菜籽多肽結(jié)構(gòu)鑒定及其包封β-胡蘿卜素的機制

羅發(fā)莉，藍妙傳，付余，馬良,2，戴宏杰，馮鑫，張宇昊,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(西南大學(xué) 前沿交叉學(xué)科研究院，生物學(xué)研究中心，重慶，400715)

β-胡蘿卜素是最重要的類胡蘿卜素之一，具有抗氧化、抗腫瘤和增強免疫力等生物活性。然而，由于β-胡蘿卜素水溶性差、生物利用率較低以及對氧氣、光和溫度極其敏感而發(fā)生降解等缺點，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用受到了限制[1]。近年研究表明，食品蛋白質(zhì)來源的多肽具有兩親性、生物相容性、生物降解性、生物活性和環(huán)境友好性等優(yōu)勢，現(xiàn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于對生物活性物質(zhì)的包封[2]。JIAO等[3]以玉米醇溶蛋白肽作載體對水溶性差、不穩(wěn)定和生物利用度低的葉黃素進行包封，結(jié)果表明多肽可有效提高葉黃素的溶解度、穩(wěn)定性和生物利用度。DU等[4]通過酶促水解α-乳清蛋白制備了α-乳清蛋白膠束，將其用于β-胡蘿卜素的自組裝包封，結(jié)果表明與游離的β-胡蘿卜素相比，經(jīng)α-乳清蛋白膠束包封的β-胡蘿卜素在60 ℃加熱或紫外光照射下的水溶性和穩(wěn)定性顯著提高。JIAO等[5]研究發(fā)現(xiàn)，聚-L-賴氨酸修飾的納米脂質(zhì)體可用于葉黃素的新型遞送系統(tǒng)，與未被聚-L-賴氨酸修飾的納米脂質(zhì)體遞送葉黃素相比，聚-L-賴氨酸可以保護納米脂質(zhì)體中的葉黃素不被降解，并促進胃腸液條件下納米脂質(zhì)體中葉黃素的釋放進而提高其生物利用度。綜上，多肽可作為疏水性生物活性物質(zhì)的載體，具有提高其穩(wěn)定性、水溶性和生物利用度的潛力。然而，當(dāng)前研究側(cè)重于多肽包封生物活性物質(zhì)的理化性質(zhì)[粒徑、多分散指數(shù)、zeta電位、包封率(encapsulation efficiency，EE)、負載量(loading amount，LA)和體外穩(wěn)定等]，并沒有從分子水平上闡明兩者的相互作用機制。因此，研究多肽包封生物活性物質(zhì)的相互作用機制具有十分重要的意義。

本課題組先前發(fā)現(xiàn)以菜籽粕為原料，經(jīng)酶解得到的菜籽多肽(rapeseed peptides，RPs)可自組裝包封疏水性生物活性物質(zhì)β-胡蘿卜素，以不同水解時間、包封時間以及β-胡蘿卜素與菜籽多肽質(zhì)量比為自組裝包封β-胡蘿卜素的影響因素進行條件優(yōu)化后，測得包封率為80.03%，負載量為0.48 mg/mg[6]。此外，菜籽多肽經(jīng)超濾(1～3 kDa)和乙腈先后處理，將其用于β-胡蘿卜素的包封，包封率顯著提高到95.79%，負載量提高到0.57 mg/mg。由此說明，菜籽多肽的分子質(zhì)量和極性差異會影響與β-胡蘿卜素相互作用的位點進而導(dǎo)致包封出現(xiàn)差異[7]。因此，為進一步探究菜籽多肽與β-胡蘿卜素的相互作用機制，本研究以經(jīng)超濾(1～3 kDa)和乙腈先后處理的菜籽多肽為研究對象，首先利用液質(zhì)聯(lián)用對菜籽多肽的氨基酸序列進行鑒定，然后，以多肽的分子質(zhì)量、親疏水性和氨基酸組成等影響包封效果的因素為依據(jù)，篩選多肽進行分子對接研究。最后，基于分子對接結(jié)果和親疏水氨基酸組成，從中篩選多肽固相合成后驗證包封實驗。本研究為闡明菜籽多肽包封β-胡蘿卜素相互作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽粕(蛋白質(zhì)含量41.20%)，西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院；β-胡蘿卜素(純度98%)，北京索萊寶生物科技有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L，諾維信公司；多肽，生工生物工程(上海)股份有限公司；乙腈、甲酸(均為色譜純)，成都科隆化學(xué)品有限公司；氫氧化鈉、正己烷，成都科隆化學(xué)品有限公司試劑廠；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Easy-nLC 1200液相色譜儀、Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀和Heraeus Multifuge X3R，美國賽默飛世爾科技公司；BNGM2097有機膜分離實驗機，濟南博納生物技術(shù)有限公司；JA3003B電子天平，上海精天電子儀器有限公司；CJ-78-1磁力攪拌器，上海將任實驗設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋，上海新諾儀器設(shè)備有限公司；PE20實驗室pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菜籽多肽的制備

