血清SPINK1/SPP1聯(lián)合診斷原發(fā)性肝癌的效能評價

李 君 ,楊 昭 ,仝曉寧 ,崔佳奇

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一臨床醫(yī)學(xué)院;3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康管理中心,陜西西安 710061)

2020年,我國原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC)發(fā)病率居惡性腫瘤第5 位,死亡率居第2 位。我國近五年原發(fā)性肝癌平均年發(fā)病例數(shù)為42.3 萬例,占全球42.5%,肝癌成為嚴(yán)重危害我國國民身體健康的疾病之一[1]。PLC 包括肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICH),其 中HCC 占75%～85%。70%～90%的HCC 患者存在肝硬化,同時,肝硬化患者五年內(nèi)的HCC累積發(fā)生率為5%～30%[2]。HCC起病隱匿且早期并無明顯臨床癥狀,因此,目前大多數(shù)患者在診斷時便已進(jìn)入中晚期,從而錯過最佳治療時期,導(dǎo)致HCC 患者5年生存率僅有6%～9%。研究顯示,若能得到早期診斷并盡早配合手術(shù)、化療等手段積極治療,患者5年生存率可提高10倍,最高可接近75%[3]。因此,早期正確診斷HCC對于指導(dǎo)患者及早治療以及改善預(yù)后至關(guān)重要。目前HCC 的早期篩查主要通過甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)結(jié)合影像學(xué)做出診斷。實際上,AFP對于HCC的診斷價值較為有限,當(dāng)其截斷值(cutoff)取20～100 ng/m L時,診斷靈敏度和特異性分別僅為0.61和0.86[4]。而腹部超聲(ultrasound,US)作為臨床常用的HCC影像學(xué)篩查手段,盡管其靈敏度在0.51～0.87;由于其結(jié)果判讀依賴于專業(yè)人員的經(jīng)驗以及在肥胖和嚴(yán)重肝硬化患者中應(yīng)用有限,故并不作為臨床一線首選的篩查手段。至于其他影像學(xué)方法,如計算機(jī)成像(computed tomography,CT)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),雖靈敏度高于US,但因其費(fèi)用問題,也不作為常規(guī)的HCC篩查方法[5]。因此,血清學(xué)檢查有著相對無侵入性、方法學(xué)簡便、成本低廉、患者依從性高等優(yōu)點,在早期篩查、有效診斷HCC及判斷患者預(yù)后方面表現(xiàn)出更大的價值和潛力近年來研究發(fā)現(xiàn),絲氨酸蛋白酶抑制劑因子Kazal 1型(SPINK1)、骨橋蛋白(SPP1)在多種腫瘤組織中顯著高表達(dá)[6],且這兩者均屬于分泌型蛋白,具有作為血清學(xué)標(biāo)志物的研究價值。本研究旨在比較SPINK1、SPP1和AFP對原發(fā)性肝癌的診斷效能的差異,以期尋找更有效的血清學(xué)標(biāo)志物彌補(bǔ)AFP的診斷缺陷。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

共納入西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2020年8月至2021年6月符合標(biāo)準(zhǔn)的臨床血清樣本419例進(jìn)行回顧性研究,包括正常對照標(biāo)本93例、CHB 72例、肝硬化(liver cirrhosis,LC)77 例及HCC 188 例。LC及HCC入組樣本均經(jīng)病理及影像學(xué)方法確診。所有血清標(biāo)本均來源于患者入院后首次實驗室檢查剩余血清。CHB診斷依據(jù)血清標(biāo)志物HBs Ag持續(xù)6個月以上。正常對照收集于同期本院體檢中心健康體檢人群的標(biāo)本,年齡及性別比例于疾病組相近。所涉及實驗室指標(biāo)結(jié)果均來源于入院后初首次檢查。AFP通過德國羅氏公司的Cobas 8000 e602電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測,血小板(PLT)通過日本西斯美康XN-9000全自動血球分析儀檢測,白蛋白(ALB)通過日本日立Labospect 008全自動生化分析儀檢測。

