載阿替普酶磁性明膠納米粒的構(gòu)建及其溶栓作用研究

張文麗，郭大靜，王俊銳，鐘毅欣，冉海濤，張瑜*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射科，重慶 400010；2超聲分子影像重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400010

血栓形成是各類血栓性疾病如急性肺動(dòng)脈栓塞、急性心肌梗死和深靜脈血栓形成等的主要發(fā)病機(jī)制。當(dāng)前臨床治療血栓性疾病的首選方式是靜脈注射纖溶藥物，利用藥物激活纖溶酶活性，分解由致密纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與血小板交織而成的血栓，最終促進(jìn)血凝塊溶解，恢復(fù)血管通暢[1-2]。但是溶栓藥物的廣泛應(yīng)用并未顯著改變血栓性疾病的高致殘率和高致死率[3]。為了解決臨床血栓性疾病治療的不足，我們引入納米藥物遞送系統(tǒng)，試圖利用其靶向輸送的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)纖溶藥物的精準(zhǔn)輸送；其次，磁性納米可以在近紅外光(near infrared，NIR)介導(dǎo)下通過(guò)朗道阻尼效應(yīng)將光能快速轉(zhuǎn)化為熱能，為血栓性疾病提供新的治療策略[4-5]，加之磁性納米粒在分子影像學(xué)領(lǐng)域中具有良好的發(fā)展前景，為血栓性疾病有限治療窗口的診療一體化帶來(lái)了更多可能[6]?；谝陨侠碚摚狙芯恳悦髂z(gelatin，Gel)為納米載體，包裹溶栓藥物阿替普酶(alteplase，rt-PA)以及具備光聲(PA)和磁共振(MR)成像能力的磁性四氧化三鐵(Fe3O4)顆粒，靶向連接血栓纖維蛋白的五肽——半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-賴氨酸-丙氨酸(Cys-Arg-Glu-Lys-Ala，CREKA)，構(gòu)建靶向診療一體化雙模態(tài)顯像納米粒CREKA-Fe-rt-PA-Gel，并探究其體外雙模態(tài)顯像潛能與光熱增效溶栓效果及其體內(nèi)靶向血栓的能力。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 rt-PA(德國(guó)勃林格殷格翰公司)；Fe3O4(西安瑞禧生物科技有限公司)；CREKA多肽、異硫氰酸熒光素(FITC)-CREKA多肽、FITC-纖維蛋白原、人凝血酶(江蘇強(qiáng)耀生物科技有限公司)；A型Gel、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(美國(guó) Sigma-Aldrich 公司)；丙酮、戊二醛(重慶川東化工有限公司)；細(xì)胞膜紅色熒光探針DiIC18(3)(DiI，博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 儀器 聲震儀(美國(guó) Sonics ＆ Materials 公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90光粒徑測(cè)量?jī)x；BD FACS Vantage SE流式細(xì)胞儀；Lecia TSCCP2激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)；ELX800 酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Rad公司)；Shmadzu LC-2-1A HT 高效液相色譜儀(日本島津公司)；FC-80-2W-MM 808 nm激光器(中國(guó)Mid-River公司)；Fotric 220 近紅外熱成像儀(中國(guó)Fotric公司)；Vevo LAZR 光聲成像系統(tǒng)(加拿大 Visual Sonics 公司)；3.0 T 磁共振成像(MRI)掃描儀(德國(guó)SIEMENS公司)。

1.2 細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡雌性SD大鼠30只，體重170～200 g；6～8周齡雌性昆明小鼠20只，體重18～20 g。均由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2018-0003]提供。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2020年科倫審第44號(hào))，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用的規(guī)定。

