利拉魯肽抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠胰島細(xì)胞損傷

朱 謀， 白明健， 王琪琦， 程 昊， 李 林， 徐 晶*， 張春晶*

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究生，2)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科生，3)衛(wèi)生所，4)生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)病率的急劇上升已成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)病率最高。T2DM是一種以慢性血糖升高為特征的疾病，其主要特點(diǎn)在于功能性胰島β細(xì)胞進(jìn)行性衰退[1-2]，使胰島素的分泌量下降，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)展以及糖尿病患者病情加重。因此，研究胰島β細(xì)胞損傷的機(jī)制來(lái)減少和抑制胰島細(xì)胞的衰退，是治療糖尿病的關(guān)鍵途徑。

利拉魯肽(liraglutide，Lira)是一種長(zhǎng)效胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)類似物。多項(xiàng)研究表明，利拉魯肽可增加胰島素分泌和降低胰高血糖素水平，在改善空腹和餐后血糖的異常變化、延緩胃排空、降低能量攝入、保護(hù)胰島細(xì)胞功能等方面存在顯著的優(yōu)勢(shì)[3-5]。但其具體機(jī)制尚未完全闡明。胰島細(xì)胞的功能受多方面因素影響。例如，胰島β細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于高糖高脂環(huán)境下，可影響其miRNA表達(dá)譜，導(dǎo)致其功能受損，存活受限，從而促進(jìn)T2DM的發(fā)展[6]。本研究利用利拉魯肽在保護(hù)胰島細(xì)胞功能上的顯著優(yōu)勢(shì)，探討利拉魯肽對(duì)高糖培養(yǎng)條件下小鼠胰島MIN6細(xì)胞的細(xì)胞活力、胰島素分泌以及細(xì)胞損傷相關(guān)指標(biāo)的影響，為利拉魯肽治療T2DM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

小鼠胰島MIN6細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(Clark)；0.25%胰酶(Gibco)；利拉魯肽(Cayman)；葡萄糖(Sigma)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(上海生工)；小鼠胰島素(insulin)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒和ATP含量檢測(cè)試劑盒(北京索來(lái)寶科技有限公司)；活體細(xì)胞線粒體膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)試劑盒(上海杰美基因科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)(南京建成生物工程研究所)；解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)抗體(Santa)；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MIN6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的1640(Hyclone)完全培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。實(shí)驗(yàn)分組:正常細(xì)胞對(duì)照組(Normal control, NC)，不含葡萄糖1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖組(high glucose, HG)，葡萄糖終濃度為33 mmol/L培養(yǎng)；利拉魯肽組(Lira)，利拉魯肽終濃度為100 nmol/L；高糖和利拉魯肽組(HG+Lira)。本研究均在上述分組及對(duì)應(yīng)環(huán)境中將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)MIN6細(xì)胞活力

將細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，37 ℃ 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上層廢液，對(duì)照組(NC)加入完全培養(yǎng)基100 μL，利拉魯肽組(Lira)加入100 μL利拉魯肽終濃度為100 nmol/L的培養(yǎng)液，高糖組(HG)加入100 μL葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)液，高糖和利拉魯肽組(HG+Lira)加入100 μL葡萄糖終濃度為33 mmol/L和利拉魯肽終濃度100 nmol/L的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL的CCK-8檢測(cè)試劑。2 h后在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度值，根據(jù)細(xì)胞活力計(jì)算公式計(jì)算存活率。

1.4 ELISA檢測(cè)MIN6細(xì)胞的胰島素分泌量

將細(xì)胞按照8×105個(gè)/孔，接種于60 mm×15 mm培養(yǎng)皿中，24 h后待細(xì)胞貼壁，按5 mL/孔計(jì)算HG劑量和加藥量以及β-巰基乙醇(50 μmol/L)，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液上清，按照小鼠胰島素測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)450 nm處光密度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組胰島素分泌量。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ATP生成量的檢測(cè)

