基于生物信息學(xué)篩選通過調(diào)控脂肪細(xì)胞功能改善肥胖的中藥單體

李暢，冷清陽(yáng)，冷華卿，張宏利，李曉華*

1上海中醫(yī)藥大學(xué)第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200137；2上海市黃浦區(qū)打浦橋街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200032

肥胖是長(zhǎng)期能量攝入與消耗不平衡引起的以體內(nèi)脂質(zhì)過度蓄積、體重指數(shù)超過一定范圍為特征的慢性代謝性疾病，可增加罹患心血管疾病、2型糖尿病等的風(fēng)險(xiǎn)[1-4]，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。迄今為止，治療肥胖主要是采用生活方式管理、藥物降脂、減肥手術(shù)等策略，但尚不能滿足臨床需求。減重手術(shù)雖然可通過改善患者的脂肪組織功能、增加胰島素敏感性、降低炎癥水平而改善代謝[5]，但存在術(shù)后并發(fā)癥等問題。本研究基于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)，運(yùn)用生物信息學(xué)手段分析差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)和核心(hub)基因，并通過藥物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(connectivity map，cMAP)預(yù)測(cè)及鑒定可調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞功能的中藥單體，旨在為肥胖治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 GEO芯片數(shù)據(jù)下載及處理 通過在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“BMI AND subcutaneous adipose tissue”和“bariatric surgery AND subcutaneous adipose tissue”，可得到GSE70353[6]和GSE72158[7]兩個(gè)數(shù)據(jù)集的探針矩陣。數(shù)據(jù)集GSE70353含770名不同BMI的男性(45～73歲)皮下白色脂肪組織(subcutaneous adipose tissue，SAT)的基因表達(dá)，篩選出其中110名肥胖者[體重指數(shù)(BMI)>30 kg/m2]及259名非肥胖者(BMI＜25 kg/m2)的數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)集GSE72158含42例女性減肥術(shù)前及術(shù)后1年SAT的基因表達(dá)。這兩個(gè)數(shù)據(jù)集的詳細(xì)信息見表1。利用perl腳本將探針轉(zhuǎn)換為基因名，將矩陣數(shù)據(jù)分組合并。

表1 數(shù)據(jù)集基礎(chǔ)指標(biāo)信息Tab.1 Detail for the GEO data sets

1.1.2 差異基因的篩選 通過R軟件(4.11版)對(duì)探針矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，運(yùn)行l(wèi)imma包篩選出DEGs(|log2(fold change)|>0.5，Padjust＜0.05)，隨后繪制DEGs火山圖。整理數(shù)據(jù)，利用R軟件讀取兩個(gè)數(shù)據(jù)集各自對(duì)應(yīng)DEGs的基因名稱，去掉基因首尾空格，基因取唯一，引用Venn包對(duì)交集基因進(jìn)行繪圖。

1.1.3 DEGs的GO功能富集和KEGG通路富集分析 通過R軟件(4.11版)讀取兩個(gè)數(shù)據(jù)集中篩選出來的共同DEGs，通過安裝或引用DOSE、clusterProfiler、org. Hs. eg. db、enrichplot對(duì)共同的DEGs進(jìn)行功能注釋Gene Ontology(GO)富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析(Padjust＜0.05)，并篩選出前20個(gè)富集功能和通路。GO分析包括生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)分析。

1.1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建和hub基因的篩選 將共同的DEGs導(dǎo)入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)，獲得蛋白質(zhì)PPI后，設(shè)置高度置信(high confidence)=0.7，隱藏?zé)o鏈接的單個(gè)節(jié)點(diǎn)。將PPI篩選出的基因?qū)隒ytoscape(3.8.2版)，利用CytoNCA包選取度中心性(degree)為中位值至最大值之間，篩選出hub基因。

1.1.5 小分子中藥單體篩選 使用cMAP分別讀取hub基因的上調(diào)組及下調(diào)組基因，并預(yù)測(cè)可靶向這些基因的小分子藥物。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠3 T 3-L 1 細(xì)胞系購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。巖白菜素、銀杏內(nèi)酯A購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰島素購(gòu)自美國(guó)Lilly公司；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、二甲基亞砜(DMSO)、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物購(gòu)自上海生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；牛血清白蛋白購(gòu)自新西蘭Proliant生物公司。