1.4 納米粒制備 采用二次去溶劑法制備Gel納米粒[7]，將制備好的Gel納米粒稀釋至50 ml。制備CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒：取 2.5 ml Gel納米粒溶液，將200 μl Fe3O4(10 mg/ml)溶于1.3 ml PBS后加入Gel納米粒溶液中連續(xù)聲震 20 min，然后將1 mg rt-PA 溶于1 ml PBS 溶液，加入上述溶液后繼續(xù)聲震5 min。離心洗滌去除未反應(yīng)的Fe3O4及rt-PA，將上述納米粒(10 mg/ml)加入 PBS 溶液(pH=6)，以2:1的比例加入EDC、NHS，常溫下孵育2 h活化納米粒表面的羧基端，離心洗滌去除未反應(yīng)的 EDC、NHS，加入PBS(pH=8)及CREKA多肽繼續(xù)攪拌，待12 h后離心洗滌，制得CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒。

1.5 納米粒相關(guān)表征測(cè)定 以透射電鏡觀察CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的形態(tài)，以粒徑儀檢測(cè)其粒徑、分布及表面電位。在Gel納米粒制備過(guò)程中，將DiI加入丙酮中標(biāo)記Gel，在CREKA-Fe-rt-PAGel納米粒制備過(guò)程中使用FITC標(biāo)記CREKA，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察制備后納米粒的熒光顏色以驗(yàn)證CREKA多肽連接是否成功。將未標(biāo)記的Fert-PA-Gel作為對(duì)照組，DiI標(biāo)記的CREKA-Fe-rt-PAGel作為實(shí)驗(yàn)組，采用流式細(xì)胞儀分析熒光標(biāo)記以驗(yàn)證CREKA多肽的攜帶率。配制不同濃度 (31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1000.00 μg/ml)rt-PA，采用高效液相色譜儀(色譜柱Welch-C18)繪制rt-PA標(biāo)準(zhǔn)曲線，以有機(jī)溶劑二甲基亞砜破壞納米粒后再次檢測(cè)并分析rt-PA含量。rt-PA包封率=rt-PA實(shí)際含量/rt-PA投入量×100%。加入不同含量(0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg)Fe3O4制備CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米溶液，離心取上清，采用有機(jī)溶劑二甲亞砜破壞上清液成分后以電感耦合等離子質(zhì)譜檢測(cè)上清液Fe3O4含量。Fe3O4包封率(%)=(Fe3O4投入量－上清液Fe3O4含量)/Fe3O4投入量×100%。將CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒凍干，采用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)分析其磁學(xué)性能。

1.6 體外光熱效應(yīng)測(cè)定 將CREKA-Fe-rt-PA-Gel按不同濃度(1.0、2.0、4.0、8.0 mg/ml)分為4組，并設(shè)置0.9%氯化鈉注射液作為空白對(duì)照組；每組取200 μl分別置于96孔板中，采用808 nm激光(2.0 W/cm2)輻照20 min。相同濃度 CREKA-Fe-rt-PAGel(4 mg/ml)分別經(jīng)808 nm激光(1.0、1.5、2.0 W/cm)輻照20 min。以熱成像儀檢測(cè)各組溫度變化。為探究該納米粒的穩(wěn)定性，以固定濃度(4.0 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel為研究對(duì)象，經(jīng)808 nm激光(2.0 W/cm2)輻照5 min，停止激光輻照，溫度降至室溫后繼續(xù)前面的輻照流程并循環(huán)5個(gè)周期。各組納米粒輻照過(guò)程均采用成像儀監(jiān)控記錄溫度變化情況。

1.7 體外雙模態(tài)顯像

1.7.1 體外PA顯像 制備瓊脂糖凝膠模型，將不同濃度(0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.250、1.500 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel溶液各200 μl 加入凝膠模型中，使用光聲成像儀以一定波長(zhǎng)(680～970 nm)輻照各組納米粒溶液，采集相應(yīng)的光聲圖像，并利用儀器自帶后處理軟件測(cè)量最強(qiáng)信號(hào)處的波長(zhǎng)。

1.7.2 體外MR顯像 將不同濃度(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel溶液各1.5 ml加入微型離心管中，使用3.0 T MRI采集T2加權(quán)像(T2WI)，利用后處理軟件測(cè)得圖像的R2(1/T2)值。同時(shí)采集偽彩圖，并獲取相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度。

1.8 體外安全性試驗(yàn)

