廣西地區(qū)患者ABO亞型血清學與分子生物學研究

莫恒誠，李思娜，李 豪，羅瑞獻，謝慧瓊，黃惠妮，高宏軍，黎海瀾，莫柱寧

ABO血型是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類紅細胞血型系統(tǒng)，也最具有臨床意義，其在輸血醫(yī)學、免疫學、法醫(yī)學、表觀遺傳學等方面均具有重要意義。因此，ABO血型的準確鑒定至關重要。ABO血型受人類遺傳過程中可能存在的基因突變、病理狀態(tài)、生理狀態(tài)等因素影響，常引起機體所表達的血型抗原發(fā)生多樣性變化，導致部分患者血型表型難以確定，給臨床輸血帶來安全隱患。目前，血型血清學技術鑒定ABO血型是重要的技術之一，但遇到某些因素導致ABO血型正反定型不相符時，血清學技術常難以準確鑒定，此時需要聯(lián)合基因檢測技術才能獲得正確的血型結果。ABO亞型是困擾ABO血型正確鑒定的主要因素。ABO亞型是由于基因突變引起酶活性改變，導致紅細胞表面A抗原或B抗原結構、性能或數(shù)量與正常抗原存在差異，通常具有抗原減弱的特征，即紅細胞與抗-A或抗-B血清反應出現(xiàn)凝集強度減弱的現(xiàn)象。不同地區(qū)和人群中ABO亞型在血型血清學特點與分子生物學方面也存在差異，導致ABO亞型難以準確鑒定。目前，廣西地區(qū)對患者ABO亞型的血清學與分子生物學特征方面的研究較少。鑒于此，本文對廣西地區(qū)患者ABO亞型采用血清學技術、聚合酶鏈反應-序列特異性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)和聚合酶鏈反應-測序分型(polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT)技術進行檢測，分析其血清學和分子生物學特點，為臨床上采用多種方法正確鑒定ABO血型提供理論依據(jù)，保障輸血安全。

1 對象與方法

1

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1

研究對象 2021年在我院進行ABO血型鑒定的廣西地區(qū)患者標本(共56 944例無重復標本)中，經(jīng)血型血清學技術鑒定為ABO亞型的有25例標本，其中男12例，女13例，年齡8～74歲；患者地域分布為南寧12例，河池4例，百色與北海各3例，崇左、欽州、貴港各1例。骨關節(jié)疾病、眼部疾病患者各5例，乳腺腫瘤、胃腸道疾病患者各3例，心臟疾病、血液疾病、慢性腎病、甲狀腺癌、腹股溝疝、不孕癥患者各1例，孕產婦3例。標本為EDTA-K2抗凝靜脈血，采集后3 d內進行血型血清學試驗。完成血清學試驗后留取白膜層-80 ℃低溫保存，用于基因組DNA提取。本研究獲廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(編號：KY-KJT-2021-49)。

1

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2

試劑與儀器 單克隆抗-A、抗-B血型定型試劑、抗-H試劑和人ABO反定型用紅細胞試劑盒(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號20201222、20201126、20215313)；BX-1樣本釋放液(長春博訊生物技術有限責任公司，批號20210101)，血型血清學專用離心機(日本久保田公司，型號KA2200)；全血基因組DNA純化試劑盒(杭州博日科技有限公司，批號20200802)，人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒(熒光PCR法，批號20201225)、ABO外顯子測序試劑盒(批號20201222)均由江蘇中濟萬泰生物醫(yī)藥有限公司生產；熒光定量PCR擴增儀(杭州博日科技有限公司)，基因測序儀(美國Applied Biosyems公司)。

1

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3

檢測方法

1.3.1 血型血清學檢測 ABO血型鑒定采用ORTHO VISION Max全自動血型分析儀(Ortho-Clinical Diagnostics公司，英國)、IH-1000全自動血型儀(Bio-Rad公司，美國)檢測，檢測中發(fā)現(xiàn)正反定型不相符(正定型凝集強度<4+，反定型凝集強度<2+)的標本，采用血型血清學試管法進行復核，確認是否為ABO亞型。具體方法包括ABO正反定型試驗、吸收放散試驗、H抗原檢測和抗體篩查試驗等，試驗嚴格按第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行。根據(jù)結果和文獻對ABO亞型進行血清學分類。