1.2 血清SPINK1及SPP1的檢測

SPINK1及SPP1血清濃度檢測通過ELISA 法。ELISA 試劑盒購自武漢云克隆生物技術(shù)有限公司。具體實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有連續(xù)型變量分析前首先通過Shapiro-Wilk檢驗分析其正態(tài)性,通過Levene檢驗方差齊性。滿足正態(tài)分布及方差齊性的指標(biāo),多組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較其組間差異,方法分析事后多重比較選擇最小顯著性差異法,LSD-t(least significance difference)。對于不滿足正態(tài)分布的指標(biāo),采用Kruskal-Wallis秩和檢驗比較多組間差異,多重比較時進(jìn)行所有成對比較。對于構(gòu)成比資料,通過χ2檢驗比較其差異。采用Logistic回歸進(jìn)行診斷學(xué)模型構(gòu)建,將所有數(shù)據(jù)分為兩組,即腫瘤組和非腫瘤組(包括正常對照組及CHB 組、LC 組),將具有統(tǒng)計學(xué)差異的指標(biāo)納入聯(lián)合診斷模型,通過受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析確定最大約登指數(shù),計算相應(yīng)的Cutoff值、靈敏度、特異性及準(zhǔn)確率等指標(biāo),通過Cochran Q 檢驗評價聯(lián)合模型與各指標(biāo)單獨(dú)使用的診斷效能,通過Delong 檢驗比較ROC 曲線下面積(Area under curve,AUC)差異。除Delong檢驗使用MedCalc軟件外,其他統(tǒng)計學(xué)分析均使用SPSS 26.0版統(tǒng)計軟件。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病例基本信息

各組研究對象信息如表1所示,年齡分別為(54.9±9.1、54.7±8.9、55.6±8.1、58.5±8.5)歲,多組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Kruskal-Wallis統(tǒng)計量=16.150,P<0.05)。各組男性分別占69.9%、61.1%、62.3%及63.3%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.792,P>0.05)。ALB指標(biāo)整體呈下降趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Kruskal-Wallis統(tǒng)計量=64.672,P<0.000 1),但HCC組與LC組相比,雖有輕微上升,但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PLT指標(biāo)同ALB,從Normal到HCC組依次下降且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Kruskal-Wallis統(tǒng)計量=251.209,P<0.000 1)。而AFP則相反,整體呈上升趨勢且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Kruskal-Wallis統(tǒng)計量=175.052,P<0.000 1)。

表1 各組研究對象的基線資料Tab.1 Baseline characteristics of the subjects in all the groups

2.2 SPINK1/SPP1 血清濃度比較

SPINK1(Kruskal-Wallis統(tǒng)計量=287,P<0.000 1)及SPP1(Kruskal-Wallis統(tǒng)計量=246.9,P<0.000 1)血清濃度在多組間具有統(tǒng)計學(xué)差異。其中,SPINK1兩兩組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖1A)。而SPP1指標(biāo)則在Normal和CHB 組間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(Mann-Whitney統(tǒng)計量=2 908,P>0.05)(圖1B)。另外,我們還將所有對象分為腫瘤組(tumor)和非腫瘤對照組(non-tumor),后者包括Normal組、CHB組及LC 組。SPINK1(Mann-Whitney 統(tǒng)計量=1 778,P<0.000 1)及SPP1(Mann-Whitney統(tǒng)計量=2 604,P<0.000 1)在兩組間均具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖1C,圖1D)。

圖1 SPINK1(A,C) 與SPP1(B,D)血清濃度比較Fig.1 Comparison of serum concentrations of SPINK1(A,C)and SPP1(B,D)

2.3 建立聯(lián)合診斷模型

將數(shù)據(jù)分為腫瘤組(tumor)和非腫瘤對照組(non-tumor),將上述具有差異指標(biāo)(ABL、PLT、AFP、SPINK1及SPP1)進(jìn)行二元多因素Logistic回歸分析,方法采用向前步近。結(jié)果如表2所示,建立回歸方程Logit(P)=ωT+β0=0.356×SPP1+0.048×SPINK1-0.019×PLT-1.749。根據(jù)公式:

