泛素樣蛋白UBQLN2通過抑制結(jié)腸癌Wnt信號通路發(fā)揮抑癌作用

孫光源， 王曉元， 任艷麗， 尹 潔， 胡智潔， 武雪亮， 薛 軍

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 普通外科，河北 張家口 075000)

結(jié)直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌，發(fā)生率在不少地區(qū)有不同程度的增加趨勢[1]。結(jié)腸癌早期癥狀不明顯；大多患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于疾病的中晚期，嚴(yán)重影響患者的救治和預(yù)后，也給患者的家庭和社會造成了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以，結(jié)直腸癌的治療關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、及時診斷和規(guī)范治療[2]。中晚期結(jié)腸癌的治療包括手術(shù)、化療和免疫治療[3]。由于預(yù)后不良，結(jié)腸癌治療仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，迫切需要在臨床上探索新的治療方法和診斷標(biāo)志物。

Wnt信號通路是與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的促癌信號通路，其標(biāo)志蛋白質(zhì)β-聯(lián)蛋白(β-catenin)激活對腫瘤異常增殖至關(guān)重要[4]。泛素樣蛋白2(ubiquilin2, UBQLN2)是泛素樣蛋白質(zhì)家族的一員，UBQLN2在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)泛素化降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、溶酶體穩(wěn)態(tài)及自噬等過程中發(fā)揮著重要作用[5]，其中UBQLN2在惡性腫瘤例如骨肉瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，UBQLN在許多人類腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)性人類肺癌樣本中缺失和低表達(dá)，在肺癌細(xì)胞中UBQLN1的下調(diào)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且其可以作為非小細(xì)胞肺癌治療的潛在標(biāo)志物[5]。但是目前UBQLN2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及作用尚不清楚，UBQLN2與Wnt信號通路之間的研究尚未見報道。因此，本研究主要通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討和研究UBQLN2對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，同時重點(diǎn)關(guān)注UBQLN2與Wnt信號通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料和患者資料

HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116和HIEC細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購自HyClone；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛購自北京碧云天有限公司。一抗UBQLN2(Abcam，ab190283)、β-聯(lián)蛋白(Abcam，ab223075)、pGSK-3β(Cell Signaling Technology，9336)和肌動蛋白(actin)(Abcam，ab8226)。

選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院在2020年1月～2021年1月期間手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織90例和癌旁正常組織90例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診均為原發(fā)腫瘤，排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前行輔助放化療，伴轉(zhuǎn)移瘤、復(fù)發(fā)腫瘤，伴有心腦血管疾病及其他手術(shù)禁忌證。臨床資料收集患者的腫瘤分期以及患者生存期等指標(biāo)，分析UBQLN2蛋白質(zhì)表達(dá)與臨床病理特征。所有患者治療均以手術(shù)切除為主，本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d，將HCT116細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)，接種6孔板，轉(zhuǎn)染日細(xì)胞融合度為80%。在100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中分別加入2 μg pcDNA3.1-NC及pcDNA3.1-UBQLN2，再分別和100 μL含10 μL Lipofectamine的無血清DMEM培養(yǎng)基混合為轉(zhuǎn)染試劑，室溫保溫30 min。用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞后每孔加入0.8 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，加入0.2 mL 轉(zhuǎn)染試劑。對照組細(xì)胞不加轉(zhuǎn)染試劑，其他2組細(xì)胞分別加入含 pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-UBQLN2的轉(zhuǎn)染試劑。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)5 h，加入含血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后換篩選培養(yǎng)基。篩選培養(yǎng)基G418的濃度為500 μg/mL。篩選培養(yǎng)約20 d，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

