轉(zhuǎn)鐵蛋白受體對(duì)鐵過(guò)載所致大鼠心肌細(xì)胞鐵死亡的作用及其機(jī)制

楊嵐婷，徐濤,2，楊福情，肖丹丹，宋林，王建勛*

1青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266000；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109

鐵是多細(xì)胞生物和幾乎所有微生物的必需微量元素，也是人類(lèi)飲食中主要的微量營(yíng)養(yǎng)素之一[1]。鐵缺乏會(huì)對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病、心力衰竭和肺動(dòng)脈高壓患者產(chǎn)生不利影響[2]。近年來(lái)相關(guān)研究顯示，除鐵缺失導(dǎo)致的機(jī)體紊亂外，鐵過(guò)載也會(huì)給機(jī)體造成嚴(yán)重傷害，表現(xiàn)為活性氧的產(chǎn)生增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或死亡、組織和器官損傷[3-4]。鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠降低細(xì)胞內(nèi)鐵水平，位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TFRC)可與攜帶游離鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，將細(xì)胞外鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞內(nèi)鐵水平，對(duì)維持細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)具有重要作用[5]。2012年哥倫比亞大學(xué)Dixon等[6]報(bào)告，鐵死亡是一種依賴于鐵離子的程序性死亡機(jī)制，細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的大量累積是鐵死亡的明顯特征之一。已有研究報(bào)道鐵死亡是治療心肌病的一個(gè)重要靶標(biāo)，在心臟缺血再灌注損傷中伴隨著大量脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生[7-10]。但鐵過(guò)載是否通過(guò)鐵死亡參與心臟疾病發(fā)生發(fā)展的研究較少。基于鐵穩(wěn)態(tài)和鐵死亡與心臟疾病的密切聯(lián)系，TFRC作為調(diào)節(jié)鐵代謝的重要分子是否通過(guò)鐵死亡參與心臟疾病值得進(jìn)一步探討。本研究觀察了鐵過(guò)載對(duì)小鼠心臟功能以及H9C2大鼠心肌細(xì)胞鐵死亡的影響，以探討TFRC在心肌細(xì)胞鐵死亡中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 H9C2大鼠心肌細(xì)胞，通過(guò)傳代擴(kuò)增獲得；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于大連美侖公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)于廣州賽國(guó)生物科技有限公司；0.25%胰酶消化液購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素、SDS-PAGE凝膠試劑盒購(gòu)于蘇州新賽美生物科技有限公司；超敏ECL發(fā)光液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR)、染料法定量PCR檢測(cè)試劑盒(SYBR qPCR Master Mix)購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；BODIPY?581/591 C11染料、檸檬酸鐵銨(AIC)和鐵死亡誘導(dǎo)劑愛(ài)拉斯汀(Erastin)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；PBS緩沖液、碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、RIPA組織/細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1)購(gòu)于美國(guó)Selleck公司；TFRC兔單克隆抗體和谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(GPX4)兔單克隆抗體購(gòu)于英國(guó) Abcam 公司；β-actin兔單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)二抗購(gòu)于武漢 ABclonal 公司；TFRC的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)寡核苷酸購(gòu)于上海吉瑪公司； jetPRIME? 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于法國(guó)Polyplus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 C57BL/6J雄性小鼠14只，8周齡，體重18～22 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0003]，采用標(biāo)簽法隨機(jī)抽樣分為高鐵飲食組和正常飲食組，每組7只。高鐵飲食組小鼠連續(xù)喂食高鐵飼料(2.41 g元素鐵/kg)8周；正常飲食組小鼠連續(xù)喂食常規(guī)飼料(36.54 mg 元素鐵/kg)8周。小鼠16周齡時(shí)行動(dòng)物超聲檢查，并取其心臟組織進(jìn)行相關(guān)分析。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物福利倫理委員會(huì)(20210510C571420210710011)和使用委員會(huì)審批通過(guò)。

1.3 小鼠心臟組織MDA含量檢測(cè) 使用MDA含量檢測(cè)試劑盒(索萊寶，BC0025)檢測(cè)小鼠心臟組織MDA含量，按說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各樣本在450 nm、532 nm和600 nm波長(zhǎng)的吸光度。