1.3.2 分子生物學檢測 對25例經(jīng)血清學檢測為ABO亞型的樣本，同時采用PCR-SSP和PCR-SBT技術進行檢測。分子生物學檢測均在江蘇衛(wèi)生健康委血型基因檢測聯(lián)合參比(江陰)實驗室完成。

1.3.2.1 基因組DNA提取 使用DNA提取試劑盒提取患者全血中DNA，操作過程嚴格按試劑說明書進行。使用超微分光光度計測定DNA樣本濃度，并調整最佳濃度至40～70 ng/μl，調整純度A260/A280值至1.8左右。

1.3.2.2 PCR-SSP檢測 使用人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒(熒光PCR法)進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測位點包括

A

、

A

205、

B

和

O

，可用于檢測ABO血型系統(tǒng)的

A

、

A

205、

B

、

O

、

O

1、

O

2等位基因。擴增條件：96 ℃ 3 min，1個循環(huán)；96 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，5個循環(huán)；96 ℃ 20 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；96 ℃ 20 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，15個循環(huán)；72 ℃ 2 min，1個循環(huán)。完成擴增后采集熔解曲線。

1.3.2.3 PCR-SBT檢測 使用ABO外顯子測序試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。擴增條件：96 ℃ 2 min，1個循環(huán)；96 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，5個循環(huán)；96 ℃ 20 s，65 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，10個循環(huán)；96 ℃ 20 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，22個循環(huán)；72 ℃延伸2 min，1個循環(huán)；4 ℃保存。使用2.0%瓊脂糖凝膠對產物進行電泳，100 V電泳30 min，根據(jù)產物大小判斷有無目的片段擴增。用Sanger法對PCR產物進行ABO基因E1-7外顯子測序，并使用軟件Geneious R9對結果進行分析，對比美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的紅細胞血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(The Blood Group Antigen Gene Mutation Database,BGMUT)，判斷測序結果的基因型及是否存在新的ABO血型基因多態(tài)性位點。

2 結果

2

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1

血型血清學檢測結果 經(jīng)血型血清學技術鑒定為ABO亞型共25例，其中A亞型6例，均為A型；B亞型9例，其中以B型為主(5例)，另有B型2例，B型2例；AB亞型10例，其中AB型5例，AB型2例，AB型、AB型、AB型各1例。見表1。

表1 ABO亞型血清學檢測與分子生物學檢測結果相符的特征

編 號ABO正反定型試驗抗-A抗-BAcBcOc自身對照抗-H吸收放散試驗AcBc血清學表型分子生物學結果PCR-SSP分型PCR-SBT基因測序1003+0004+/+BelB/BB101/Bw11201+4+1+003+s/+BwB/O2Bw11/O02301+s4+1+004+//BwB/O1Bw11/O01401+4+0003+//BwB/O1Bw11/O01503+mf4+0003+w//B3B/O2Bw11/O01602+4+±003+w//BwB/O1Bw11/O01703+4+1+003+w//BwB/O2Bw11/O0184+001+001+/+ABelA/BA102/Bw1194+1+00001+/+ABwA/BA102/Bw12104+2+mf00001+//AB3A/BA102/B303

注：0為無凝集；1+～4+為凝集強度，其中w為強度以下，s為強度以上，mf為混合凝集；/為未檢測，+為通過吸收放散試驗可以檢出相應抗原

2

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2

分子生物學檢測結果 對25例血型血清學檢測為ABO亞型的血樣均采用PCR-SSP和PCR-SBT技術進行分子生物學檢測，結果分別如下：2.2.1 PCR-SSP檢測結果 采用PCR-SSP法共檢出以下9個ABO基因型：