將菜籽粕粉均勻分散在純水中，料液比為1∶25(g∶mL)，酶底物比為1∶100(mL∶g)，并在堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L的最適條件(溫度55 ℃、pH 8.5)下水解60 min以制備菜籽多肽，使用0.5 mol/L的NaOH溶液維持pH 8.5恒定。水解結(jié)束后，立即置于沸水中15 min滅酶。待冷卻至室溫后離心(5 000 r/min，10 min)，取上清液分別通過1 kDa和3 kDa分子質(zhì)量超濾膜制備分子質(zhì)量為1～3 kDa的多肽溶液，再通過180 Da納濾膜除鹽以避免多肽液中可能存有的少量鹽類對色譜柱造成損害。然后在磁力攪拌下加入乙腈溶液(肽溶液與乙腈溶液體積比為1∶3)，并在 4 ℃的冰箱中放置使其充分混合后離心(10 000 r/min，10 min)，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙腈，收集多肽溶液冷凍干燥后備用。

1.3.2 菜籽多肽的質(zhì)譜測序與多肽的篩選

菜籽多肽的氨基酸序列通過液質(zhì)聯(lián)用鑒定。

液相色譜條件參考FENG等[8]的方法并作適當(dāng)?shù)男薷摹ＩV儀：Easy-nLC 1200系統(tǒng)；色譜柱：C18(3 μm，100 ?，75 μm×15 cm)，流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為含甲酸0.1%(體積分數(shù))的乙腈水溶液(體積分數(shù)80%)。所應(yīng)用的色譜梯度為：0～4 min(95%A，5%B)；4～40 min(90%A，10%B)；40～47 min(72%A，28%B)；47～48 min(62%A，38%B)；48～60 min(0%A，100%B)。進樣量：5 μL，流速：0.3 mL/min，柱溫：30 ℃。

質(zhì)譜條件參考ZHANG等[9]的方法并作適當(dāng)?shù)男薷?。具體參數(shù)如下：噴霧電壓2.0 kV，毛細管溫度320 ℃，分辨率設(shè)置為1級120 000(m/z200)，2級30 000(m/z200)，離子掃描范圍m/z350～1 550，MS1自動增益控制(AGC)4e5，離子注入時間50 ms，MS2自動增益控制(AGC)1e5，離子注入時間50 ms，離子篩選窗口1.6m/z，動態(tài)排除時間為60 s(質(zhì)量范圍±1 Da)。

對于所獲得的液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)使用PEAKS Studio X plus進行處理分析，利用菜籽蛋白數(shù)據(jù)庫Brassicanapus(Rape)匹配結(jié)果以鑒定肽序列[10]。進一步根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用所獲得的菜籽多肽鑒定結(jié)果，結(jié)合不同多肽序列的分子質(zhì)量大小、親疏水氨基酸組成、含量來源等影響多肽自組裝包封的因素。同時參考ProtParam數(shù)據(jù)庫(https://web.expasy.org/protparam/)計算多肽的親水性總平均值(grand average of hydropathicity，GRAVY)，負值越大表示親水性越好，正值越大表示疏水性越強，接近0的時候表明其兩親性較好[11]，從中篩選具有良好包封潛力的多肽進行分子對接。