1.8.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 以含1%雙抗、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育HUVEC細(xì)胞。將HUVEC細(xì)胞置于96孔板中，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)融合面積達(dá)到50%左右時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，分別加入不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel孵育24 h，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，每孔加入100 μl含10%CCK-8的新鮮培養(yǎng)基孵育1 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A450，每組測(cè)量5次。

1.8.2 溶血試驗(yàn) 在輕度麻醉下從昆明小鼠眼眶收集血液樣本。通過(guò)離心(3000 r/min，15 min，4 ℃)獲得紅細(xì)胞，并用PBS(pH=7.4)清洗3次，直到上清液變成無(wú)色；將獲得的紅細(xì)胞沉淀稀釋10倍；分別將0.5 ml rt-PA、Gel-rt-PA、Gel-rt-PA-Fe、CREKA-Fert-PA-Gel 與0.5 ml紅細(xì)胞混合作為實(shí)驗(yàn)組，0.5 ml去離子水與0.5 ml紅細(xì)胞混合作為陽(yáng)性對(duì)照組，0.5 ml PBS與0.5 ml紅細(xì)胞混合作為陰性對(duì)照組。所有樣品在37 ℃孵育4 h，3000 r/min離心15 min獲取上清液。使用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定上清液的吸光度。溶血率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組－A陰性對(duì)照組)/(A陽(yáng)性對(duì)照組－A陰性對(duì)照組)×100%。

1.9 體外溶栓效果評(píng)估

1.9.1 體外溶栓試驗(yàn) 在輕度麻醉下用1.5 ml微型離心管從昆明小鼠眼眶收集多個(gè)0.5 ml血液樣本，4 ℃放置24 h形成凝塊，PBS清洗3次，分別設(shè)置NIR組、rt-PA(0.04 mg/ml)組、Gel-rt-PA+NIR組、Gelrt-PA-Fe+NIR組、CREKA-Fe-rt-PA-Gel+NIR組，將血凝塊與上述各組溶液(4 mg/ml)孵育3 h，激光輻照(2 W/cm2，20 min)處理后取溶液3000 r/min離心15 min，使用酶標(biāo)儀分別在540 nm及450 nm處測(cè)定上清液吸光度，作為血紅蛋白和纖維蛋白的含量指標(biāo)來(lái)評(píng)估溶栓效果。

1.9.2 FITC標(biāo)記的纖維蛋白凝塊試驗(yàn) 將25 U/ml凝血酶和2.5 mmol氯化鈣加入含有5 mg/ml FITC標(biāo)記的纖維蛋白原(200 μl)溶液中，37 ℃孵育1 h，誘導(dǎo)FITC標(biāo)記的纖維蛋白凝塊；將纖維蛋白凝塊與CREKA-Fe-rt-PA-Gel孵育1 h，并進(jìn)一步用808 nm激光(2 W/cm2，5 min)照射，設(shè)置對(duì)照組、CREKAFe-rt-PA-Gel組、NIR組、CREKA-Fe-rt-PA-Gel+NIR組，采用CLSM評(píng)估各組纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的損傷程度。

1.10 體內(nèi)靶向性能觀察 分離SD大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈，以寬度為0.5 cm的濾紙蘸取10% FeCl3分別包裹左側(cè)頸總動(dòng)脈15 min及10 min，構(gòu)建完全栓塞和部分栓塞的血栓模型，使用0.9%氯化鈉注射液沖洗殘余FeCl3。為觀察納米粒在體內(nèi)血栓上的分布，建立血栓模型1 h后，分別將1 ml濃度為 5 mg/ml DiI標(biāo)記的納米粒(CREKA-Fe-rt-PA-Gel、Fe-rt-PA-Gel)經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)，1 h后在深度麻醉下處死，取頸動(dòng)脈，制備厚度為 10 μm的切片并進(jìn)行HE染色。在光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察兩組(Fe-rt-PAGel組和CREKA-Fe-rt-PA-Gel組)納米粒在血栓中的分布情況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 GraphPad 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CREKA-Fe-rt-PA-Gel的基本特征 構(gòu)建的CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒(圖1A)在透射電鏡下呈大小均一的圓形(圖1B)，粒徑(254.79±6.83) nm，電位(5.48±4.60) mV(圖1C)，多分散系數(shù)(0.09±0.05)。激光共聚焦觀察顯示FITC標(biāo)記的CREKA多肽成功連接在DiI標(biāo)記的Fe-rt-PA-Gel上(圖1D)，流式分析顯示連靶率為98.66%(圖1E)。高效液相色譜法計(jì)算的藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=37887x+327636，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到rt-PA的包封率為23.03%±0.05%(圖1F)；電感耦合等離子質(zhì)譜檢測(cè)顯示，隨著投入Fe3O4含量的增加，納米粒中Fe3O4實(shí)際含量也隨之增加，計(jì)算得出Fe3O4包封率為92.78%±0.57%(圖1G)；磁滯回線顯示CREKA-Fe-rt-PA-Gel沒(méi)有明顯的剩余磁化強(qiáng)度，為順磁性(圖1H)。