1.2.2 3T3-L1白色脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于24孔板，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞完全融合后采用含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μg/ml胰島素的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)至細(xì)胞完全收縮，采用含10 μg/ml胰島素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后換成不含胰島素的完全培養(yǎng)基，每2 d更換一次培養(yǎng)基。誘導(dǎo)分化的第8天，3T3-L1誘導(dǎo)的成熟白色脂肪細(xì)胞(white adipocytes，WAT)即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞分組與處理 采用含2%牛血清白蛋白的DMEM高糖培養(yǎng)基饑餓6 h后，將細(xì)胞分別加入含終濃度為0、0.4、2和10 μmol/L巖白菜素的培養(yǎng)基和含終濃度為0、0.01、0.1和1 μmol/L銀杏內(nèi)酯A的培養(yǎng)基內(nèi)處理24 h。獨(dú)立細(xì)胞實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用Trizol試劑提取白色脂肪細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA稀釋10倍后作為模板，采用qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)情況。引物序列如下：腫瘤壞死因子α(TNF-α)，上游5'-TGGGCCTCTCATGCACCACC-3'，下游5'-GAGGCAACCTGACCACTCTCCCT-3'；白細(xì)胞介素6(IL-6)，上游5'-AGACAAAGCCAGAGTCCT TCAG-3'，下游5'-GCCACTCCTTCTGTGACTCCAG-3'；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)，上游5'-TCGCTGATGCACTGCCTATG-3'，下游5'-GA GAGGTCCACAGAGCTGATT-3'；核糖體蛋白基(36B4)，上游5'-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCT-3'，下游5'-CCGCAGGGGCAGCAGTGGT-3'。以36B4作為內(nèi)參基因，計(jì)算2-ΔΔCt值比較基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩數(shù)據(jù)庫(kù)中與改善肥胖相關(guān)的共表達(dá)DEGs的篩選 GSE70353數(shù)據(jù)集中含有770名不同BMI男性(45～73歲)SAT的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出259名非肥胖者(BMI＜25 kg/m2)與110名肥胖者(BMI>30 kg/m2)的132個(gè)DEGs用于后續(xù)研究，其中上調(diào)基因59個(gè)，下調(diào)基因73個(gè)(圖1A)；GSE72158數(shù)據(jù)集中含有42例減肥手術(shù)前及術(shù)后1年女性患者SAT的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出291個(gè)DEGs用于后續(xù)研究，其中上調(diào)基因76個(gè)，下調(diào)基因215個(gè)(圖1B)。這兩個(gè)數(shù)據(jù)集有64個(gè)共同的DEGs，其中，減肥手術(shù)改善肥胖后SAT中有19個(gè)基因(與肥胖呈負(fù)相關(guān))上調(diào)，45個(gè)基因(與肥胖呈正相關(guān))下調(diào)(圖1C、D，表2)，這些基因?qū)⒂糜诤罄m(xù)分析。

表2 兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的共表達(dá)差異基因(DEGs)Tab.2 Co-expressed DEGs in two data sets

圖1 兩個(gè)數(shù)據(jù)集共表達(dá)的差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選Fig.1 Identification of co-expressed DEGs from two data sets

2.2 共表達(dá)DEGs的GO富集分析 GO富集分析中的BP分析結(jié)果顯示，共表達(dá)DEGs主要在中性粒細(xì)胞趨化性(neutrophil chemotaxis)、參與免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞活化(neutrophil activation involved in immune response)、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(neutrophil mediated immunity)、體液免疫反應(yīng)(humoral immune response)等子集中富集；CC分析結(jié)果顯示，共表達(dá)DEGs主要在特殊顆粒(specific granule)、分泌顆粒膜(secretory granule membrane)、低密度脂蛋白顆粒(low-density lipoprotein particle)等子集中富集；MF分析結(jié)果顯示，共表達(dá)DEGs主要定位在細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、趨化因子活性(chemokine activity)、CCR趨化因子受體結(jié)合(CCR chemokine receptor binding)、整理素結(jié)合(integrin binding)、趨化因子受體結(jié)合(chemokine receptor binding)等子集(圖2)。

圖2 共表達(dá)差異表達(dá)基因(DEGs)的GO富集分析Fig.2 GO enrichment results of co-expressed DEGs

2.3 共表達(dá)DEGs的KEGG富集分析 KEGG通路分析結(jié)果顯示，共表達(dá)的DEGs主要與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)(complement and coagulation cascades)、百日咳(pertussis)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)等通路有關(guān)，此外還與金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureusinfection)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、酒精性肝病(alcoholic liver disease)等通路有關(guān)(圖3)。

圖3 共表達(dá)差異表達(dá)基因(DEGs)的KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis of co-expressed DEGs

2.4 PPI的構(gòu)建與hub基因的鑒定 通過STRING構(gòu)建64個(gè)DEGs的PPI(圖4A)，篩選出高度置信(high confidence=0.7)且隱藏?zé)o節(jié)點(diǎn)的基因后，利用Cytoscape篩選Degree中位值(2)至最大值(12)之間的基因，共得到18個(gè)hub基因(圖4B、表3)，其中肥胖改善后下調(diào)的基因有17個(gè)(與肥胖呈正相關(guān))，僅APOB基因上調(diào)(與肥胖呈負(fù)相關(guān))。