A/O

1 3例，

A/O

2 3例，

A/OT

1例，

B/O

1 4例，

B/O

2 3例，

B/OT

1例，

B/B

1例，

A/B

8例，

O

2

/O

2 1例。PCR-SSP方法與血清學方法鑒定結果符合率為88.00%(22/25)，但通過該方法僅僅可以檢測標本中是否存在

A

、

B

或

O

基因，而無法獲知具有哪些ABO亞型基因。結果見表2。2.2.2 PCR-SBT基因測序結果 (1)PCR-SBT共檢出ABO亞型10例，其中B亞型7例，AB亞型3例，未檢出A亞型。具體基因型分別為

B

101/

Bw

11 1例，

Bw

11/

O

01 5例，

Bw

11/

O

02 1例，

A

102/

Bw

11 1例，

A

102/

Bw

12 1例，

A

102/

B

303 1例。其中，

Bw

11是產生B亞型或AB亞型的主要等位基因(8/10)，其關鍵核苷酸改變位點為c.695T>C和c.703G>A(見圖1?)。發(fā)現(xiàn)另2個導致AB亞型的等位基因

Bw

12(c.278C>T，見圖1?)和

B

303(Intron3+5A>G，見圖1?)。(2)另外15例ABO亞型檢測結果均顯示為正常的基因型，具體基因型分別為

A

101/

O

02 2例，

A

102/

O

01 5例，

B

101/

O

01 1例，

B

101/O04 1例，

A

101/

B

101 1例，

A

102/

B

101 4例，

O

02/

O

02 1例。其中

A

102是導致本組患者產生血清學亞型的主要等位基因(9/15)。

?Bw11等位基因突變位點；?Bw12等位基因突變位點；?B303等位基因突變位點

2

.

3

血清學與基因分型結果比較2.3.1 PCR-SSP法與PCR-SBT法結果比較 對于檢測ABO亞型中是否含有

A

、

B

或

O

基因，PCR-SBT法檢測結果與PCR-SSP法結果完全一致(25/25，100.00%)。然而，PCR-SSP法分型結果較為粗略，無法確定特定的ABO亞型基因，如遇ABO基因特殊突變時，仍需采用PCR-SBT法進一步分析。2.3.2 血型血清學方法與PCR-SBT法結果比較 對于ABO亞型檢測，采用血清學與PCR-SBT法檢測結果差別較大，共有10例ABO亞型血清學檢測結果與PCR-SBT法檢測結果一致，相符率僅為40.00%(10/25)，均為含有B亞型的等位基因(

Bw

11、

Bw

12和

B

303)。經(jīng)PCR-SBT法確認非ABO亞型15例，其中含有

A

102等位基因9例(60.00%)。6例經(jīng)血清學確定為A亞型的標本中，4例為

A

102/

O

01基因型；而AB亞型亦以

A

102/

B

101為主，為4例。其余血型血清學與分子生物學檢測間差異見表2。

表2 ABO亞型血清學檢測與分子生物學檢測結果存在差異的特征

編 號ABO正反定型試驗抗-A抗-BAcBcOc自身對照抗-H吸收放散試驗AcBc血清學表型分子生物學結果PCR-SSP分型PCR-SBT基因測序113+mf004+003+//A3A/O1A102/O01123+mf004+003+//A3A/O1A102/O01133+mf004+003+//A3A/O2A102/O01142+mf003+003+//A3A/O2A101/O02152+mf003+s003+//A3A/O2A101/O02163+mf004+003+//A3A/OTA102/O0117004+2+w004+/+BelO2/O2O02/O021803+mf4+w0002+s//B3B/O1B101/O0119±4+1+w0002++/AxBB/OTB101/O04204+000001+w//ABmA/O1A102/O01214+2+00002+//ABwA/BA102/B101224+3+mf0±001+//AB3A/BA102/B101234+3+mf00001+//AB3A/BA102/B101244+3+mf00001+//AB3A/BA102/B101254+3+mf00001+//AB3A/BA101/B101