圖1 CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的基本特征Fig.1 Basic characterization of the nanoparticles (CREKA-Fe-rt-PA-Gel)

2.2 體外光熱效應(yīng) 激光輻照不同濃度CREKA-Fert-PA-Gel，10 min時(shí)溫度上升趨于平穩(wěn)，隨著納米粒溶液濃度升高和輻照時(shí)間延長(zhǎng)，溫度上升更加明顯，光熱效能表現(xiàn)出顯著的濃度依賴性和時(shí)間依賴性，而對(duì)照組溫度未見明顯上升(圖2A)。不同強(qiáng)度的激光輻照CREKA-Fe-rt-PA-Gel，激光強(qiáng)度越高，輻照時(shí)間越長(zhǎng)，溫度上升越明顯(圖2B)。在5個(gè)循環(huán)光熱輻照下，CREKA-Fe-rt-PA-Gel表現(xiàn)出較好的光熱穩(wěn)定性(圖2C)。為了避免溫度過(guò)高對(duì)組織的損傷，選擇CREKA-Fe-rt-PA-Gel濃度4 mg/ml、激光強(qiáng)度2 W/cm2、輻照時(shí)間20 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 體外雙模態(tài)顯像 PA顯像顯示CREKA-Fe-rt-PA-Gel在690 nm處的PA信號(hào)最強(qiáng)，與Fe3O4的PA吸收峰一致；在此波長(zhǎng)下PA信號(hào)隨濃度增加逐漸增強(qiáng)，呈線性改變(圖2D)。MR顯像顯示CREKA-Fert-PA-Gel具有T2加權(quán)成像能力，且隨著CREKA-Fert-PA-Gel濃度增加T2信號(hào)逐漸減弱，呈線性相關(guān)(圖2E)。MR偽彩圖顯示其信號(hào)強(qiáng)度均勻(圖2F)。

圖2 CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的體外光熱效應(yīng)及雙模態(tài)成像Fig.2 Photothermal effect and dual-mode imaging of the nanoparticles (CREKA-Fe-rt-PA-Gel) in vitro

2.4 細(xì)胞毒性及溶血反應(yīng) CCK-8法檢測(cè)顯示，HUVEC與不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel孵育24 h后，細(xì)胞的存活率均＞90% (圖3A)，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.748，P＞0.05)。溶血反應(yīng)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組溶血率均遠(yuǎn)低于上限(5%)；同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象(圖3B)。

2.5 體外溶栓試驗(yàn) 將血凝塊分別與Gel-Fe、Gel-rt-PA-Fe、CREKA-Fe-rt-PA-Gel共培養(yǎng)并用NIR激光輻照。與NIR組相比，r t-PA組溶液中的纖維蛋白和血紅蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與NIR組(0.084±0.005)及rt-PA組(0.112±0.005)相比，Gel-rt-PA組(1.176±0.062)、Gel-rt-PA-Fe組(1.510±0.046)、CREKA-Fe-rt-PA-Gel組(2.226±0.047)纖維蛋白含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。此外，與NIR組(0.075±0.005)及rt-PA組(0.100±0.009)相比，Gel-rt-PA組(0.702±0.123)、Gel-rt-PAFe組(0.949±0.027)、CREKA-Fe-rt-PA-Gel組(1.459±0.021)血紅蛋白含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。CREKA-Fe-rt-PA-Gel組纖維蛋白和血紅蛋白含量均為最高(圖3C)。