轉(zhuǎn)染前1 d，對數(shù)期SW480細(xì)胞在6孔板中過夜，密度為3×105/well，每孔加入2.5 mL不含抗生素的生長培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長密度達(dá)60%，細(xì)胞中去除生長培養(yǎng)基，加入1.5 mL新鮮的不含血清的生長培養(yǎng)基。對于每個轉(zhuǎn)染的孔，按照如下方法分別準(zhǔn)備si-NC，si-UBQLN2 (50 nmol/L)(序列見Table 1)和 Lipofectamine RNAiMAX 混合物，在250 μL的無血清生長培養(yǎng)基中加入100 pmole siRNA，柔和混勻。Lipofectamine RNAiMAX使用前先混勻，再向250 μL生長培養(yǎng)基中加入5 μL，Lipofectamine RNAiMAX進(jìn)行稀釋，室溫下孵育5 min?；旌舷♂尯玫膕iRNA和Lipofectamine RNAiMAX，室溫下孵育20 min。加入混合物到含有HeLa 細(xì)胞的6孔板中，每孔終體積為2 mL，并輕晃混勻。在37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞 5～6 h。更換培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞48 h，轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，供后續(xù)使用。

Table 1 Primer sequence

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，數(shù)目約5×106個/mL，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。細(xì)胞洗滌，3 mL PBS洗滌1次。乙醇固定，離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4 ℃，1～2 h。細(xì)胞重懸，離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min。細(xì)胞過濾，400目的篩網(wǎng)過濾1次，1 000 r/min離心5 min，棄去PBS。染色，用1 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min。流式細(xì)胞儀檢測，PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488 nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。

1.4 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖

HCT116和SW480細(xì)胞分別過表達(dá)UBQLN2和沉默UBQLN2表達(dá)，培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)70%，收集細(xì)胞制備為1×104/mL細(xì)胞懸液。96孔板每孔添加細(xì)胞懸液100 μL，分別于0、12、24、36、48 h加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的吸光度值。

1.5 qRT-PCR檢測泛素樣蛋白2表達(dá)

HCT116和SW480細(xì)胞先用胰蛋白酶消化收集，PBS充分洗滌細(xì)胞去除殘余培養(yǎng)基，再加入1 mL Trizol進(jìn)行裂解。加入1 mL Trizol試劑，混勻，冰上孵育10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新EP管中；加入200 uL氯仿，劇烈振蕩15 sec，室溫孵育5 min；4 ℃，12 000 r/min離心15 min。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管，不要吸取中間相，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻約10次，室溫放置10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min。棄上清，1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀2次；4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清，室溫下風(fēng)干5 min，將RNA溶于15 μL～50 μL DEPC水中；立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并-80 ℃保存。儀器檢測目的基因相對GAPDH的表達(dá)水平。反應(yīng)條件設(shè)定如下：在95 ℃預(yù)變性10 min；在95℃下退化10 s; 在60 ℃下退火20 s并在72 ℃下延伸35 s。2-△△t方法用于計(jì)算UBQLN2相對表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光檢測Bcl-2/Bax

用聚乙烯亞胺或多聚賴氨酸涂覆蓋玻片，在室溫下放置 1 h，用無菌水充分漂洗蓋玻片 3 次，每次 1 h。使結(jié)直腸癌細(xì)胞在玻璃蓋玻片上生長，用PBS簡單漂洗。固定細(xì)胞：室溫下，在 4% 多聚甲醛中孵育細(xì)胞 10 min，用冰 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次?？乖迯?fù)：將抗原修復(fù)緩沖液(100 mmol/L Tris，5%尿素，pH 9.5)預(yù)熱至 95 ℃。具體方法為：玻片放入95 ℃水浴鍋，抗原修復(fù)緩沖液中修復(fù)；在 95 ℃ 下加熱蓋玻片 10 min；從抗原修復(fù)緩沖液中取出蓋玻片，隨后PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，每次 5 min。通透：用 PBS(含 0.1% ～0.25% Triton X-100)孵育樣品 10 min，用 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，每次 5 min。封閉與免疫染色：用 1% BSA、22.5 mg/mL 甘氨酸的 PBST (PBS + 0.1% Tween 20) 孵育細(xì)胞 30 min；室溫下，用稀釋UBQLN2(1∶1 000)在濕盒中孵育細(xì)胞1 h；倒出溶液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min；室溫下，用二抗(溶于1% BSA 中)避光孵育細(xì)胞1 h；倒出二抗溶液，用PBS避光洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。復(fù)染：用0.1～1 μg/mL DAPI孵育細(xì)胞1 min，用PBS漂洗細(xì)胞。封片：用一滴封片介質(zhì)封閉蓋玻片，用樹脂密封蓋玻片，避免樣品變干和在顯微鏡下移動，-20 ℃下避光保存。