1.4 Masson染色檢測(cè)心肌組織纖維化情況 石蠟切片烘干后脫蠟至水，按照Masson染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，中性樹(shù)膠封片。在奧林巴斯IX73型研究級(jí)倒置顯微鏡下觀察心肌組織纖維化情況并拍照。用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算膠原沉積面積。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞。H9C2細(xì)胞始終生長(zhǎng)在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中；分別用50、100、200、300、500 μmol/L AIC，10 μmol/L Fer-1或5 μmol/L Erastin，在指定時(shí)間處理細(xì)胞24 h。

1.6 RNA干擾敲低TFRCTFRC的特異性siRNA寡核苷酸序列為 5'-CCUAAAUCUUCUCGCUUAUTT-3'；陰性對(duì)照為 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。通過(guò)Nucleotide BLAST與GenBank中的所有其他序列進(jìn)行比較，確定該siRNA寡核苷酸序列的特異性。使用 jetPRIME? 轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，以敲低TFRC的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中使用六孔板培養(yǎng)細(xì)胞，將200 μl jetPRIME? 緩沖液、1524 ng siRNA或陰性對(duì)照RNA、4 μl jetPRIME? 轉(zhuǎn)染試劑混勻后，室溫靜置10 min加入孔板中。

1.7 細(xì)胞死亡率檢測(cè) 將H9C2細(xì)胞接種到6孔板中，用AIC、Fer-1或Erastin處理24 h后，將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，去掉培養(yǎng)基，PBS洗滌3遍后加入500 μl胰酶，消化1 min后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中并吹打至單個(gè)細(xì)胞。4 ℃、1000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml PI(1.5 μmol/L)工作液重懸后置于4 ℃搖床孵育20 min。4 ℃、1000 r/min離心5 min，棄上清，用1 ml PBS 洗滌。4 ℃、1000 r/min離心5 min，棄上清，用1 ml PBS 重懸，過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物檢測(cè) 將H9C2細(xì)胞接種到6孔板中，用AIC或Erastin處理24 h后，將6孔板從培養(yǎng)箱中取出；加親脂熒光染料C11(2 μmol/L)放置于37 ℃培養(yǎng)箱避光染色30 min。將染色后的培養(yǎng)基收集到15 ml離心管中，PBS洗滌3遍后加入500 μl胰酶，消化1 min后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的15 ml離心管中。1000 r/min離心5 min，棄上清，用1 ml PBS洗滌細(xì)胞。1000 r/min離心5 min，棄上清，加1 ml PBS重懸細(xì)胞，過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察脂質(zhì)過(guò)氧化物相對(duì)含量。

1.9 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將H9C2細(xì)胞接種到6孔板中，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥處理或轉(zhuǎn)染，在指定時(shí)間將6孔板從培養(yǎng)箱中取出置于冰上。用PBS洗滌3遍后每孔加入100 μl含有PMSF的裂解液。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮取至1.5 ml EP管中，冰上裂解20 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取75 μl上清于新的EP管中，每管加25 μl 4×蛋白上樣緩沖液，金屬浴98 ℃加熱10 min。蛋白樣品用12.5%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h；兔單克隆抗體TFRC 一抗(1:1000稀釋)、兔單克隆抗體GPX4 一抗(1:1000稀釋)、兔單克隆抗體β-actin(1:10 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L) 二抗(1:5000稀釋)室溫孵育1 h，使用超敏ECL發(fā)光液顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 qRT-PCR檢測(cè)TFRCmRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Master Mix試劑盒和CFX96 qRT-PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，總反應(yīng)體系為20 μl [SYBR 10 μl、Primer1(10 μmol/L)0.4 μl、Primer2(10 μmol/L) 0.4 μl、Template cDNA 1 μl、ddH2O 8.2 μl]。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參照。相應(yīng)引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高鐵飲食對(duì)小鼠心臟組織的影響 超聲心動(dòng)檢查結(jié)果顯示，與正常飲食組比較，高鐵飲食組小鼠心室間隔厚度(IVSd)和左心室后壁厚度(LVPWd)明顯增大[(0.96±0.12) mmvs. (0.73±0.09) mm，(1.18±0.28) mmvs. (0.84±0.07) mm，P＜0.05]，左室射血分?jǐn)?shù)[EF(%)]和左心室縮短分?jǐn)?shù)[FS(%)]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(67.59%±13.13%vs.74.96%±7.63%，35.39%±9.18%vs.38.28%±8.56%，P>0.05)。與正常飲食組比較，高鐵飲食組小鼠心臟組織MDA相對(duì)含量和心肌膠原沉積相對(duì)面積均明顯增加(2.08±0.80vs.1.00±0.50，4.04±0.60vs.1.00±0.21，P＜0.05，圖1)。