表3 共表達(dá)基因中的18個(gè)核心(hub)基因Tab.3 Eighteen hub genes from co-expressed DEGs

圖4 兩個(gè)數(shù)據(jù)集共表達(dá)差異表達(dá)基因(DEGs)的PPI圖(A)及hub基因網(wǎng)絡(luò)圖(B，黃色為上調(diào)基因、橙色為下調(diào)基因)Fig.4 The PPI network (A) and hub genes (B, the yellow is up-regulated gene and the orange is down-regulated gene) of coexpressed DEGs in two data sets

2.5 中藥單體的預(yù)測(cè) 通過cMAP分析上調(diào)及下調(diào)的hub基因，篩選出1309個(gè)小分子藥物，選擇顯著富集(P＜0.05)的藥物，得到1264個(gè)小分子藥物，其中中藥提取物74個(gè)。去除有毒或不宜長(zhǎng)期內(nèi)服的藥物后，最終獲得28個(gè)中藥單體。其中22個(gè)已被證實(shí)可明顯降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重或通過其他機(jī)制改善肥胖；尚無研究表明其余6個(gè)中藥單體(北美黃連堿、荷包牡丹堿、巖白菜素、表長(zhǎng)春胺、銀杏內(nèi)酯A、長(zhǎng)春胺)與肥胖有關(guān)(表4)。

表4 cMAP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的中藥單體Tab.4 Traditional Chinese medicines (TCM) monomers screened from cMAP

2.6 初步驗(yàn)證篩選出的部分中藥單體改善肥胖的作用 qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，0.4 μmol/L巖白菜素組PPARγmRNA表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，2 μmol/L和10 μmol/L巖白菜素組PPARγmRNA表達(dá)水平有下調(diào)的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A)；0.4 μmol/L和10 μmol/L巖白菜素組IL-6mRNA表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，2 μmol/L巖白菜素組IL-6mRNA表達(dá)水平有下調(diào)的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5A)。與0 μmol/L組比較，0.1 μmol/L銀杏內(nèi)酯A組PPARγmRNA表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，0.01 μmol/L和1 μmol/L銀杏內(nèi)酯A組PPARγmRNA表達(dá)水平有下調(diào)的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)；0.1 μmol/L銀杏內(nèi)酯A組IL-6mRNA表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，0.01 μmol/L和1 μmol/L銀杏內(nèi)酯A組IL-6mRNA表達(dá)水平有下調(diào)的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)。

圖5 中藥單體對(duì)3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化的WAT中PPARγ、IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of TCM monomer on the expression of PPARγ and IL-6 mRNA in WAT induced by 3T3-L1 cells

3 討 論

肥胖是多種疾病的危險(xiǎn)因素，如未能及時(shí)控制，將嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且目前仍無令人滿意的治療措施。有研究發(fā)現(xiàn)，減重手術(shù)可改善患者的脂肪組織功能、增加胰島素敏感性、緩解炎癥等[5]。本研究的生物信息學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)，減肥手術(shù)后，促進(jìn)肥胖的促炎狀態(tài)向抗炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這或許是減肥手術(shù)后脂肪細(xì)胞功能改善的關(guān)鍵之處。但由于減肥手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格[30]、并發(fā)癥多，適用人群不夠廣泛，本研究試圖找到其他可改善脂肪細(xì)胞功能的藥物，如中藥單體。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的兩個(gè)數(shù)據(jù)集分別篩選出肥胖人群向非肥胖人群轉(zhuǎn)化后的DEGs，以及經(jīng)減肥手術(shù)治療前后患者的DEGs，并確定了64個(gè)共同的DEGs，GO富集分析發(fā)現(xiàn)這64個(gè)DEGs主要與炎癥相關(guān)，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[31]。其中下調(diào)的45個(gè)基因主要與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和體液免疫等生物學(xué)過程有關(guān)，提示減肥手術(shù)緩解了肥胖引起的脂肪組織炎癥。此外，這64個(gè)DEGs多位于分泌顆粒、特定的顆粒及低密度脂蛋白顆粒中，分子功能多與炎癥趨化因子活動(dòng)相關(guān)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，下調(diào)的DEGs多與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)及內(nèi)分泌代謝等通路有關(guān)。

