靶向巨噬細(xì)胞的納米抗體PET分子探針68 Ga-NOTA-Nb119的制備方法

張嘉欣 ,張明如 ,郭玉呈 ,龐于成 ,王馨怡 ,李璐瑤 ,鄭 芳

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710061;2.空軍醫(yī)科大學(xué)西京醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,陜西西安 710032)

正電子發(fā)射斷層成像(positron emission computed tomography,PET)是分子影像學(xué)中常用的定位定量檢測(cè)技術(shù),可實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、定位、定量監(jiān)測(cè)體內(nèi)抗原表達(dá)情況和預(yù)測(cè)疾病發(fā)展。成功的PET 探針應(yīng)同時(shí)具備高特異性和低信噪比的特征。近幾十年,抗體工程的發(fā)展和長(zhǎng)半衰期核素的生產(chǎn)推動(dòng)了關(guān)于PET 探針的研究。通常利用大環(huán)內(nèi)酯螯合劑將放射性元素與抗體或多肽螯合制備成PET/CT 的探針,通過(guò)靜脈注射對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷[1]。納米抗體(nanobody,Nb)是目前己知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小抗體單位,是傳統(tǒng)抗體的十分之一[2]。Nb的高穩(wěn)定性、強(qiáng)穿透力、高親和力和低免疫原性等特性使其可成為更優(yōu)于其他抗體的分子影像探針。Vsig4(V-set and Ig domain-containing 4)是免疫球蛋白超家族補(bǔ)體受體,屬于Ⅰ型跨膜蛋白,定居于巨噬細(xì)胞[3]。Vsig4的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)展密切相關(guān),高表達(dá)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,因此檢測(cè)Vsig4可協(xié)助臨床預(yù)測(cè)與監(jiān)控癌癥的發(fā)展。本課題組前期構(gòu)建了抗Vsig4的納米抗體Nb119,其抗原結(jié)合特異性和親和力得到了初步驗(yàn)證,用锝標(biāo)記的Vsig4 探針99mTc-Nb119 用于SPECT 僅在正常肝臟有陽(yáng)性信號(hào),不影響肺部腫瘤的分子影像學(xué)檢測(cè)[4]。本研究成功構(gòu)建了68Ga-NOTANb119,為靶向巨噬細(xì)胞的Nb119 向炎癥和腫瘤的免疫細(xì)胞分子影像學(xué)PET 的應(yīng)用推進(jìn),奠定實(shí)驗(yàn)方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

WK6菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存;1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(p-SCN-Bn-NOTA,NOTA)購(gòu)自Macro-cyclics公司;HIS-Select HF鎳親和凝膠購(gòu)自德國(guó)Merck公司;PD-10蛋白分離柱購(gòu)自美國(guó)GE公司;體積排阻層析柱購(gòu)自美國(guó)GE 公司;色譜柱購(gòu)自美國(guó)菲羅門(mén)公司。其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 納米抗體Nb119和BCⅡ10表達(dá)純化

將表達(dá)載體p HEN6C-BCⅡ10、p HEN6C-Nb119轉(zhuǎn)入WK6感受態(tài)。挑單克隆菌落于LB 過(guò)夜培養(yǎng)。1∶100接菌至TB培養(yǎng)基,培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,加終濃度1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)劑。過(guò)夜培養(yǎng),收集菌體。搖床4℃糖裂解菌體,取上清。鎳珠親和純化,用0.5 mol/L咪唑洗脫,濃縮后用體積排阻層析柱純化樣品,并檢測(cè)蛋白濃度。

1.3 NOTA標(biāo)記Nb119和BCⅡ10

取4 mg Nb119(1 eq.)溶于500μL 去離子水中,稱(chēng)取3.2 mg NOTA(20 eq.)溶于200μL 二甲基亞砜(DMSO)中,將兩者混合,再加入2.2μL 三乙胺(40 eq.)。將混合液置于850 r/min的搖床上,于室溫下孵育24 h,用PD-10純化NOTA-Nb119。利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)檢測(cè)Nb119標(biāo)記NOTA 前后的分子量。BCⅡ10標(biāo)記方法相同。