1.7 免疫組化檢測泛素樣蛋白2

取出冷凍保存的標(biāo)本(結(jié)腸癌組織和鄰近的正常組織)，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切成3～4 μm的切片。將石蠟切片放入3% H2O2中，分別用二甲苯I和二甲苯II脫蠟10 min，在100%乙醇中按升序脫水2 min，95%乙醇中脫水2 min，80%乙醇中脫水2 min，70%乙醇中脫水2 min。然后，在振動臺中用蒸餾水(每次5 min)洗滌切片2次，在3% H2O2中浸泡10 min，并用蒸餾水清洗。在高壓下進(jìn)行抗原修復(fù)90 s，在室溫下冷卻切片，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液清洗，并于37 ℃下與5%牛血清白蛋白孵育30 min。添加UBQLN2抗體(1∶400)，并在4 ℃下孵育過夜。再添加二抗、辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合山羊抗鼠抗體，并在37℃下培養(yǎng)30 min。蘇木精用于細(xì)胞核染色30 s，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺用于顯色。在鹽酸-乙醇中將切片脫水至透明，用樹膠固定切片，在顯微鏡下觀察并拍照。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評估標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒的細(xì)胞，或染色>25%的細(xì)胞為UBQLN2陽性細(xì)胞。平均陽性染色面積百分比法分析免疫組化結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western印跡檢測

調(diào)整細(xì)胞數(shù)5×104/mL，細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右，收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，于4℃ 15 000 g下離心30 min，隨后4 ℃離心吸取上清即提供總蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)被定量后計(jì)算上樣量，加上樣緩沖液，樣品100 ℃煮5 min。SDS-PACE凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVD膜，脫脂牛奶封閉。然后在4 ℃下與一抗一起孵育過夜，UBQLN2(1∶1 000)、β-聯(lián)蛋白(1∶1 000)、pGSK-3β(1∶1 000)和肌動蛋白(1∶1 000)，次日再與二抗孵育，PBS清洗，ECL發(fā)光儀進(jìn)行發(fā)光拍照，Image-J軟件分析Western-blot灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS 20.0進(jìn)計(jì)分析，組間比較用t檢驗(yàn)，多組件比較用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泛素樣蛋白2在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)

為了初步探討UBQLN2在結(jié)腸癌中可能發(fā)揮的作用，免疫組化檢測結(jié)腸癌患者腫瘤組織和手術(shù)中腫瘤組織邊緣正常腸組織中UBQLN2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：UBQLN2在結(jié)腸癌腫瘤組織中的IHC染色陽性面積(12.21±2.45)顯著低于正常組織(35.75±11.98)(P=0.0032，F(xiàn)ig.1)，且通過UBQLN2與結(jié)腸癌病理特征之間的關(guān)系(Table 2)，初步可知UBQLN2在結(jié)腸癌中可能發(fā)揮抑癌作用。

Fig.1 UBQLN2 is highly expressed in colorectal cancer tumor tissues UBQLN2 protein expression was detected by immunohistochemistry in different colon cancer tissues. Error bars represent the means±SD from three independent experiments. ***P<0.001, **P<0.01

Table 2 Correlation between UBQLN2 expression and clinicopathological characteristics of human colon cancer

2.2 泛素樣蛋白2在體外結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)