1.3.3 分子對接

小分子物質(zhì)的準備：從Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取能量最低、最穩(wěn)定的β-胡蘿卜素結(jié)構(gòu)，下載文件格式為.Mol2，以保證后續(xù)分子對接實驗順利進行。

靶標(biāo)多肽結(jié)構(gòu)的準備：首先利用在線網(wǎng)站(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)對多肽結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，并遵循能量最低最穩(wěn)定的原則選擇多肽結(jié)構(gòu)。再利用SYBYL-X 2.1.1軟件中Surflex-Dock(SFIC)標(biāo)準模式對多肽進行結(jié)構(gòu)處理，把原配體分子從受體的口袋中分離，除去水分子和其他小分子，并對其末端進行修復(fù)，對多肽加氫原子、加電荷，以配體為中心5?的距離內(nèi)設(shè)定對接口袋，由此生成靶標(biāo)多肽的對接文件[12]。

分子對接：根據(jù)分子對接的步驟設(shè)定相關(guān)參數(shù)，采用一致性打分函數(shù)Concensus Score(C-Score)和總得分函數(shù)Total-Score(T-Score)相結(jié)合的方式來對分子對接結(jié)果進行評價[13]。C-Score通過構(gòu)象預(yù)測函數(shù)、結(jié)合自由能函數(shù)、共同評價函數(shù)等多個方面一起綜合得到的評價對接結(jié)果可靠性進行打分的函數(shù)，主要根據(jù)D-SCORE、PMF-SCORE、G-SCORE、CHEM-SCORE這4個值的計算得到?？偟梅趾瘮?shù)T-Score是SYBYL-X 2.1.1 軟件自帶的打分函數(shù)，主要由Crash(碰撞打分，越趨近于0越好)和Polar(極性打分，分值越小越好)組成?；谝陨显u判標(biāo)準篩選出最佳結(jié)合構(gòu)象，對獲得的最佳結(jié)合構(gòu)象初步探討肽段與β-胡蘿卜素相互作用情況；進一步利用LigPlus軟件對最佳結(jié)合構(gòu)象的相互作用力可視化，研究分析菜籽多肽與β-胡蘿卜素相互作用機制。根據(jù)分子對接結(jié)果和親疏水氨基酸組成選取多肽固相合成用于包封實驗驗證。

1.3.4 包封率及負載量的測定

參考LIU等[14]的方法稍作修改，對包封率和負載量進行測定。將合成多肽配制成5 mg/mL的溶液，調(diào)節(jié)pH為7，以多肽與β-胡蘿卜素質(zhì)量比為3∶5加入β-胡蘿卜素粉末并在25 ℃下連續(xù)攪拌3 h后即得到包封溶液。將包封后的多肽溶液每次加入10 mL的正己烷，渦旋振蕩3 min，重復(fù)數(shù)次直至正己烷層變?yōu)闊o色使游離的未被包封的β-胡蘿卜素分離出來，進一步測定正己烷中未被包封的β-胡蘿卜素的含量(β-胡蘿卜素的標(biāo)準曲線為y=0.843 5x-0.000 2，R2=0.998 7)。包封率和負載量計算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：β-c(free)為游離β-胡蘿卜素的含量，mg；β-c(total)為添加的β-胡蘿卜素的總含量，mg；m(RPs)為添加的菜籽多肽的質(zhì)量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準差表示，使用SPSS Statistics 21.0對數(shù)據(jù)進行分析，并使用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜測序及篩選結(jié)果的分析

2.1.1 質(zhì)譜測序

菜籽多肽液的質(zhì)譜測序總離子色譜圖如圖1所示。從菜籽多肽液中共鑒定出2 086條多肽序列。將得到的多肽測序結(jié)果與Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中菜籽蛋白的序列進行BLAST同源性比對，發(fā)現(xiàn)水解液中多肽大多來源于P33525、P33522、P24565等幾種油菜籽中主要的儲藏蛋白Cruciferin和Napin，也有部分多肽來源于菜籽蛋白中的P29111、C3S7F1等油料蛋白Oleosins[15]。