表2 采用二元Logistic 回歸分析建立多因素聯(lián)合診斷模型Tab.2 Construction of multivariable diagnostic model by binary Logistic regression

計算預(yù)測概率P,作為Combination指標(biāo)用于后續(xù)ROC曲線分析。

2.4 比較各指標(biāo)的診斷效能

圖2及表3顯示AFP、SPP1、SPINK1及聯(lián)合模型四個指標(biāo)的ROC曲線及統(tǒng)計分析結(jié)果,其中AFP的AUC 最小,為0.798(95%CI:0.755～0.845),SPP1及SPINK1 的AUC 分別為0.939(95%CI:0.916～0.963)和0.951(95%CI:0.931～0.971)。聯(lián)合模型可達(dá)到0.972(95%CI:0.957～0.986)。通過Delong檢驗比AUC差異,結(jié)果顯示,AFP均明顯小于其他各組(P<0.000 1)。SPP1 與SPINK1相比,AUC 差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩者分別與聯(lián)合模型相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(SPP1vs.Combination,P<0.001;SPINK1vs.Combination,P<0.05)。

表3 各指標(biāo)的ROC曲線分析結(jié)果及AUC差異比較Tab.3 ROC curve analysis and comparison of AUC differences

根據(jù)最大約登指數(shù)(圖2 ROC曲線中紅點位置)選擇對應(yīng)的cutoff值,并計算各指標(biāo)的靈敏度(sensitivity)、特異性(specificity)及準(zhǔn)確率(accuracy)。如表4所示,AFP的cutoff值取14.28時,其診斷靈敏度和特異性僅為0.678 和0.864,整體準(zhǔn)確率為0.785。SPP1和SPINK1均可達(dá)到0.9以上的靈敏度及0.85 以上的特異性,整體準(zhǔn)確率分別可達(dá)到0.877和0.892。聯(lián)合診斷模型各指標(biāo)均最佳,靈敏度、特異性及準(zhǔn)確率分別為0.938、0.918和0.926。最后通過Cochran Q 檢驗比較各指標(biāo)診斷結(jié)果的一致性,四組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Cochran Q統(tǒng)計量=37.190,P<0.001),再經(jīng)Dunn’s檢驗進(jìn)行兩兩比較,其中聯(lián)合模型、SPP1、SPINK1 三組間差異均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,表4)。但與AFP 相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001,表4)。以上結(jié)果表明,SPP1、SPINK1獨(dú)立或聯(lián)合使用時對于肝癌的診斷效能明顯優(yōu)于現(xiàn)有的標(biāo)志物AFP。

表4 各指標(biāo)的最優(yōu)截斷值及診斷效能參數(shù)Tab.4 Optimal cutoff values and the performance of each indicator

圖2 AFP、SPP1、SPINK1及聯(lián)合模型診斷肝癌的ROC曲線分析Fig.2 ROC curves of AFP,SPP1,SPINK1 and combination model in the diagnosis of HCC from non-HCC groups