圖1 高鐵飲食誘導(dǎo)小鼠心肌組織的變化(n=4)Fig.1 Changes of myocardial tissue of mice induced by high-iron diet (n=4)

2.2 高鐵環(huán)境對(duì)大鼠心肌細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的影響 H9C2大鼠心肌細(xì)胞給予不同濃度(50、100、200、300、500 μmol/L)AIC處理2 4 h 后，隨著A I C 濃度增加，細(xì)胞死亡率(0.37%±0.06%，8.3%±0.17%，11.23%±0.21%，21.87%±1.43%，30.3%±0.98%)逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；其中AIC濃度為500 μmol/L時(shí)細(xì)胞死亡率明顯高于其他濃度(P＜0.05，圖2A)。分別用PI染色和C11染色檢測(cè)對(duì)照組、500 μmol/L AIC組及AIC+Fer-1組(500 μmol/L AIC+10 μmol/L Fer-1)的細(xì)胞死亡率(圖2B)和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量(圖2C、D)，結(jié)果顯示，AIC組細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化物相對(duì)含量均高于對(duì)照組(33.73%±1.20%vs.2.30%±1.73%，5.36±0.06vs.1.00±0.19，P＜0.05)；AIC+Fer-1組的細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化物相對(duì)含量均低于AIC組(19.63%±0.81%vs.33.73%±1.20%，2.03±0.12vs.5.36±0.06，P＜0.05)。

圖2 AIC與Fer-1處理后H9c2大鼠心肌細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量變化(n=3)Fig. 2 Death rate and lipid peroxide content of H9c2 rat's cardiomyocytes treated with AIC and Fer-1 (n=3)

2.3 高鐵環(huán)境下大鼠心肌細(xì)胞TFRC表達(dá)變化Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與處理前比較，H9C2大鼠心肌細(xì)胞采用500 μmol/L AIC處理24 h后，TFRCmRNA相對(duì)表達(dá)水平升高(2.78±0.45vs.1.00±0.13，P＜0.05)，TFRC蛋白相對(duì)表達(dá)水平也升高(3.08±0.03vs.1.00±0.03，P＜0.05，圖3A、B)，而GPX4相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯變化(1.07±0.06vs.1.00±0.01，P>0.05，圖3C)。

圖3 AIC處理后H9C2大鼠心肌細(xì)胞TFRC表達(dá)水平的變化Fig.3 Changes on expression levels of TFRC in H9C2 rat's cardiomyocytes treated with AIC

2.4 敲低TFRC對(duì)AIC處理的大鼠心肌細(xì)胞死亡率及脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的影響 H9C2大鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染TFRC的siRNA(TFRC-si)后，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，TFRC mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降(0.54±0.01vs.0.97±0.01，P＜0.05，圖4A)；PI染色和C11染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TFRC-si后，經(jīng)AIC處理的H9C2大鼠心肌細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化物相對(duì)含量均明顯下降(14.13%±0.06%vs.26.2%±0.51%，3.35±1.07vs.5.28±0.65，P＜0.05，圖4B、C)。

圖4 敲低TFRC后AIC處理的H9C2大鼠心肌細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量變化Fig.4 Lower death rate and lipid peroxide content of H9C2 rat's cardiomyocytes treated with AIC after TFRC knocked down

2.5 敲低TFRC對(duì)Erastin處理的大鼠心肌細(xì)胞GPX4表達(dá)和細(xì)胞死亡率的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示， Erastin處理24 h后，H9C2大鼠心肌細(xì)胞GPX4相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(0.45±0.00vs.1.00±0.01，P＜0.05)，TFRC相對(duì)表達(dá)水平明顯升高(1.22±0.07vs.1.00±0.08，P＜0.05，圖5A)；轉(zhuǎn)染TFRC的si-RNA敲低TFRC后，PI染色結(jié)果顯示，Erastin處理的H9C2細(xì)胞死亡率明顯降低(17.47%±0.47%vs.31.80%±1.22%，P＜0.05，圖5B)。