本研究進(jìn)一步對(duì)64個(gè)DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出18個(gè)hub基因。ACP5作為脂肪組織巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，可編碼酒石酸抗性酸磷酸酶，后者在小鼠中過表達(dá)后表現(xiàn)為增生性肥胖，并可促進(jìn)前脂肪細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期[32]。MMP9作為巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志物，可通過參與脂肪組織的細(xì)胞外間質(zhì)重構(gòu)來應(yīng)對(duì)脂肪組織的擴(kuò)張[33]，但目前尚不明確其是否對(duì)脂肪細(xì)胞本身的功能具有調(diào)節(jié)作用。脂肪組織中免疫球蛋白FCER1G，補(bǔ)體蛋白家族的C1QB、C1QC，補(bǔ)體受體VSIG4，趨化因子CCL2及配體蛋白TYROB均與免疫有關(guān)；SPP1是可上調(diào)ITF-γ和IL-12表達(dá)的細(xì)胞因子，與肥胖呈正相關(guān)[34]，提示此類hub基因可能在調(diào)節(jié)脂肪組織炎癥中發(fā)揮一定作用，但仍需進(jìn)一步證實(shí)。本研究篩選出的hub基因并非常見的脂肪細(xì)胞炎癥標(biāo)志物，但可作為觀察肥胖是否改善的伴隨指標(biāo)。

本研究在cMAP平臺(tái)篩選出同樣調(diào)控這18個(gè)hub基因的小分子藥物，有1309個(gè)小分子藥物作用后可觀察到這些hub基因的相應(yīng)變化，而最終篩選得到28個(gè)無明顯不良反應(yīng)且適合口服的中藥單體，其中的22個(gè)中藥單體已被證實(shí)能夠減重或通過其他方式改善肥胖。這22個(gè)中藥單體中，不乏熟知的抗肥胖藥物(如小檗堿、雷公藤紅素、兒茶素、辣椒素、熊果酸、青蒿素及其衍生物等)和近年才發(fā)現(xiàn)的抗肥胖藥物(如楊梅素、白樺脂酸、白楊素、槭樹素、橘皮苷等)，提示本研究方法預(yù)測(cè)出的藥物可靠性高。

另6個(gè)中藥單體尚無報(bào)道提示其可改善肥胖。有研究發(fā)現(xiàn)，巖白菜素可下調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞中的脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)志物PPARγ[2]，銀杏內(nèi)酯A可抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成脂分化[3]，而肥胖的外在表現(xiàn)形式是白色脂肪組織過度積累。絕大多數(shù)脂肪細(xì)胞在分化狀態(tài)與未分化的前體狀態(tài)之間循環(huán)[1]，故抑制脂肪細(xì)胞分化是改善肥胖的一種途徑。因此，筆者猜測(cè)巖白菜素和銀杏內(nèi)酯A或許可通過抑制白色脂肪分化而改善肥胖，并利用3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化的WAT模型進(jìn)行驗(yàn)證；此外，hub基因主要與炎癥相關(guān)，推測(cè)這兩個(gè)中藥單體可緩解炎癥反應(yīng)。因篩選出的hub基因在肥胖中的作用機(jī)制尚不明確，故本研究選擇了與肥胖炎癥相關(guān)的標(biāo)志物IL-6進(jìn)行驗(yàn)證。在細(xì)胞水平上，本研究初步證實(shí)巖白菜素和銀杏內(nèi)酯A可下調(diào)WAT中炎性因子IL-6、脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物PPARγmRNA的表達(dá)，提示巖白菜素和銀杏內(nèi)酯A可能具有通過調(diào)控脂肪細(xì)胞而改善炎癥，以及抑制脂肪細(xì)胞分化的作用，進(jìn)一步證實(shí)了此篩選方法的可靠性。但巖白菜素和銀杏內(nèi)酯A是否還通過其他作用機(jī)制改善肥胖，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。尚無研究發(fā)現(xiàn)另外4個(gè)中藥單體與肥胖相關(guān)，但是cMAP數(shù)據(jù)庫(kù)提示其可靶向與炎癥相關(guān)的hub基因，因此，筆者猜測(cè)這4個(gè)中藥單體也可能通過改善炎癥而發(fā)揮改善肥胖的作用，后續(xù)將進(jìn)一步明確其是否可調(diào)節(jié)炎癥水平，并對(duì)其改善肥胖的作用和機(jī)制進(jìn)行深入探討。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)可能調(diào)控脂肪細(xì)胞功能改善肥胖的中藥單體，共篩選出28個(gè)中藥單體，其中22個(gè)已被證實(shí)可改善肥胖，仍有6個(gè)中藥單體未被證實(shí)具有改善肥胖的作用。本研究初步證實(shí)2個(gè)中藥單體(巖白菜素和銀杏內(nèi)酯A)可能改善肥胖，表明此研究方法篩選的藥物可靠，為后續(xù)尋找和開發(fā)治療肥胖的藥物提供了新思路，另外4個(gè)中藥單體的作用則仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。