圖1 菜籽蛋白肽的總離子色譜圖Fig.1 Total ionic chromatogram on rapeseed peptides

2.1.2 多肽的篩選

多肽的分子質(zhì)量大小、親疏水性氨基酸分布和含量豐度等因素會影響包封效果[16-17]。本課題組先前研究證明，與小于1 kDa以及3～5 kDa的多肽組分相比，1～3 kDa的多肽具有最優(yōu)的包封效果。此外，HAN等[18]研究表明，親疏水氨基酸規(guī)律性交替分布或者各分布在多肽鏈的1端的多肽可能更有利于多肽的自組裝，進而可提高其包封效果。此外，參考GRAVY值選擇接近于0的兩親性多肽[19]。再者，從多肽含量和原料來源的獨特性考慮，選擇酶解液中含量豐富且來源為菜籽蛋白中最主要蛋白的多肽。因此，篩選得到了5條多肽(GFRDMHQKVE、NSYDLPILRVL、GTCPFIAIPF、KGQQGQSQGQQ、NTGDQPLVII，表1)用于后續(xù)分子對接。由表1可知，這5條多肽均來源于最主要的菜籽蛋白且含量豐富，分子質(zhì)量均為1 000～1 300 Da，并且這5條多肽按照親疏水性氨基酸規(guī)律性交替(RPs-1)和親疏水性氨基酸各在多肽鏈的一端(RPs-2～RPs-5)的特征分布。同時，這5條多肽的GRAVY值均接近于0，可能具有良好的兩親性有利于多肽自組裝包封，值得進一步通過分子對接實驗進行研究。

表1 所篩選菜籽多肽的基本信息Table 1 Basic information on the rapeseed peptides

2.2 分子對接結(jié)果分析

5條菜籽多肽的3D結(jié)構(gòu)圖如圖2所示。不同多肽展現(xiàn)出不同構(gòu)象，彎曲折疊形成了一定的空間結(jié)構(gòu)。5條菜籽多肽分別與β-胡蘿卜素的分子對接模型如圖3所示。藍色的整片區(qū)域是多肽的“對接口袋”，線形形狀的小分子物質(zhì)即為β-胡蘿卜素。由圖3可知，沒有出現(xiàn)β-胡蘿卜素分子遠離多肽的現(xiàn)象，說明多肽能夠與β-胡蘿卜素形成穩(wěn)定的包封復(fù)合物。β-胡蘿卜素端鏈上的2,6,6-三甲基環(huán)己烯基與多肽的“對接口袋”可能產(chǎn)生了相互作用，但具體相互作用力后續(xù)將利用LigPlus軟件進一步分析。分子對接結(jié)果的打分評價結(jié)果如表2所示。從T-Score數(shù)據(jù)來看，上述幾種多肽的T-Score值都較低，說明菜籽多肽與β-胡蘿卜素的相互作用效果不太理想，但還需結(jié)合一致性打分函數(shù)C-Score的結(jié)果來進一步判斷。C-Score是應(yīng)用最為廣泛的評價指標(biāo)，所篩選的5種多肽的C-Score≥4，表示對接成功，說明對接結(jié)果與實驗的相似度較高，具有可靠性[20]。

表2 分子對接結(jié)果的打分結(jié)果Table 2 Scoring results of molecular docking

A-RPs-1；B-RPs-2；C-RPs-3；D-RPs-4；E-RPs-5圖2 所篩選菜籽多肽的3D結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Three dimensional structure diagram on the selected rapeseed peptides

A-RPs-1；B-RPs-2；C-RPs-3；D-RPs-4；E-RPs-5圖3 所篩選菜籽多肽與β-胡蘿卜素的分子對接模型Fig.3 The molecular docking model on the selected rapeseed peptides and β-carotene