圖5 敲低TFRC對(duì)Erastin處理的H9C2大鼠心肌細(xì)胞TFRC和GPX4蛋白表達(dá)及細(xì)胞死亡率的影響Fig.5 Influence on the cell mortality and the expressions of TFRC and GPX4 proteins of H9C2 rat's cardiomyocytes treated with Erastin after TFRC knocked down

3 討 論

細(xì)胞死亡是一個(gè)基本的生理過(guò)程。正常的細(xì)胞死亡有利于生物體的增殖、分化、發(fā)育和代謝；而非正常細(xì)胞死亡可誘發(fā)多種疾病發(fā)生，如神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等處于終末期分化的細(xì)胞大量死亡，可造成神經(jīng)障礙、肌肉萎縮或心力衰竭等多種疾病的發(fā)生[11]。因此，對(duì)細(xì)胞死亡的精準(zhǔn)調(diào)控可能對(duì)部分疾病的治療十分關(guān)鍵。目前已報(bào)告細(xì)胞凋亡、壞死、自噬、焦亡等多種細(xì)胞死亡方式[12-13]，而鐵死亡作為細(xì)胞死亡的方式之一，被越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注；對(duì)鐵死亡的深入研究可能為疾病治療提供更多有效靶點(diǎn)。由于血紅蛋白具有運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧氣的作用，鐵穩(wěn)態(tài)對(duì)維持生命體正常的生物功能十分重要，對(duì)于維持心血管健康尤為重要[6]。鐵過(guò)載時(shí)，細(xì)胞內(nèi)增加的亞鐵離子與過(guò)氧化氫發(fā)生芬頓反應(yīng)，催化羥基自由基(OH.)生成，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞死亡，這種細(xì)胞死亡方式被稱為鐵死亡。鐵死亡雖然也是一種程序性細(xì)胞死亡方式，但其在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)上與凋亡和壞死截然不同。鐵死亡依賴于鐵和活性氧(ROS)，脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累為其主要特征。

心臟是人類(lèi)和脊椎動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)力的來(lái)源[14]。心力衰竭的發(fā)病率和病死率均較高，是造成人類(lèi)死亡的重要原因之一。處于終末分化的心肌細(xì)胞損失是致死性心力衰竭發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵病理因素，但心肌細(xì)胞死亡的具體機(jī)制尚不完全清楚。鐵死亡最早報(bào)告于癌細(xì)胞，有多項(xiàng)研究報(bào)道了鐵死亡與癌癥的關(guān)系。近年一些研究顯示，心肌損傷過(guò)程中存在鐵過(guò)載現(xiàn)象[15-17]。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)8周的高鐵飲食可引起小鼠心臟IVSd和LVPWd明顯增加，但EF和FS與正常飲食組差異不明顯且在正常范圍，提示尚未出現(xiàn)明顯的心功能障礙。之前有研究報(bào)告IVSd、LVPWd增加是慢性心臟缺血的表現(xiàn)，是肥厚型心肌病的前兆[10]。據(jù)此，我們推測(cè)，長(zhǎng)期高鐵飲食對(duì)心臟存在較大危害，可能加重心肌梗死、缺血再灌注損傷等引起的心臟疾病。本研究結(jié)果還顯示，連續(xù)8周的高鐵飲食導(dǎo)致小鼠心臟組織MDA含量和膠原沉積面積增加，提示高鐵飲食可能促進(jìn)小鼠心肌細(xì)胞損傷和纖維化的發(fā)展。據(jù)此推測(cè)，小鼠心肌細(xì)胞損傷可能與高鐵飲食引起的鐵死亡有關(guān)，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