1.4 68 Ga-NOTA-Nb119和68 Ga-NOTA-BCⅡ10合成

取10μL NOTA-Nb119(5μg/μL),依次加入200μL新鮮淋洗得到的68GaCl3液(185 MBq)和55μL 0.25 mol/L的Na Ac緩沖溶液,將混合液置于37℃下孵育15 min。利用Radio-HPLC 檢測(cè)68Ga-NOTANb119的放化純度。BCⅡ10標(biāo)記方法相同。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

蛋白純化通過(guò)蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)AKTA 蛋白層析系統(tǒng)獲得數(shù)據(jù)結(jié)果,隨后通過(guò)曲線繪制統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Graph Pad Prism 7.0 進(jìn)行線性圖的分析和處理。ultrafleXtreme MALDI-TOF質(zhì)譜儀收集的結(jié)果,通過(guò)flex Control軟件進(jìn)行儀器控制盒自動(dòng)數(shù)據(jù)分析。Radio-HPLC數(shù)據(jù)通過(guò)HPLC安捷倫1200工作站軟件收集并分析獲得。

2 結(jié)果

2.1 Nb119和BCⅡ10純化結(jié)果

經(jīng)過(guò)原核表達(dá)以及鎳柱純化后,獲得Nb119和BCⅡ10的納米抗體,利用體積排阻層析進(jìn)一步純化,共獲得6.3 mg Nb119和9.6 mg BCⅡ10(圖1)。

圖1 納米抗體的表達(dá)和純化Fig.1 Expression and purification of nanobodies

2.2 NOTA-Nb119和NOTA-BCⅡ10合成鑒定

PD-10純化后,獲得蛋白總量為2.06 mg,NOTANb119主要集中在第5至第9管中,第6管濃度最高,為1 184.544μg/m L(表1)。SDS-PAGE 電泳鑒定結(jié)果顯示,第5泳道的條帶滯后于第3泳道條帶,電泳條帶明顯滯后(圖2),說(shuō)明納米抗體成功偶聯(lián)NOTA后其分子量變大。

圖2 SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)納米抗體Fig.2 SDS-PAGE analysis of nanobody with Coomassie stain

表1 Nanodrop檢測(cè)收集到的NOTA-Nb119蛋白質(zhì)含量Tab.1 Nanodrop detected the protein content of the collected NOTA-Nb119

NOTA-BCⅡ10經(jīng)PD-10純化后,共獲得2.33 mg NOTA-BCⅡ10。Nanodrop檢測(cè)發(fā)現(xiàn)第4至第9管樣本蛋白含量高,其中第7 管蛋白質(zhì)含量最高,為537.701μg(表2)。

表2 Nanodrop檢測(cè)收集到的NOTA-BCⅡ10蛋白質(zhì)含量Tab.2 Nanodrop detected the protein content of NOTABCⅡ10 collected

2.3 NOTA-Nb119的MALDI-TOF檢測(cè)結(jié)果

MALDI結(jié)果顯示,螯合物的分子量大于納米抗體,偶聯(lián)前后分子差為461.713,NOTA 除去3個(gè)Cl后分子量為450(圖3),證明每個(gè)納米抗體上成功標(biāo)記1個(gè)NOTA。

圖3 MALDI分析偶聯(lián)分子的結(jié)果Fig.3 MALDI analysis of coupling molecules

2.4 68 Ga-NOTA-Nb119和68 Ga-NOTA-BCⅡ10的鑒定

通過(guò)檢測(cè)樣品放射活性可知68Ga-NOTA-Nb119主要集中在第3 至第9 管(表3)。將68Ga-NOTANb119經(jīng)過(guò)Radio-HPLC分析,通過(guò)HPLC自帶軟件對(duì)放射峰面積進(jìn)行計(jì)算,其放化純度為91.159%(圖4);68Ga-NOTA-BCⅡ10放化純度為91.445%(圖5)。