2.6 FITC標(biāo)記的纖維蛋白凝塊試驗(yàn) 將纖維蛋白與CREKA-Fe-rt-PA-Gel共培養(yǎng)并用NIR激光輻照5 min后，與未經(jīng)任何處理的綠色熒光(FITC)標(biāo)記的纖維蛋白相比，CREKA-Fe-rt-PA-Gel組及NIR組纖維蛋白結(jié)構(gòu)未見明顯改變，而CREKA-Fe-rt-PAGel+NIR組纖維蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大量塌陷的骨架和小片(圖3D)。

圖3 CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的體外生物安全性及溶栓試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Fig.3 Biosafety and thrombolysis test of the nanoparticles (CREKA-Fe-rt-PA-Gel) in vitro (n=3)

2.7 體內(nèi)靶向性能 成功構(gòu)建大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈血栓模型(圖4A)。在光學(xué)顯微鏡下可見正常血管管腔無(wú)填充，其血管壁可見深染的細(xì)胞核；完全栓塞血管管腔可見均勻一致的顏色，其血管壁可見深染的細(xì)胞核(圖4B)。為了避免血管壁中細(xì)胞核HE染色對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，選擇部分栓塞的血管進(jìn)行靶向性研究，在光學(xué)顯微鏡下，F(xiàn)e-rt-PA-Gel組血栓中僅可以見部分納米粒，而CREKA-Fe-rt-PA-Gel組血栓中可見更多的納米粒分布(圖4B)。

圖4 大鼠頸總動(dòng)脈血栓模型及CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的體內(nèi)靶向性試驗(yàn) (n=3)Fig.4 Thrombus model in common carotid artery of rats and test of targeting ability of the nanoparticles (CREKA-Fe-rt-PA-Gel)in vivo (n=3)

3 討 論

為了解決臨床血栓性疾病治療的不足，本研究引入了納米藥物遞送系統(tǒng)，旨在利用其靶向運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)實(shí)現(xiàn)纖溶藥物的精準(zhǔn)輸送，并聯(lián)合光熱療法(PTT)，以增強(qiáng)藥物溶栓的效果。當(dāng)前臨床常規(guī)藥物溶栓治療存在以下不足：(1)纖溶藥物的作用缺乏纖維蛋白特異性，在溶解病理性血栓纖維蛋白的同時(shí)也會(huì)溶解生理性纖維蛋白，甚至導(dǎo)致高出血風(fēng)險(xiǎn)(例如，鏈激酶SK在活動(dòng)性出血3個(gè)月內(nèi)禁用)；(2)藥物循環(huán)壽命較短[例如，組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的半衰期僅為2～6 min]，在血液循環(huán)中的快速清除和酶降解高度限制了治療窗口[8-10]；(3)單一的藥物溶栓聯(lián)合外科輔助治療造成了高成本、高風(fēng)險(xiǎn)，需要復(fù)雜的臨床風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控。

PTT由于其對(duì)腫瘤組織的熱消融作用已經(jīng)成功地用于部分腫瘤的治療，作為腫瘤替代療法具有較好的臨床應(yīng)用前景[11-12]?；谀壳芭R床血栓性疾病治療的局限性，有研究者提出了光熱溶栓的輔助治療方法[13]。利用光吸收劑在NIR輻射下使局部溫度升高，從而破壞血凝塊的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，達(dá)到溶栓效果[14]。借助納米藥物遞送系統(tǒng)的精確性和可忽略的侵入性，本研究構(gòu)想的光熱增效溶栓策略有望進(jìn)一步改善臨床血栓性疾病的治療效果。

