(chē)前素、異鼠李素、射干酮、射干醛等關(guān)鍵藥效分子。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析后發(fā)現(xiàn),AKT1、STAT 3、HRAS、VEGFA等靶點(diǎn)的度值較高,與其相互作用的蛋白較多。相關(guān)研究表明[15],AKT1 在β-catenin/Tcf-4 信 號(hào)通 路促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用,AKT1可能是腦膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn),也是防止膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的有效途徑。STAT3在膠質(zhì)瘤中廣泛表達(dá),而在瘤周組織及正常組織中的表達(dá)通常較低或不表達(dá),STAT3的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活、增殖、遷移、侵襲等,最終導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]。RAS 蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),并且與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān),而低表達(dá)的RAS蛋白可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。葛全興等[18]的研究發(fā)現(xiàn),VEGFR2優(yōu)先表達(dá)于CD133人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞表面及惡性腦膠質(zhì)瘤病灶小血管周?chē)?其增殖、生長(zhǎng)能力和致瘤性,可能部分依賴(lài)于VEGFR2-Neuropilin-1(NRP1)的信號(hào)傳遞,可能在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖和生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮一定作用。因此,上述靶點(diǎn)可能在射干治療腦膠質(zhì)瘤的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

GO功能和KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示,射干治療腦膠質(zhì)瘤的過(guò)程涉及肽基絲氨酸磷酸化、蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基絲氨酸修改等生物過(guò)程和PI3K/Akt信號(hào)通路、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、Rap1 信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等通路。PI3K-Akt信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中,在細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化過(guò)程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用[19]。Rap1 GTP酶激活蛋白(Rap1GAP)被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因,在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[20-21]。MAPK 信息傳遞系統(tǒng)是調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,能夠影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和存活,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[22]。這些信號(hào)通路都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用射干提取物用于其對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87相關(guān)蛋白、mRNA 表達(dá)和細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,射干提取物能夠下調(diào)VEGF 和MMP9蛋白表達(dá),通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制U87細(xì)胞的增殖,這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白和通路結(jié)果相一致。

綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò),分析了射干治療腦膠質(zhì)瘤的活性成分、靶點(diǎn)以及涉及的生物過(guò)程和信號(hào)通路,并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了關(guān)鍵藥效分子與核心靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合活性,結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到了射干對(duì)于VEGF、MMP9 蛋白表達(dá)和PI3K/AKT 信號(hào)通路的作用結(jié)果,初步闡述了射干治療腦膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制,說(shuō)明了作用多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn),為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供了參考。