將細(xì)胞按4.5×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁，按3.5 mL/孔計(jì)算加藥量，培養(yǎng)細(xì)胞48 h，正常消化收集細(xì)胞，每孔加入800 μL ATP提取液，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在340 nm處讀取吸光度值A(chǔ)1和A2，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)提供的計(jì)算公式對(duì)ATP含量進(jìn)行分析處理。

1.6 應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體膜通道孔

將MIN6細(xì)胞接種于35 mm激光共聚焦專用玻底培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng)，按3.5 mL/孔計(jì)算加藥量，培養(yǎng)48 h，棄上清，嚴(yán)格按照 線粒體膜通道孔試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最后加入200 μL清理液，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡獲取圖像和細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.7 活性氧含量檢測(cè)

將MIN6細(xì)胞按4.5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按實(shí)驗(yàn)分組和條件培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞沉淀，以檢測(cè)Lira對(duì)高糖刺激48 h小鼠MIN6細(xì)胞中ROS含量的影響。將收集的細(xì)胞用1 mL PBS重懸，1 000 r/min離心3 min，棄掉PBS，1 mL DCFH-DA(10 μmol/L)工作液重懸細(xì)胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 min，PBS清洗2次，最后用500 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.8 酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量，超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶以及細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶活性

按實(shí)驗(yàn)分組收集2×106個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液上清，PBS或者試劑盒自帶提取液重懸細(xì)胞沉淀，超聲破碎(冰浴，300 W，超聲5 s，間隔30 s，重復(fù)4次)。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞光密度(A)值和考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)說(shuō)明書(shū)換算公式計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD、CAT和細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH活性。

1.9 Western 印跡檢測(cè)解偶聯(lián)蛋白2的表達(dá)

提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，按照20 μg上樣量，確定每孔上樣體積，使用SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，次日TBST洗膜3次，10 min/次，加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光，使用Image J或Image Lad軟件分析圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽抑制高糖刺激細(xì)胞活力的下降

為探究利拉魯肽對(duì)MIN6細(xì)胞活力的影響，采用CCK-8法對(duì)細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果正如Fig.1所示。與正常對(duì)照組(98.80 ± 0.68)%相比，利拉魯肽組(92.14 ± 7.85)%差異無(wú)變化(P>0.05)，而HG組(82.70 ± 1.86)%細(xì)胞活力下降(P<0.05),利拉魯肽(100 nmol/L)作用高糖組細(xì)胞活力(96.58 ± 2.82)%較HG組升高(P<0.05)。提示在長(zhǎng)期的高糖環(huán)境會(huì)使胰島細(xì)胞的活力降低，而利拉魯肽可保護(hù)胰島細(xì)胞不受高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，減少凋亡率或逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下胰島細(xì)胞的損傷情況。

Fig.1 CCK-8 assays The control group (NC) was cultured under normal conditions. The liraglutide group was treated with 100 nmol/L liraglutide. The high glucose group (HG) was treated with 33 mmol/L glucose. The high glucose and liraglutide group (HG + Lira) was treated with 33 mmol/L glucose and 100 nmol/L liraglutide. Data are presented as the mean ± SD, n=3. Statistical significances were calculated using Student’s t-test, **P<0.01 compared with the NC group; #P <0.05 compared with the HG group

2.2 利拉魯肽促進(jìn)高糖刺激下MIN6細(xì)胞的胰島素分泌

為探究利拉魯肽對(duì)MIN6細(xì)胞功能的影響，采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的胰島素(insulin，IN)分泌情況。Fig.2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組(0.35 ± 0.03)胰島素釋放量相比，利拉魯肽組(0.34 ± 0.01)差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HG組(0.21 ± 0.01)細(xì)胞上清胰島素分泌量降低(P<0.05)，利拉魯肽作用高糖組(0.26 ± 0.01)較HG組升高(P<0.05)。提示長(zhǎng)期高糖刺激會(huì)導(dǎo)致胰島細(xì)胞分泌和釋放胰島素的功能受損，而利拉魯肽干預(yù)后可改善這一現(xiàn)象。

