脂肪酸代謝相關(guān)基因預(yù)后模型在腎透明細(xì)胞癌中的應(yīng)用

段萬里,鄧 騫,任 偉,程永毅,孫 羿

(陜西省人民醫(yī)院泌尿外科,陜西西安 710068)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿道的常見高度惡性腫瘤,約占腎臟惡性腫瘤的80%～90%[1],約占全球新發(fā)癌癥的4%[2],并以每年2%的速度增長[3]。2022年,估計(jì)美國將有大約79 000人被診斷為RCC,大約13 920人將死于RCC[4]。大約65%的RCC患者為局部腫瘤,通?？梢酝ㄟ^手術(shù)成功控制[5],約30%～70%的患者在腫瘤術(shù)后可能會(huì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。此外,30%的RCC患者在診斷時(shí)已有轉(zhuǎn)移[6]。局限性腎癌患者的5年生存率為76.5%,而轉(zhuǎn)移性腎癌(metastatic RCC,m RCC)患者只有15.3%[7]。RCC中約70%～75%為腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)[8-9]。因此,建立準(zhǔn)確預(yù)后模型在指導(dǎo)RCCC患者的臨床診治中具有重要意義。

脂肪酸既可作為底物參與能量代謝,也可作為必需組成成分參與生物膜脂質(zhì)構(gòu)成[10]。惡性腫瘤通過從頭合成的脂肪酸代謝改變以支持其高能量需求、腫瘤發(fā)生和逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)[11-12]。RCC 中的異常脂肪酸代謝已被證實(shí)[13]。盡管脂肪酸對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要意義,然而,RCC 中的脂質(zhì)代謝重塑并未受到與其他癌癥相同的關(guān)注[14]。

本研究通過癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)建立了腎癌脂肪酸代謝相關(guān)多基因預(yù)后模型,并經(jīng)驗(yàn)證確定該模型可較好的獨(dú)立預(yù)測(cè)RCCC患者預(yù)后,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

從TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲取RCCC 的m RNA 表達(dá)矩陣(HTSeq-FPKM)及臨床病理因素?cái)?shù)據(jù)[包括:性別(Gender)、年齡(Age)、病理組織分級(jí)(Grade)、臨床分期(Stage)、腫瘤大小(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)和總生存時(shí)間(overall survival,OS)]。從GSEA(Gene Set Enrichment Analysis,https://www.gsea-msigdb.org)網(wǎng)站輸入“fatty acid metablism”查找脂肪酸代謝相關(guān)基因集“KEGG_FATTY_ACID_METABOLISM”。所用數(shù)據(jù)下載截止日期為2020/02/15。

1.2 方法

所有統(tǒng)計(jì)分析和制圖均采用R(v.4.1.3)。從TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù),然后用edgeR 和DEGseq軟件包分析篩選差異表達(dá)的脂肪酸代謝相關(guān)基因(differentially expressed genes associated with fatty acid metabolism,DEGs-FAM)。結(jié)合OS,利用Survival軟件包篩選出對(duì)患者OS有影響的DEGs-FAM,多元Cox回歸分析構(gòu)建多基因預(yù)后模型,計(jì)算所有患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(risk score,RS)及RS中位值(Me),K-M 生存曲線比較高風(fēng)險(xiǎn)組(RS>Me)及低風(fēng)險(xiǎn)組(RS≤Me)組間的生存差異。將RS與臨床病理因素納入Cox回歸分析中,分析RS是否為影響RCCC 患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估基于脂肪酸代謝相關(guān)基因的預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。ggboxplot包比較RS及其相關(guān)基因在臨床病理因素分組中的差異。GSEA 分析風(fēng)險(xiǎn)分組中脂肪酸代謝相關(guān)的基因及富集差異,并將隨機(jī)組合的數(shù)量設(shè)置為1 000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

DEGs-FAM 的篩選標(biāo)準(zhǔn)為:|log(Fold Change)|>1,P<0.05。GSEA 篩選條件為:FDR<0.25,normalizedP<0.05。除RS為連續(xù)變量外,納入Cox回歸分析的其余變量皆為分類變量。兩組之間的比較采用Wilcox 檢驗(yàn);多組之間比較采用Kruskal檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的脂肪酸代謝相關(guān)基因的篩選

從TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲取了539例RCC組織樣本m RNA 表達(dá)矩陣、72 例癌旁正常腎組織樣本m RNA 表達(dá)矩陣及537例相關(guān)患者的臨床病理因素信息。從GSEA 網(wǎng)站查找到42個(gè)脂肪酸代謝相關(guān)基因。經(jīng)Wilcox 檢驗(yàn)篩選后發(fā)現(xiàn),有17個(gè)脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中CPT1B上調(diào),ACAT1、ADH1C、HADH等16 個(gè)基因下調(diào)。詳見圖1。

圖1 腎透明細(xì)胞癌中脂肪酸代謝相關(guān)差異基因表達(dá)Fig.1 Differential gene expression related to fatty acid metabolism in renal clear cell carcinoma