在體外結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116和腸上皮正常細(xì)胞HIEC中進(jìn)一步觀察UBQLN2表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：UBQLN2在HT29、SW620、LOVO、HCT116中表達(dá)均低于HIEC細(xì)胞，且HCT116細(xì)胞表達(dá)最低，為對照組HIEC的0.25倍(P<0.001, Fig.2)，在SW480細(xì)胞中表達(dá)最高，灰度值為對照組HIEC的1.45倍(P=0.036, Fig.2)。

Fig.2 Expression of UBQLN2 is the highest in SW480 cells and the lowest in HCT116 cells Expression of UBQLN2 protein was detected by Western blotting in various colon cancer cell groups. Error bars represent the means±SD from three independent experiments. ***P<0.001, *P<0.05

2.3 泛素樣蛋白2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

為了研究UBQLN2在結(jié)腸癌中的作用，分別使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在HCT116中過表達(dá)UBQLN2，在SW480細(xì)胞中敲低UBQLN2(Fig.3A)，觀察到轉(zhuǎn)染后UBQLN2在HCT116細(xì)胞中過表達(dá)(P<0.001)，在SW480細(xì)胞低表達(dá)(P<0.001)(Fig.3B)。隨后，CCK-8進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行凋亡分析，以評估UBQLN2對HCT116和SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果正如Fig.3C,D所示，生長曲線分析顯示，HCT116細(xì)胞UBQLN2過表達(dá)培養(yǎng)48 h后細(xì)胞活力值0.76±0.13顯著低于對照組0.94±0.19，(P=0.031，F(xiàn)ig.3B)，SW480細(xì)胞UBQLN2敲低后培養(yǎng)48 h時細(xì)胞活力值1.12±0.24顯著高于對照組0.92±0.18，(P=0.029，F(xiàn)ig.3B)。本文還進(jìn)行了Annexin-V/PI染色，用以分析UBQLN對結(jié)腸癌凋亡影響。通過FACS分析凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UBQLN2過表達(dá)使HCT116細(xì)胞凋亡率76.43%顯著高于對照組 43.05%(Fig.3E)，UBQLN2被敲低后SW480細(xì)胞凋亡率68.45%明顯低于對照組86.04%(Fig.3E)。

Fig.3 UBQLN-2 decreases cell proliferation and increases cell apoptosis in colon cancer cells (A,B) Expression of UBQLN2 mRNA was measured by RT-PCR. (C,D) Cell proliferation was determined by CCK-8 assay at 48 hours after transfection. (E) Apoptotic cells were analyzed by FACS analysis. Error bars represent the means±SD from three independent experiments. ***P<0.001, *P<0.05

進(jìn)一步通過免疫熒光觀察UBQLN2對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2/Bax的影響，結(jié)果顯示：HCT116細(xì)胞過表達(dá)UBQLN2后Bcl-2蛋白質(zhì)水平降低(31.09±10.35vs11.46±2.98)，Bax蛋白質(zhì)水平增加(17.89±5.82vs34.09±15.43)(P<0.001，F(xiàn)ig.4A)；SW480細(xì)胞敲低UBQLN2后Bcl-2蛋白質(zhì)水平增加(19.91±6.09vs52.75±19.52)，Bax蛋白質(zhì)水平減少(25.15±8.75vs10.64±2.53)(P=0.0053，F(xiàn)ig.4B)。以上結(jié)果說明，UBQLN2能夠調(diào)控結(jié)腸癌的異常增殖和凋亡，抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

Fig.4 Effect of UBQLN2 on the expression of pro-and anti-apoptotic proteins Bax and Bcl-2 (A) The level of Bcl-2 and Bax after UBQLN2 overexpression was measured by immunofluorescence staining. (B) The level of Bcl-2 and Bax after UBQLN2 silencing was measured by immunofluorescence staining. Error bars represent the means±SD from three independent experiments. ***P<0.001, **P<0.01