3 討 論

PLC由于起病隱匿且缺乏特異性臨床癥狀,多數(shù)患者在診斷時已處于中晚期,因而錯過最佳治療窗口而嚴(yán)重影響患者預(yù)后,因此,早期診斷是改善患者預(yù)后的重要突破點。血清標(biāo)志物由于方法簡便且具有極高的患者依從性,可以作為人群,尤其慢性肝炎等高危人群的動態(tài)監(jiān)測的理想手段。本研究即通過回顧性分析探討SPINK1及SPP1單獨(dú)或聯(lián)合診斷應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的診斷效能。SPINK1是蛋白酶抑制劑家族成員之一,是由56個氨基酸殘基組成的分泌型多肽,主要生理作用是抑制蛋白酶原等多種絲氨酸蛋白酶活性。SPINK1由胰腺腺泡細(xì)胞分泌,可逆性抑制Trypsin-1/2的活性[7-8]。SPINK1最初被命名為腫瘤相關(guān)胰酶抑制劑(tumor-associated trypsin inhibitor,TATI),來源于癌卵巢癌患者尿液[9]。隨后,其基因表達(dá)水平在多個腫瘤中得到廣泛研究并被觀察到顯著上調(diào)[10]。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),SPINK1與表皮生長因子(EGF)具有50%的同源性,結(jié)構(gòu)上也具有相似性[11-12]。推測SPINK1 可能通過自分泌或旁分泌途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究顯示,SPINK1能刺激人成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞生長。另外,作為分泌型蛋白,SPINK1在腫瘤組織中高表達(dá),使其具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛在價值。血清或尿液中SPINK1有可能作為HCC 新的診斷工具。本研究結(jié)果顯示,雖然在HCC 組血清SPINK1水平明顯高于其他非腫瘤組,但也需要注意的是,相比正常對照組,SPINK1在慢性肝炎及肝硬化組也有不同程度的升高,且隨著肝炎,肝硬化到肝癌的病程進(jìn)展,數(shù)據(jù)的離散程度增加,這必將導(dǎo)致診斷效能的降低。事實上,SPINK1作為一種急時相反應(yīng)蛋白(acute-phase reaction protein,ARP),在慢性乙肝患者體內(nèi)升高,可能是機(jī)體應(yīng)對HBV 病毒感染的免疫反應(yīng)[13]。因此,進(jìn)一步研究患者免疫狀態(tài)及HBV 病毒復(fù)制與SPINK1水平的關(guān)系,并作為SPINK1診斷HCC 的校正因素,以提高效能。遺憾的是,本研究大部分CHB患者均來自門診,所能獲取的免疫指標(biāo)有限,無法進(jìn)一步分析。

此外,聯(lián)合多個指標(biāo)也是提高診斷效能的選擇之一。本研究即同時檢測了SPP1血清水平并聯(lián)合用于HCC 的診斷。SPP1最初被鑒定為一種骨基質(zhì)蛋白(bone matrix protein,BMP),由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生,因此又被稱為早期T 淋巴細(xì)胞激活1(early t-lymphocyte activation-1,Eta-1)[14]。生理條件下作為細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。SPP1 與整合素(integrins)結(jié)合促進(jìn)IL-6/IL-12分泌,通過與CD44結(jié)合抑制IL-10分泌。導(dǎo)致活化的T 細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向發(fā)育[15]。近年來,SPP1血清濃度作為潛在診斷或檢測標(biāo)志物受到廣泛而密切的關(guān)注[6,16-18]。數(shù)據(jù)顯示,SPP1作為標(biāo)志物對胰腺癌的診斷靈敏度和特異性分別為80%和97%,而同一批研究對象中,傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CA19-9僅有62%的靈敏度[19]。在卵巢癌中,SPP1 對于早期(stage Ⅰ/Ⅱ)和晚期(stage Ⅲ/Ⅳ)的靈敏度分別為80.4%和85.4%[20]。在早期肝癌中,SPP1診斷靈敏度可達(dá)75%,遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的AFP(46%)[21]。通過分析發(fā)現(xiàn),SPP1水平似乎也隨著病情進(jìn)展逐漸升高,且離散程度增加,可能與其本質(zhì)上作為免疫因子的功能有關(guān)。但整體上,不管是單獨(dú)應(yīng)用或SPINK1/SPP1聯(lián)合應(yīng)用,靈敏度和特異性均可達(dá)到0.9和0.85以上,遠(yuǎn)高于目前廣泛應(yīng)用的AFP。然而,作為回顧性研究,其缺陷在于預(yù)測HCC發(fā)生的能力有限,需要前瞻性數(shù)據(jù)的支撐。因此,對于本次研究中的非腫瘤組病例,將以cutoff作為分組依據(jù),持續(xù)跟蹤,并在該過程中納入新的病例,研究SPINK1/SPP1預(yù)測在高危人群中發(fā)生HCC的能力。