2.2 脂肪酸代謝相關(guān)多基因預(yù)后模型的建立

17個(gè)差異基因單因素Cox回歸模型按P<0.05篩選 出ADH6、CPT1B、ACAA1、ECI2、ALDH1B1、ACADM、CYP4A22、HADH、CYP4A11、ACAT1、ACADSB共11個(gè)差異基因可能影響患者的總體生存期,見圖2。將11個(gè)上述基因進(jìn)行多因素Cox分析(P<0.05)后篩選出4 個(gè)差異基因(CPT1B、HADH、CYP4A11、ACADSB)建立腎癌脂肪酸代謝相關(guān)基因預(yù)后模型,見表1。其中高表達(dá)CPT1B患者預(yù)后較差(P<0.001),低表達(dá)HADH、CYP4A11、ACADSB患者預(yù)后不良(P<0.001)。預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(RS)公式為:RS=0.490×CPT1B-0.428×HADH-0.11×CYP4A11-0.372×ACADSB。依據(jù)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式計(jì)算RS,中位RS值:Me=0.937 8,按Me將患者平均分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。結(jié)果如圖3A所示,高風(fēng)險(xiǎn)組5 年生存率為45.7%,低風(fēng)險(xiǎn)組的5年生存率為76.7%(P<0.001)。低風(fēng)險(xiǎn)組總生存率明顯優(yōu)于高風(fēng)險(xiǎn)組(Logrankχ2=40.571,P<0.001),75%OS:5.73年(低風(fēng)險(xiǎn)組)vs.2.17年(高風(fēng)險(xiǎn)組)。如圖3B、圖3C所示RS與死亡患者數(shù)量正相關(guān),即低RS的患者預(yù)后較好。圖3D為模型中相關(guān)基因在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中差異表達(dá)的熱圖分析展示。

圖2 單因素Cox分析腎透明細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)的脂肪酸代謝差異基因風(fēng)險(xiǎn)特征Fig.2 Univariate Cox analysis of genetic risk characteristics of differential fatty acid metabolism related to the prognosis of renal clear cell carcinoma

圖3 脂肪酸代謝相關(guān)基因預(yù)后模型生存分析及風(fēng)險(xiǎn)曲線Fig.3 Survival analysis and risk curve of prognosis model of fatty acid metabolism related genes

2.3 患者臨床病理因素特征

TCGA 數(shù)據(jù)庫中共獲得246個(gè)RCCC 患者的完整臨床病理因素?cái)?shù)據(jù),其中年齡≤65 歲的患者144例(58.5%),年齡>65歲的患者103例(42.5%);男性患者149例(60.6%),女性患者97例(39.4%),腎癌組織分級(jí)例數(shù)分別為:G1 3例(1.3%),G2 106例(43.1%),G3 100 例(100%),G4 37 例(15.0%)。病理分期分別為:Ⅰ期101 例(41.1%),Ⅱ期32 例(13.0%),Ⅲ期71例(28.9%),Ⅳ期42例(17.1%);T分期分別為:T1 105例(42.7%),T2 40例(16.3%),T3 94例(38.2%),T4 7例(2.8%);M 分期分別為:M0 205例(83.3%),M1 42例(16.7%);N 分期分別為:N0 232例(94.3%),N1 14例(5.7%)。

2.4 影響RCCC 患者生存危險(xiǎn)因素及其預(yù)測(cè)價(jià)值的分析

如圖4A 所示,單因素Cox 回歸分析顯示:RS(P<0.001)、年齡(P<0.05)、病理分級(jí)(P<0.001)、病理分期(P<0.001)、腫瘤大小(P<0.001)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況(P<0.001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P<0.01)是影響腎透明細(xì)胞癌患者OS 的危險(xiǎn)因素。多因素Cox回歸分析提示RCCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素為年齡(P<0.01)和RS(P<0.01),見圖4B。如圖5所示,5年生存情況的多指標(biāo)ROC 曲線分析中RS的AUC 值(0.802)最大(截?cái)帱c(diǎn):RS=0.454,P<0.001),提示該模型預(yù)測(cè)預(yù)后的能力良好。

圖4 影響246例患者總體生存期因素的單因素Cox(A)及多因素(B)回歸分析結(jié)果Fig.4 Univariate Cox(A)and multivariate regression analysis(B)of factors affecting the overall survival of 246 patients

圖5 5年生存多指標(biāo)ROC曲線Fig.5 Multi-index ROC curve of the patients’5-year survival

2.5 臨床病理因素分組中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及相關(guān)基因的差異

如圖6所示,CPT1B表達(dá)在各臨床特征分組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理組織分級(jí)越高、臨床分期越高、TNM 分期越低,CYP4A11、ACADSB表達(dá)越高(P<0.05)。病理組織分級(jí)越高、臨床分期越高、TM分期越低,HADH表達(dá)越高(P<0.05)。綜上提示CPT1B高表達(dá),CYP4A11、ACADSB、H ADH低表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。且RS隨著組織分級(jí)、病理分期、TNM 分期的升高而增高(P<0.05),提示預(yù)后越差。

圖6 腎癌脂肪酸代謝相關(guān)基因及風(fēng)險(xiǎn)分值的臨床相關(guān)性分析Fig.6 Clinical correlation analysis of genes and risk scores of fatty acid metabolism in renal cell carcinoma