圖4 68 Ga-NOTA-Nb119的Radio-HPLC分析結(jié)果Fig.4 Radio-HPLC analysis of 68 Ga-NOTA-Nb119

圖5 68 Ga-NOTA-BCⅡ10的Radio-HPLC分析結(jié)果Fig.5 Radio-HPLC analysis of 68 Ga-NOTA-BCⅡ10

表3 純化后蛋白的68 Ga-NOTA-Nb119放射活性Tab.3 Activity of purification protein of 68 Ga-NOTA-Nb119

3 討 論

臨床上常用的分子影像探針基本是針對(duì)細(xì)胞代謝的差異性而設(shè)計(jì)的。根據(jù)在癌變組織和炎癥組織中糖異生作用顯著增強(qiáng)的原理,通常使用18F-脫氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)作為影像學(xué)探針。18F-FDG 經(jīng)血液進(jìn)入細(xì)胞后由GLUT 轉(zhuǎn)運(yùn)并且在細(xì)胞內(nèi)磷酸化,而通常FDG-6-磷酸酶會(huì)停留在細(xì)胞內(nèi),但是由于肝臟中磷酸酶活性很高[5-6],因此,18F-FDG 的敏感性差,準(zhǔn)確率低,癌癥誤判率高達(dá)40%～50%,不能作為常規(guī)的檢驗(yàn)方法[7]。而11C-醋酸鹽(11C-acetate)用于衡量游離脂肪酸代謝,對(duì)高分化肝腫瘤的影像效果比18F-FDG 的敏感性高[8]。膽堿(choline)用于衡量磷脂的代謝從而達(dá)到間接揭示細(xì)胞膜組成的目的,據(jù)報(bào)道11C-choline和18F-choline的膽堿信號(hào)在適度分化的肝癌中較高,可達(dá)到84%的診斷率[9]。64CuCl2則利用肝癌區(qū)域發(fā)生生理性的銅攝入量低這一現(xiàn)象,比較銅代謝在腫瘤和肺細(xì)胞中的差異[10]。但是,代謝性探針的特異性普遍不高,特別當(dāng)處于炎癥環(huán)境,其代謝功能受損,更進(jìn)一步造成腫瘤組織的高背景和低信噪比,或者分子影像探針的腫瘤組織的滲透率不高,極大影響了圖像質(zhì)量。因此,設(shè)計(jì)肝臟的新型分子影像學(xué)探針是近些年的熱點(diǎn)和難點(diǎn),特別是急需填補(bǔ)針對(duì)重要效應(yīng)細(xì)胞的特異性探針的空白。

近幾年,單克隆抗體的PET 探針在臨床研究中備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體和三特異性抗體可提高腫瘤靶向性[11-12]。然而,傳統(tǒng)抗體分子量較大,腎小球難以濾出,且新生成的Fc受體可影響IgG代謝,導(dǎo)致傳統(tǒng)抗體血清半衰期長(zhǎng),需要半衰期長(zhǎng)的核素協(xié)助合成PET 探針。納米抗體的優(yōu)點(diǎn)恰好可彌補(bǔ)傳統(tǒng)抗體的不足,其生物工程潛力巨大,具有作為多模態(tài)影像學(xué)探針的潛質(zhì),已經(jīng)成功地應(yīng)用于熒光成像、核磁共振、SPECT 和PET 成 像研究領(lǐng) 域[13]。LV 等[14]成功構(gòu)建特異結(jié)合PD-L1 的68Ga-NOTANb109探針,對(duì)PD-L1表現(xiàn)出高親和力,在對(duì)移植瘤小鼠尾靜脈注射68Ga-NOTA-Nb109 探針時(shí),經(jīng)PET成像可明顯看到68Ga-NOTA-Nb109在高表達(dá)PD-L1的腫瘤處大量聚集,并且可在血液、肌肉中被快速代謝。此外,68Ga-NOTA-Nb109可通過(guò)監(jiān)測(cè)PD-L1的表達(dá)水平,協(xié)助臨床腫瘤治療[15]。VANEYCKEN等[16]用99mTc 成功標(biāo)記HER2 納米抗體2Rs15d,SPECT 成像分析發(fā)現(xiàn)99mTc-2Rs15d在腫瘤中大量聚集,且在非靶器官中聚集量少且代謝速度快;靜脈注射1 h后被代謝,且去除His標(biāo)簽可顯著加快代謝速度。國(guó)外合作單位的68Ga標(biāo)記的HER2納米抗體順利完成乳腺癌分子影像的Ⅰ期臨床試驗(yàn),該研究中實(shí)現(xiàn)了原發(fā)病灶和/或轉(zhuǎn)移病灶HER2狀態(tài)的安全、無(wú)創(chuàng)可視化。該示蹤劑的Ⅱ期研究正在進(jìn)行[17-18]。