Fig.2 Insulin release assays The control group (NC) was cultured under normal conditions. The liraglutide group was treated with 100 nmol/L liraglutide. The high glucose group (HG) was treated with 33mmol/L glucose. The high glucose and liraglutide group (HG + Lira) was treated with 33 mmol/L glucose and 100 nmol/L liraglutide. Data are presented as the mean ± SD, n=3. Statistical significances were calculated using Student’s t-test, **P <0.01 compared with the NC group; #P<0.05 compared with the HG group

2.3 利拉魯肽調(diào)節(jié)MIN6細(xì)胞ATP含量

通過(guò)對(duì)MIN6細(xì)胞的ATP含量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組(0.30 ± 0.01)比較，利拉魯肽(0.29 ± 0.01)組細(xì)胞ATP含量無(wú)明顯變化，差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HG組(0.18 ± 0.02)ATP生成量降低(P<0.001)，利拉魯肽作用高糖組(0.26 ± 0.01)ATP含量較高糖組升高(P<0.001)，結(jié)果見(jiàn)Fig.3。提示利拉魯肽可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞ATP的生成，維持細(xì)胞正常能量供應(yīng)。

Fig.3 Effects of liraglutide on MIN6 ATP levels The control group (NC) was cultured under normal conditions. The liraglutide group was treated with 100 nmol/L liraglutide. The high glucose group (HG) was treated with 33 mmol/L glucose. The high glucose and liraglutide group (HG + Lira) was treated with 33 mmol/L glucose and 100 nmol/L liraglutide. Data are presented as the mean ± SD, n=3. Statistical significances were calculated using Student’s t-test, ***P <0.001 compared with the NC group; ###P <0.001 compared with the HG group

2.4 利拉魯肽調(diào)節(jié)線粒體膜通道孔開(kāi)放

為探究利拉魯肽對(duì)高糖環(huán)境下MIN6細(xì)胞線粒體膜通道孔的影響，采用激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組(3.29 ± 0.08)比較，利拉魯肽組(4.07 ± 0.35)熒光強(qiáng)度無(wú)變化，差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HG組綠色熒光強(qiáng)度(1.17 ± 0.23)減弱(P<0.001)；與HG組比，利拉魯肽作用高糖組熒光強(qiáng)度(5.36 ± 0.38)升高(P<0.001)，結(jié)果見(jiàn)Fig.4。表明利拉魯肽可抑制高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞線粒體膜通道孔開(kāi)放。

Fig.4 The fluorescence intensity of MIN6 mitochondrial permeability transition pore (A) The control group (NC) was cultured under normal conditions. Liraglutide group was treated with 100 nmol/L liraglutide. The high glucose group (HG) was treated with 33 mmol/L glucose. The high glucose and liraglutide group (HG + Lira) was treated with 33 mmol/L glucose and 100 nmol/L liraglutide. (B) Data are presented as the mean ± SD, n=3. Statistical significances were calculated using Student’s t-test, ***P <0.001 compared with the NC group; ###P <0.001 compared with the HG group

2.5 利拉魯肽調(diào)節(jié)高糖刺激下MIN6細(xì)胞活性氧水平

為探究高糖環(huán)境下利拉魯肽對(duì)胰島細(xì)胞ROS水平的調(diào)節(jié)作用，采用DCFH-DA探針聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS的含量。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組(95.58 ± 2.61)相比，利拉魯肽組(114.70 ± 7.32)含量無(wú)變化，差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高糖組(173.00 ± 3.85)ROS的含量升高(P<0.001)，提示高糖可刺激胰島細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，而利拉魯肽作用的高糖組(124.60 ± 4.36)ROS含量較高糖組降低(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)Fig.5。提示利拉魯肽可在一定程度上抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