表下注與表1同

3 討論

3

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1

ABO血型是臨床輸血必須鑒定的血型之一，在排除生理因素(如年齡)、病理因素(如冷自身抗體、高免疫球蛋白血癥、血液疾病)、試驗因素(不規(guī)則抗體、試劑等)等干擾后，ABO亞型是影響ABO血型正確鑒定的主要因素。ABO亞型是指在常見的人類4種血型(A、B、AB和O型)之下進一步細分的ABO血型，其共同特點是紅細胞表面A和B抗原數(shù)量減少或性能改變。目前，ABO亞型鑒定的經(jīng)典方法是血型血清學技術，該技術主要是根據(jù)紅細胞與抗-A、抗-B和(或)抗-H等抗血清的凝集反應強度、血漿中抗體、唾液等分泌液中血型物質等血清學特點來進行亞型分型，但由于ABO亞型基因種類遠遠多于根據(jù)血清學劃分出的類型，由血清學定義的同一種ABO亞型可以對應多種等位基因，因此該方法只能判斷ABO血型的表型。當臨床工作中遇到ABO血型難以通過血清學正確鑒定時，常需要借助基因檢測技術。

3

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2

本研究對廣西地區(qū)患者經(jīng)血清學鑒定為ABO亞型的25例標本，經(jīng)PCR-SBT技術證實為ABO亞型的僅有10例，血型血清學與分子生物學方法對ABO亞型檢測結果一致率較低(10/25)?；驒z測發(fā)現(xiàn)10例ABO亞型均含B亞型的等位基因(

Bw

11、

Bw

12和

B

303)，其中以

Bw

11等位基因為主(8例)，未檢出常見的A亞型等位基因(如

A

205等)。該特點與何保仁等報道的南寧地區(qū)獻血人群ABO亞型特點相似，與雷航等報道的中國人群較常檢出的亞型等位基因不一致，說明本地區(qū)人群ABO亞型基因具有地區(qū)特異性。

Bw

11亞型在本地區(qū)患者與獻血人群中均較常見，該等位基因與

B

101等位基因的差異僅在于c.695T>C突變，導致232位氨基酸由亮氨酸轉變?yōu)楦彼?、糖基轉移酶活性部分喪失而產生B亞型，也說明ABO基因的第232位氨基酸對決定糖基轉移酶活性至關重要。

Bw

11基因除了可以導致B抗原減弱以外，還可以使部分患者產生不規(guī)則抗-B(5/8)，因此這類患者在臨床輸血中應選擇O型紅細胞制劑輸注。此外，本研究檢出

A

102/

Bw

12和

A

102/

B

303基因型各1例。

A

102/

Bw

12基因型主要在第6外顯子發(fā)生c.278C>T單點突變，導致第93位的氨基酸由脯氨酸變成亮氨酸，致使B抗原表達減弱，本研究中該表型血清學檢測未檢出抗-B，與Patnaik等報道的結果一致。而李麗春等報道的

Bw

12導致的B亞型除B抗原減弱以外，還產生不規(guī)則抗-B。這表明ABO亞型即使存在共同的基因型，亦可能表現(xiàn)出不同的血清學表型，反之，相同的血清學表型也可對應不同的基因型。而

A

102/

B

303基因型主要發(fā)生Intron3+5

A

>

G

點突變，由于該突變引起異常剪接，影響D-半乳糖轉移酶的正常表達，導致B抗原數(shù)量或性質改變而產生混合視野現(xiàn)象。因此，導致AB或者B亞型的最常見突變基因可能是

B

303基因。

3

.