Vsig4是肝臟Kupffer細(xì)胞(KCs)表面的受體,其生理功能是作為巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體,可直接捕獲肝臟血液中的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,介導(dǎo)KCs的自噬和細(xì)菌吞噬體的形成,從而輔助KCs 的抑菌功能[13]。此外Vsig4還直接抑制T 細(xì)胞和NKT 細(xì)胞增殖和活性,抑制IL-2細(xì)胞因子表達(dá),在維持肝臟低免疫性方面起到一定作用[19]。本課題組前期研發(fā)了應(yīng)用99mTc標(biāo)記的Nb119作為特異性分子探針,靶向結(jié)合滑膜組織巨噬細(xì)胞。在關(guān)節(jié)炎模型中被證實(shí)有早期預(yù)測(cè)診斷、病程監(jiān)控和療效評(píng)價(jià)一體化的新型納米抗體探針。在SPECT/CT 實(shí)驗(yàn)中證實(shí)僅在炎癥靶器官有顯著特異性的Nb119信號(hào),其他的組織和免疫器官非特異性背景極低,納米抗體的靶向性準(zhǔn)確,有良好的成像效果。此外,針對(duì)靶向Vsig4 的Nb119對(duì)常規(guī)關(guān)節(jié)炎用藥地塞米松的療效進(jìn)行了影像學(xué)檢測(cè),成像效果良好,達(dá)到可視化藥物療效的目的[4]。近期發(fā)現(xiàn)Vsig4水平升高是嗜血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥的代替標(biāo)記物,對(duì)于血漿中Vsig4的表達(dá)水平是否與年齡有關(guān)的研究仍在繼續(xù),或許Nb119的PET探針可用于檢測(cè)血漿中Vsig4表達(dá)水平,評(píng)估人體健康狀態(tài)[18-21]。同時(shí),Vsig4的缺失可加速脂質(zhì)沉積,引起非酒精性脂肪性肝病。因此,臨床上同位素標(biāo)記的Nb119可協(xié)助診斷非酒精性脂肪肝[22]。

本研究成功制備68Ga-NOTA-Nb119,經(jīng)Radio-HPLC檢測(cè),獲得穩(wěn)定的Nb 分子探針。通過(guò)兩種Nb和68Ga的標(biāo)記,證明本研究所用的螯合方法可推廣使用于其他Nb及小分子蛋白。此外,Nb在腫瘤組織中滲透性強(qiáng)、成像快、體內(nèi)代謝時(shí)間短,可減少放射性元素在人體內(nèi)滯留時(shí)間,更適用于臨床應(yīng)用。然而,國(guó)內(nèi)利用Nb 制備的分子影像學(xué)探針的研究較少。本研究制備的68Ga-NOTA-Nb119 探針不僅可以作為新型PET/CT 探針,監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生;同時(shí),Nb119可以中和巨噬細(xì)胞的Vsig4,活化T 細(xì)胞,成為新型免疫激活劑。68Ga-NOTA-Nb119為肺癌的早期診斷、監(jiān)測(cè)和療效評(píng)估提供新靶點(diǎn)和影像學(xué)新途徑,填補(bǔ)針對(duì)重要效應(yīng)細(xì)胞的特異性探針在肺癌實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的研究空白。