Fig.5 Effects of liraglutide on intracellular ROS levels The control group (NC) was cultured under normal conditions. The high glucose group (HG) was treated with 33 mmol/L glucose. The high glucose and liraglutide group (HG + Lira) was treated with 33 mmol/L glucose and 100 nmol/L liraglutide. Data are presented as the mean ± SD, n=3. Statistical significances were calculated using Student’s t-test, ***P <0.001 compared with the NC group; ##P <0.01 compared with the HG group

2.6 利拉魯肽調(diào)節(jié)高糖刺激下丙二醛含量，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和乳酸脫氫酶活性

與正常對(duì)照組比較，利拉魯肽組細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD、CAT和LDH活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高糖組MDA(2.29 ± 0.45)和LDH(290.90± 8.63)水平升高(P<0.05)，SOD(3.81 ± 0.21)和CAT(32.52 ± 2.05)水平降低(P<0.01)；與高糖組比較，利拉魯肽作用高糖組MDA(0.89 ± 0.19)和LDH(215.40 ± 7.43)水平降低(P<0.01)，SOD(7.98 ± 0.32)和CAT(64.20 ± 4.17)水平升高(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)Table 1。

Table 1 The change of the MDA, SOD, CAT and LDH levels (Mean±SD, n=3)

2.7 利拉魯肽抑制高糖刺激下MIN6細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白2的表達(dá)

與正常對(duì)照組(0.31 ± 0.01)相比，利拉魯肽UCP2表達(dá)量(0.32 ± 0.02)無(wú)顯著變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HG組蛋白質(zhì)表達(dá)量(1.08 ± 0.11)升高(P<0.01)。與高糖組比較，利拉魯肽作用高糖組UCP2表達(dá)量(0.61 ± 0.04)降低(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)Fig.6。

Fig.6 Western blot analysis of UCP2 expression levels (A)The control group (NC) was cultured under normal conditions. The high glucose group (HG) was treated with 33 mmol/L glucose. The liraglutide group was treated with 100 nmol/L liraglutide. The high glucose and liraglutide group (HG + Lira) was treated with 33 mmol/L glucose and 100 nmol/L liraglutide. (B)Data are presented as the Mean ± SD, n=3. Statistical significances were calculated using Student’s t-test, **P <0.01 compared with the NC group; # P<0.05 compared with the HG group

3 討論

T2DM患者體內(nèi)存在一定程度的胰島β細(xì)胞損傷以及功能紊亂，其分泌的胰島素作為人體內(nèi)的主要降糖物質(zhì)，影響著T2DM發(fā)生和發(fā)展的全過(guò)程[7]。常規(guī)代謝途徑中，胰島素將人體血糖值維持在正常水平，當(dāng)存在長(zhǎng)期高糖高脂等損傷因素時(shí)，胰島β細(xì)胞會(huì)處于能量代謝異常、分泌功能紊亂等影響胰島素釋放狀態(tài)[8]。受神經(jīng)激素的調(diào)節(jié)，胰島細(xì)胞通過(guò)感知血液中葡萄糖、脂肪和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝水平，促使胰島素合成和分泌的偶聯(lián)信號(hào)產(chǎn)生。2008年，Nolan等人[9]研究表明，胰島β細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的高感知能力，同時(shí)也增加了其營(yíng)養(yǎng)毒性的概率，這也解釋了長(zhǎng)期高糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞衰竭和2型糖尿病。本研究采用高糖(33 mmol/L)誘導(dǎo)胰島MIN6細(xì)胞48 h建立高糖損傷模型，觀察利拉魯肽(100 nmol/L)作用于高糖損傷胰島細(xì)胞后相關(guān)指標(biāo)的變化情況。通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高糖組細(xì)胞活力下降，而利拉魯肽可改善高糖誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞的存活率，提示利拉魯肽具有保護(hù)高糖損傷胰島細(xì)胞的潛力。