5條多肽與β-胡蘿卜素2D相互作用力可視化結(jié)果如圖4所示。圖中“睫毛狀”標(biāo)識表示所發(fā)生疏水相互作用的氨基酸，標(biāo)識的數(shù)目也反映了疏水相互作用力的強弱。由圖4可知菜籽多肽與β-胡蘿卜素的非共價相互作用力主要為疏水相互作用，且參與疏水相互作用的氨基酸大多在多肽“C端”。這與ALLAHDAD等[21-22]利用分子對接揭示β-胡蘿卜素分別與酪蛋白和乳清蛋白主要通過疏水相互作用結(jié)合的結(jié)論類似。本課題組前期借助傅里葉變換紅外光譜的研究表明菜籽多肽與β-胡蘿卜素在包封過程中沒有氫鍵的形成，因此更可能是疏水相互作用的結(jié)果[6]。根據(jù)疏水相互作用標(biāo)識的數(shù)目可知，RPs-1的2個氨基酸(谷氨酰胺和纈氨酸)分別與β-胡蘿卜素的2,6,6-三甲基環(huán)己烯基發(fā)生疏水相互作用，而RPs-2～RPs-5均只有1個氨基酸與β-胡蘿卜素產(chǎn)生疏水相互作用。與RPs-2～RPs-5相比，RPs-1與β-胡蘿卜素產(chǎn)生的疏水相互作用更強，可能具有更優(yōu)的包封效果。此外，通過進一步歸納多肽與β-胡蘿卜素相互作用的氨基酸種類可知，纈氨酸和谷氨酰胺與β-胡蘿卜素的2,6,6-三甲基環(huán)己烯基產(chǎn)生的疏水相互作用可能在包封中發(fā)揮了重要的作用。因此，基于分子對接結(jié)果和親疏水氨基酸的組成，通過化學(xué)合成RPs-1和RPs-5，用于驗證包封實驗。

A-RPs-1；B-RPs-2；C-RPs-3；D-RPs-4；E-RPs-5圖4 2D相互作用可視化結(jié)果圖Fig.4 The image of 2D interaction visualization results

2.3 相互作用包封的結(jié)果分析

合成多肽RPs-1和RPs-5的包封率和負載量如圖5所示。RPs-1和RPs-5的包封率和負載量分別達到93.17%和0.56 mg/mg，95.70%和0.57 mg/mg。與利用食源性蛋白對類胡蘿卜素包封的類似研究對比，乳清分離蛋白對番茄紅素進行包封制備納米顆粒的包封率僅為64.7%[23]。以玉米醇溶蛋白作載體，對葉黃素進行包封制備納米顆粒，測得包封率為85.18%[24]。綜上，合成的2條菜籽多肽對β-胡蘿卜素的包封均表現(xiàn)出良好的效果，并且RPs-5較RPs-1具有更優(yōu)的包封效果。這與分子對接結(jié)果略有差異，可能的原因是分子對接時所使用的是多肽與小分子物質(zhì)(β-胡蘿卜素)是一對一的相互作用，但在實際體系中往往是多個菜籽多肽分子與多個β-胡蘿卜素分子之間的相互作用[25]。

圖5 RPs-1和RPs-5的包封率和負載量Fig.5 The encapsulation efficiency and loading amount on RPs-1 and RPs-5

3 結(jié)論

菜籽蛋白水解液中的多肽大部分來源于菜籽蛋白的儲藏蛋白Cruciferin和Napin，少部分來源于油料蛋白Oleosins。菜籽多肽與β-胡蘿卜素的相互作用力主要是疏水相互作用。此外，菜籽多肽中參與疏水相互作用的氨基酸主要為谷氨酰胺、纈氨酸、脯氨酸和異亮氨酸，并且大多在多肽鏈的“C端”。進一步篩選合成的2條多肽鏈(GFRDMHQKVE、NTGDQPLVII)均具有良好的包封效果。因此，本研究可為菜籽多肽包封β-胡蘿卜素等疏水性生物活性物質(zhì)提供一定的理論參考。