2.4 泛素樣蛋白2抑制結(jié)腸癌Wnt信號通路激活

Wnt信號通路激活是腫瘤細(xì)胞異常增殖的重要分子機(jī)制[4]。近年來，許多研究表明，Wnt通路的異常激活與人類癌癥特別是結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。因此，本文設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察UBQLN2與Wnt信號通路之間的關(guān)系。Western 印跡分析結(jié)果顯示：HCT116細(xì)胞過表達(dá)UBQLN2后Wnt信號通路標(biāo)志β-聯(lián)蛋白表達(dá)減少71.99%，pGSK-3β表達(dá)增加8.12倍，SW480細(xì)胞敲低UBQLN2后β-聯(lián)蛋白表達(dá)增加6.13倍，pGSK-3β表達(dá)減少71.43%(P<0.001，F(xiàn)ig.5)，提示UBQLN2能夠調(diào)控Wnt信號通路，二者的相互作用在結(jié)腸癌中發(fā)揮重要作用。

Fig.5 Marker proteins of Wnt signaling pathway are expressed after UBQLN2 overexpression and knockdown, respectively The level of β-catenin and pGSK-3β after UBQLN2 overexpression or knockdown was measured by Western blotting. Error bars represent the means±SD from three independent experiments. ***P<0.001

2.5 Wnt信號通路抑制結(jié)腸癌泛素樣蛋白2的表達(dá)

UBQLN2能夠調(diào)控Wnt信號通路，那么Wnt信號通路對UBQLN2的作用如何。為了進(jìn)一步研究UBQLN2與Wnt信號通路之間的關(guān)系，分別用Wnt信號通路的激活劑Wnt3a和抑制劑Dkk1分別處理HCT116和SW480細(xì)胞，隨后Western 印跡觀察UBQLN2以及β-聯(lián)蛋白和pGSK-3β變化，結(jié)果顯示：與對照組相比Wnt3a激活HCT116細(xì)胞β-聯(lián)蛋白表達(dá)5.54倍，pGSK-3β表達(dá)減少80.58%，UBQLN2表達(dá)減少57.81%；Dkk1抑制SW480細(xì)胞β-聯(lián)蛋白表達(dá)2.38倍，促進(jìn)pGSK-3β表達(dá)8.35倍，增加UBQLN2表達(dá)3.84倍(P<0.001，F(xiàn)ig.6)。此結(jié)果表明，在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中Wnt信號通路能夠抑制UBQLN2表達(dá)，提示W(wǎng)nt信號通路與UBQLN2表達(dá)在結(jié)腸癌中發(fā)揮重要作用。

Fig.6 Marker proteins of Wnt signaling pathway were expressed after treatment with activator Wnt3a and inhibitor Dkk1, respectively The level of β-catenin, pGSK-3β and UBQLN2 were measured by Western blotting after treatment with activator Wnt3a and inhibitor Dkk1. Experiments were independently repeated three times. ***P<0.001

3 討論

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增高且發(fā)病人群越來越年輕，致死率僅次于消化道胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌[2]。結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，患者通常確診時多已經(jīng)處于中晚期，早期容易誤診和漏診，嚴(yán)重影響結(jié)腸癌患者的診治和預(yù)后[10]，因此，結(jié)腸癌診療過程中早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療至關(guān)重要，針對結(jié)腸癌生物標(biāo)志物的研究尤為重要。

泛素樣蛋白質(zhì)(ubiquilin)家族在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11, 12]。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中UBQLN1的下調(diào)誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且其可以作為非小細(xì)胞肺癌治療的潛在標(biāo)志物[13]。而UBQLN2的主要功能是幫助細(xì)胞清除危險的蛋白質(zhì)團(tuán)塊，UBQLN2可識別熱激蛋白質(zhì)70(HSP70)，并將其鏈接到蛋白酶復(fù)合體，讓聚集和錯誤折疊的蛋白質(zhì)開始降解[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，UBQLN2在肺癌中低表達(dá)，且參與癌細(xì)胞的增殖[15]；通過UBQLN2基因敲低，研究發(fā)現(xiàn)UBQLN2基因能夠影響HeLa細(xì)胞增殖[16]。但是目前UBQLN2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及作用尚不清楚。