由于心臟的高能量需求，鐵過(guò)載對(duì)心臟功能有較為不利的影響，可加劇心力衰竭。心力衰竭是血色病和β-地中海貧血較為常見(jiàn)的死亡原因，其特征是原發(fā)性或輸血引起的鐵超負(fù)荷[18-20]。2014年，一項(xiàng)納入131 553名參與者和2459例冠心病患者的薈萃分析顯示：與攝入量較低的參與者相比，血紅素鐵攝入量較高的參與者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)增加了31%[21]。2019年，浙江大學(xué)王福俤教授團(tuán)隊(duì)報(bào)告鐵死亡是對(duì)抗心肌病的有效靶點(diǎn)；阿霉素(DOX)處理小鼠后，上調(diào)的血紅素加氧酶1將血紅素降解為大量非血紅素鐵，進(jìn)而誘發(fā)急性心肌病，而高鐵飲食可加重DOX誘發(fā)的心肌損傷；此外，還報(bào)告缺血再灌注手術(shù)組小鼠心臟非血紅素鐵和鐵蛋白mRNA表達(dá)水平明顯升高[15]。因此，從鐵過(guò)載引起的鐵死亡入手，尋找治療心臟疾病的新靶標(biāo)可能會(huì)成為未來(lái)心臟疾病機(jī)制研究的焦點(diǎn)。鐵穩(wěn)態(tài)對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的正常運(yùn)作至關(guān)重要。TFRC作為鐵離子進(jìn)入細(xì)胞的“看門(mén)人”，在心肌細(xì)胞鐵代謝調(diào)控中發(fā)揮核心作用，但具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)靶向TFRC能夠減少鐵過(guò)載引起的大鼠心肌細(xì)胞死亡，該結(jié)果可能為心臟疾病的治療提供新的思路。

抑制半胱氨酸攝取或促進(jìn)脂質(zhì)修復(fù)酶GPX4的失活可誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。一項(xiàng)定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，心肌梗死期間GPX4下調(diào)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞鐵死亡；RNA測(cè)序和qRT-PCR分析顯示GPX4下調(diào)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，并可促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累，導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞鐵死亡[22]。在流行病學(xué)研究中，人類(lèi)GPX4基因變異與肥胖和心血管疾病有關(guān)。代謝相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，GPX4在脂質(zhì)過(guò)氧化物導(dǎo)致肥胖發(fā)生的心臟代謝紊亂中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23-24]。一項(xiàng)關(guān)于誘導(dǎo)型GPX4敲除小鼠和肝臟缺血再灌注的研究顯示，F(xiàn)er-1可減輕GPX4敲除小鼠中鐵死亡的發(fā)生，同時(shí)可減輕缺血再灌注引起的肝損傷[25]。王福俤教授團(tuán)隊(duì)報(bào)告，F(xiàn)er-1和鐵螯合劑能夠減輕缺血再灌注損傷引起的小鼠心肌肥大和心肌梗死，提示鐵死亡可作為對(duì)抗心肌病的靶標(biāo)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀型貧血癥小鼠模型中血紅素誘導(dǎo)的血紅素加氧酶1可通過(guò)鐵死亡驅(qū)動(dòng)心肌病，而抑制鐵死亡能夠減輕鐮刀型貧血相關(guān)的心肌病[26]。本研究顯示，大鼠心肌細(xì)胞在高鐵環(huán)境誘導(dǎo)下TFRC表達(dá)增加，但GPX4的表達(dá)變化不明顯，提示TFRC介導(dǎo)的鐵過(guò)載誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡中可能沒(méi)有GPX4的參與。我們推測(cè)，高鐵誘導(dǎo)的鐵死亡主要通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化而發(fā)生，而GPX4介導(dǎo)的活性氧清除對(duì)其影響不顯著。本研究中使用Erastin處理心肌細(xì)胞后，GPX4表達(dá)下調(diào)，與其他相關(guān)研究一致[27-28]；TFRC表達(dá)上調(diào)，提示TFRC可能在鐵死亡發(fā)生的多個(gè)通路中發(fā)揮作用。上述結(jié)果提示，不同誘導(dǎo)條件或不同病理因素作用下，鐵死亡發(fā)生的調(diào)控機(jī)制有所不同，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，鐵死亡是一種普遍且動(dòng)態(tài)的細(xì)胞死亡形式，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，鐵死亡抑制劑有望對(duì)細(xì)胞提供實(shí)質(zhì)性的保護(hù)。本研究初步觀察了鐵過(guò)載對(duì)正常小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，但尚缺乏鐵過(guò)載對(duì)小鼠心肌損傷影響的深入探討；本研究也為靶向TFRC調(diào)控大鼠心肌細(xì)胞死亡提供了證據(jù)，為未來(lái)探索心臟疾病治療的新策略，如通過(guò)調(diào)節(jié)鐵代謝來(lái)緩解心力衰竭等提供了思路。