線粒體作為細(xì)胞的主要產(chǎn)能工廠，在維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和能量代謝等方面具有重要的作用[10-11]。本研究采用小鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒和ATP含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可有效增加胰島素的分泌量和細(xì)胞內(nèi)ATP含量。同時(shí)，本文通過(guò)活體細(xì)胞熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體膜通道孔的開(kāi)放情況，在激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可增加高糖環(huán)境下胰島細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，表明其對(duì)線粒體具有一定保護(hù)作用。因此，利拉魯肽可能與調(diào)節(jié)線粒體功能，保護(hù)細(xì)胞正常呼吸鏈運(yùn)行有關(guān)，維持細(xì)胞正常的物質(zhì)代謝和能量供應(yīng)。

解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)是線粒體內(nèi)膜的一類載體蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的作用[12]。當(dāng)UCP2過(guò)量表達(dá)時(shí)，其可通過(guò)質(zhì)子漏機(jī)制，使線粒體呼吸鏈氧化磷酸化過(guò)程脫偶聯(lián)，產(chǎn)生的能量以對(duì)細(xì)胞功能運(yùn)行無(wú)效的熱能形式散失，導(dǎo)致ATP合成減少[13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，UCP2的抑制劑京尼平可通過(guò)下調(diào)UCP2表達(dá)，提高ATP含量及胰島素的釋放量，改善線粒體功能，對(duì)高糖損傷的小鼠胰島細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[14]。研究還表明，胰島細(xì)胞的UCP2在長(zhǎng)期高糖環(huán)境可表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致胰島功能紊亂[15-20]。2011年，Zhang等人[21]研究發(fā)現(xiàn)，UCP2缺陷的小鼠在攝取葡萄糖15～60 min的各時(shí)間段均顯著增加了GLP-1的分泌水平，提高了GLP-1對(duì)葡萄糖的響應(yīng)，提示UCP2可抑制葡萄糖刺激的GLP-1分泌水平。利拉魯肽作為GLP-1類似物，目前廣泛用于治療DM，但其是否通過(guò)調(diào)節(jié)UCP2表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)能量代謝，發(fā)揮保護(hù)胰島細(xì)胞功能的作用，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為探究利拉魯肽對(duì)線粒體的保護(hù)作用機(jī)制以及影響胰島素分泌相關(guān)抗氧化蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，本研究通過(guò)Western印跡對(duì)高糖刺激48 h后的小鼠胰島MIN6細(xì)胞中UCP2的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，高糖組UCP2表達(dá)較正常細(xì)胞對(duì)照組明顯上調(diào)，而利拉魯肽作用高糖組后有效降低了UCP2的表達(dá)，提示利拉魯肽通過(guò)降低高糖環(huán)境下，UCP2的表達(dá)來(lái)抑制UCP2在氧化磷酸化過(guò)程中的過(guò)度解偶聯(lián)作用，恢復(fù)呼吸鏈中ADP與無(wú)機(jī)磷酸合成ATP的偶聯(lián)反應(yīng)。

氧化應(yīng)激是T2DM發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，氧自由基引發(fā)脂類過(guò)氧化反應(yīng)，其產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性[22]。有研究表明，利拉魯肽可通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬，恢復(fù)線粒體功能，并保護(hù)胰島β細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[23]。在本文的研究中發(fā)現(xiàn)，高糖組ROS水平較對(duì)照組升高，利拉魯肽作用高糖組ROS水平降低；高糖組細(xì)胞MDA和LDH水平升高，SOD和CAT水平降低，而利拉魯肽能降低高糖環(huán)境小鼠MIN6胰島細(xì)胞MDA和LDH水平，同時(shí)升高SOD和CAT水平，提示利拉魯肽可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，提高內(nèi)源性SOD活性，加強(qiáng)氧自由基的清除從而減輕氧自由基對(duì)MIN6的損傷，發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，利拉魯肽在改善高糖環(huán)境下胰島細(xì)胞的功能方面具有一定的潛力，保護(hù)胰島細(xì)胞不受線粒體損傷所帶來(lái)的功能衰退，糾正胰島細(xì)胞在損傷條件下的能量代謝異常，增強(qiáng)抗氧化作用，其機(jī)制可能與下調(diào)UCP2的表達(dá)和調(diào)控線粒體的能量代謝有關(guān)。