2.6 GSEA分析

用GSEA 比較高危組和低危組之間的KEGG 基因集富集差異(FDR<0.25,normalizedP<0.05),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高風(fēng)險(xiǎn)組有0個(gè)基因集FDR<25%,1個(gè)基因集P<0.01,2個(gè)基因集P<0.05,在低風(fēng)險(xiǎn)組發(fā)現(xiàn)124 個(gè)基因集FDR<25%,47 個(gè)基因集P<0.01,81個(gè)基因集P<0.05。由于篇幅有限,本文僅展示前20個(gè)中與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的6個(gè)通路,主要有過氧化物酶、糖酵解糖生成、脂肪酸代謝、丙酮酸代謝、腎細(xì)胞癌、檸檬酸循環(huán)TCA 循環(huán),見表2。

表2 脂肪酸代謝相關(guān)基因預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分組GSEA分析Tab.2 GSEA analysis of prognostic risk of genes related to fatty acid metabolism

3 討 論

RCC是最常見的腎癌類型,每年美國近15 000人死亡與RCC有關(guān)[15]。由于傳統(tǒng)化療藥物治療RCC效果不佳,靶向及免疫治療的有限選擇及耐藥問題,加之腫瘤的異質(zhì)性,使得m RCC 的治療非常具有挑戰(zhàn)性[14]。近年來,RCCC 被確定為一種代謝性疾病[16-17]。除了眾所周知的有氧糖酵解和谷氨酰胺代謝外,最近的研究已經(jīng)開始揭示FA 代謝在癌變過程中的重新編程,這將不僅有助發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展的復(fù)雜分子模式,也為發(fā)現(xiàn)腎癌預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)物提供可能[18-19]。

脂肪酸不僅為癌細(xì)胞提供能量,維持體內(nèi)氧化還原平衡,而且參與合成癌細(xì)胞膜上磷脂結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而,RCC中的脂質(zhì)代謝重塑并未受到與其他癌癥相同的關(guān)注[14]。肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)為長鏈脂肪酸氧化的限速酶[20]。目前尚無CPT1B在腎癌方面的相關(guān)研究。TCGA 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CPT1B在腎透明細(xì)胞癌組織較正常組織表達(dá)上升,且高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。羥?；o酶A 脫氫酶(hydroxyacyl-Co A dehydrogenase,HADH)是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶。SHEN 等[21]發(fā)現(xiàn)H ADH在胃癌中低表達(dá),而且重要的是,胃癌腫瘤樣品中HADH的低表達(dá)與PTEN的低表達(dá)、p-Akt的高表達(dá)有關(guān),過表達(dá)HADH抑制胃癌細(xì)胞(MKN45)的遷移和侵襲。JIANG 等[22]研究發(fā)現(xiàn)H ADH的表達(dá)降低與KIRC 的不良預(yù)后和免疫浸潤有關(guān)。CYP4A11主要作用為催化人體肝臟和腎臟中脂肪酸的ω-羥基[23]。KIM 等[24]發(fā)現(xiàn)CYP4A11低表達(dá)是腎細(xì)胞癌的潛在不良預(yù)后因素。NWOSU 等[25]發(fā)現(xiàn)ACADSB在HCC細(xì)胞系中也顯著下調(diào)。LIU 等[26]發(fā)現(xiàn)ACADSB顯示出良好的ccRCC 診斷和預(yù)后能力,ACADSB的下調(diào)可能通過抑制RCC中的脂肪酸分解代謝、支鏈氨基酸分解代謝和鐵死亡來促進(jìn)腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)CYP4A11、ACADSB、H ADH在腎癌組織較正常組織低表達(dá),且低表達(dá)與組織分級(jí)及病理分期等臨床病理因素相關(guān),且低表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。GSEA發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)分組涉及的差異基因集主要有過氧化物酶、糖酵解糖生成、脂肪酸代謝、丙酮酸代謝、腎細(xì)胞癌、檸檬酸循環(huán)TCA 循環(huán)。以上研究表明參與脂肪酸代謝相關(guān)預(yù)后模型的基因可能在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

盡管最近的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析已經(jīng)確定了許多潛在的RCC預(yù)后生物標(biāo)志物,但仍沒有被廣泛接受的分子標(biāo)志物來預(yù)測(cè)RCC患者的預(yù)后[27-29]。本研究篩選TCGA數(shù)據(jù)庫中腎細(xì)胞癌DEGs-FAM,構(gòu)建了基于4個(gè)(CPT1B、HADH、CYP4A11、ACADSB)與OS相關(guān)腎癌脂肪酸代謝多基因的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型(OS模型),通過分析了該模型與臨床病理因素的相關(guān)性,驗(yàn)證了其準(zhǔn)確預(yù)測(cè)RCCC 患者預(yù)后的可行性。本研究豐富了精準(zhǔn)化預(yù)測(cè)腎癌患者預(yù)后的選擇,為理解RCC的分子機(jī)制及脂肪酸代謝相關(guān)預(yù)后及治療在腎癌中的應(yīng)用提供了新的思路。