3

另外15例血清學亞型經(jīng)PCR-SBT法確認為非ABO亞型，在這些不一致的樣本中，以

A

102等位基因占比最高(9/15)，與上海地區(qū)、南寧地區(qū)報道相一致。與

A

101基因相比，

A

102基因翻譯糖基轉移酶的活力無明顯差異，但在本組中9例含

A

102基因的樣本有5例血清學均表現(xiàn)為A抗原減弱。

A

102/

O

01和

A

102/

B

101被認為是血清學鑒定與分子生物學確認結果嚴重不符的基因型，推測可能是由于

A

102與

A

205編碼的產物僅存在單個氨基酸的區(qū)別(與

A

101相比，

A

102與

A

205均存在c.467C>T基因位點的突變，而

A

205還存在c.1009A>G突變，該位點

A

102與

A

101一致)，在疾病、表觀遺傳學等因素或某種未知機制影響下，導致A抗原表達減弱，可表現(xiàn)為A亞型相似的血清學反應。此外，本研究僅對ABO基因E1-7外顯子DNA進行測序檢測，而有文獻報道ABO等位基因的啟動子、增強子、內含子等非編碼調控區(qū)域異常亦可導致A或B抗原弱表達，如在ABO基因內含子1轉錄調控元件+5.8 kb位點發(fā)生核苷酸取代，可導致產生弱抗原A和B表型，這也可能是本研究中血清學特征顯示為A、B和AB型而分子生物學卻提示為正常血型的主要原因之一。此外，本研究有1例樣本在血清學技術中通過吸收放散試驗分別證實紅細胞上存在B抗原，但其基因型為

O

02/

O

02。許先國等通過甲基化分子研究也發(fā)現(xiàn)

O

01/

O

02基因型表現(xiàn)為B表型。杜忻等發(fā)現(xiàn)1例

O

等位基因表達弱B抗原的個案。另外，本研究有1例樣本血清學表型為AB，紅細胞上存在A抗原，基因型卻為

B

101/

O

04。導致以上2份樣本血清學與基因型不符的原因可能為ABO基因各外顯子的剪切部位及基因5′端增強子的變異導致抗原表達異常而ABO亞型的整個外顯子基因正常。在

A

101等位基因序列的基礎上，

O

02和

O

04等位基因第6號外顯子第261位堿基的鳥嘌呤均缺失(261delG)，導致提前產生終點密碼子，致使翻譯過程中產生缺乏酶催化中心的短肽鏈。章旭和李劍平研究也發(fā)現(xiàn)，存在261delG的

O

04等位基因的樣本亦有弱A抗原的表達。因此，推測本研究中以上2例樣本血清學與分子生物學結果間存在差異可能為261delG缺失型

O

等位基因所導致。

3

.

4

本研究分別采用了血型血清學、PCR-SSP和PCR-SBT技術進行ABO血型鑒定，其中血型血清學技術作為ABO血型鑒定的經(jīng)典方法，目前仍是臨床上常用的檢測ABO亞型的方法，該方法操作簡單、易于在臨床上開展，但需要有豐富的血型血清學理論基礎與實踐經(jīng)驗。血清學技術的正確實施，可以使我們了解患者紅細胞表達的ABO抗原強度、是否存在或容易產生不規(guī)則抗-A、抗-B或抗-H、是否存在相應血型物質等線索，對其臨床意義、遺傳特性的判斷等也能提供有意義的信息。當血清學技術無法解決ABO亞型難題時，可以采用分子生物學技術進行檢測，其中PCR-SSP技術僅僅可以檢測標本中是否存在

A

、

B

或

O

基因，而無法獲知具有哪些ABO亞型基因。DNA測序技術可以提供精確的核苷酸序列信息，是ABO血型基因檢測的金標準，只要檢出突變的血型基因，就能準確定型。但分子生物學方法比較費時，即使是較簡單的PCR-SSP法，從提取DNA、PCR擴增到電泳或熒光分析整個過程仍需要4 h以上，且對于儀器設備、人員要求較高，不易于在基層醫(yī)院開展，也不適用于特殊緊急情況下ABO亞型患者的輸血救治。

簡而言之，科學合理地選擇血型血清學和分子生物學技術進行ABO亞型檢測，可以大大提高ABO亞型鑒定的準確性，保障臨床輸血安全、有效。