本研究已有結(jié)果證實(shí)，UBQLN2在腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織和正常組織，同時在體外實(shí)驗(yàn)中UBQLN2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中表達(dá)低于人正常腸上皮細(xì)胞，且UBQLN2與結(jié)腸癌患者臨床病理特征密切相關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究UBQLN2對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其具體的調(diào)控機(jī)制。已有結(jié)果提示，UBQLN2可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用，在HCTT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞中分別過表達(dá)和敲低UBQLN2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)后HCT116細(xì)胞增殖能力被抑制，而敲低后SW480細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，說明UBQLN2能夠影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，同時與正常對照組相比，過表達(dá)UBQLN2后HCT116細(xì)胞凋亡率顯著增加，而敲低UBQLN2后SW480細(xì)胞凋亡率顯著減少。隨后觀察了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)Bcl-2/Bax，結(jié)果顯示，UBQLN2能夠促進(jìn)凋亡蛋白質(zhì)增加，同時抑制結(jié)腸癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)阻滯結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。以上結(jié)果進(jìn)一步與前述結(jié)果相互印證，UBQLN2在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用，能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力同時促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。那么UBQLN2是如何發(fā)揮抑癌作用，具體通過哪條信號通路來實(shí)現(xiàn)的？

Wnt信號通路已經(jīng)被證實(shí)是經(jīng)典促進(jìn)腫瘤發(fā)生的信號通路，其標(biāo)志蛋白質(zhì)β-聯(lián)蛋白的激活代表Wnt信號通路的激活[17]。Wnt信號通路已經(jīng)在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)和研究[18-20]，已有的相關(guān)研究報道很多，但是UBQLN2與Wnt信號通路在結(jié)腸癌中的研究鮮有報道。UBQLN2與Wnt信號通路關(guān)系如何，UBQLN2是否通過調(diào)控Wnt信號通路來發(fā)揮抑癌作用，本文對此進(jìn)行了研究。同樣在HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞中分別過表達(dá)和敲低UBQLN2，觀察Wnt信號通路標(biāo)志蛋白質(zhì)β-聯(lián)蛋白和pGSK-3β表達(dá)情況，本文發(fā)現(xiàn)，隨著UBQLN2的表達(dá)變化，β-聯(lián)蛋白和pGSK-3β亦發(fā)生變化，UBQLN2過表達(dá)時抑制β-聯(lián)蛋白表達(dá)，反之敲低后促進(jìn)β-聯(lián)蛋白表達(dá)，表明UBQLN2能夠調(diào)控Wnt信號通路，很有可能抑制Wnt信號通路激活。為了進(jìn)一步明確UBQLN2和Wnt信號通路的關(guān)系，本文使用Wnt信號通路的激活劑Wnt3a和抑制劑Dkk1分別處理HCT116和SW480細(xì)胞，觀察Wnt信號通路被激活和抑制后UBQLN2的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt3a能夠激活UBQLN2變化，而Dkk1顯著抑制UBQLN2變化。此結(jié)果表明，UBQLN2能夠調(diào)控Wnt信號通路，反過來Wnt信號通路也能夠調(diào)控UBQLN2的表達(dá)，二者之間存在互相調(diào)節(jié)作用，但是具體的調(diào)節(jié)作用尚不清楚，將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究初步探討了UBQLN2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響，研究結(jié)果提示，UBQLN2可能是通過Wnt信號通路來實(shí)現(xiàn)抑癌功能，本研究不僅為結(jié)直腸癌的診斷尋找準(zhǔn)確、有效的腫瘤標(biāo)志物，也為結(jié)直腸癌的規(guī)范化治療提供參考。