由于Fe3O4在NIR區(qū)具有較強(qiáng)的吸收峰，不僅可以利用分子影像學(xué)的優(yōu)勢(shì)作為磁性造影劑進(jìn)行PA[15]，而且可以利用朗道阻尼效應(yīng)將光能快速轉(zhuǎn)化為熱能進(jìn)行PTT治療。同時(shí)，F(xiàn)e3O4固有的順磁性不僅能實(shí)現(xiàn)MR顯像，還有望被外置磁體吸附而進(jìn)一步用于磁導(dǎo)航溶栓治療。本研究利用Fe3O4的這些性能構(gòu)建的磁性CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒，其粒徑為(254.79±6.83) nm，多分散系數(shù)為(0.09±0.05)，大小均一、分散性良好，此外，其連靶率及Fe3O4包封率高，光熱效能表現(xiàn)出明顯的輻照強(qiáng)度依賴性和時(shí)間依賴性，在5個(gè)循環(huán)光熱輻照下具有明顯的光熱穩(wěn)定性，激光強(qiáng)度越高，輻照時(shí)間越長(zhǎng)，溫度上升越明顯。良好的光熱能力為其用于血栓治療奠定了基礎(chǔ)。PA顯像顯示，CREKAFe-rt-PA-Gel在690 nm處的PA信號(hào)最強(qiáng)，與Fe3O4的PA吸收峰一致，提示CREKA-Fe-rt-PA-Gel沒(méi)有改變Fe3O4本身的性質(zhì)；MR顯像顯示其具有T2加權(quán)成像能力，MR偽彩圖顯示其信號(hào)強(qiáng)度均勻。體外成像試驗(yàn)顯示，CREKA-Fe-rt-PA-Gel具有良好的PA/MR雙模態(tài)成像潛能，有望作為分子影像的造影劑。

本研究細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，HUVEC細(xì)胞與不同濃度的CREKA-Fe-rt-PA-Gel孵育24 h后，細(xì)胞存活率均＞90%，提示CREKA-Fe-rt-PA-Gel對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。溶血反應(yīng)結(jié)果顯示，與PBS組(陰性組)比較，各組納米粒的溶血率均遠(yuǎn)低于上限(5%)，而陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象，提示CREKA-Fe-rt-PAGel具有良好的生物安全性和血液相容性，可用于體內(nèi)研究。

本研究體外溶栓試驗(yàn)中，血凝塊與Gel-rt-PA、Gel-rt-PA-Fe、CREKA-Fe-rt-PA-Gel共培養(yǎng)并用NIR激光輻照后，Gel-rt-PA、Gel-rt-PA-Fe、CREKA-Fert-PA-Gel組纖維蛋白和血紅蛋白含量明顯高于NIR組及rt-PA組，且CREKA-Fe-rt-PA-Gel組含量最高，提示該磁性載藥納米遞送系統(tǒng)聯(lián)合光熱增效具有較強(qiáng)的溶栓能力。更為重要的是，將纖維蛋白與CREKA-Fe-rt-PA-Gel共培養(yǎng)并用NIR激光輻照5 min后，與未經(jīng)任何處理的綠色熒光(FITC)標(biāo)記的纖維蛋白相比，單純CREKA-Fe-rt-PA-Gel組和NIR組纖維蛋白結(jié)構(gòu)未見明顯改變，而CREKA-Fe-rt-PAGel+NIR組纖維蛋白出現(xiàn)大量塌陷的骨架和小片，直觀地顯示了光熱增效溶栓的機(jī)制為破壞血栓中致密的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，提示CREKA-Fe-rt-PA-Gel聯(lián)合光熱作用能夠破壞纖維蛋白骨架。相比傳統(tǒng)的單純藥物溶栓，納米粒聯(lián)合PTT實(shí)現(xiàn)了更強(qiáng)的溶栓效果，這為臨床血栓性疾病的治療提供了新的選擇。光熱增效溶栓的機(jī)制在于單純的CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米?；騈IR并不能損傷血栓纖維蛋白，但納米粒聯(lián)合NIR產(chǎn)生光熱效應(yīng)時(shí)卻能毀損血栓中致密的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。究其原因，可能是光熱使纖維蛋白發(fā)生熱損傷而使其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞。另外，納米粒在修飾了CREKA多肽后，可增強(qiáng)其體內(nèi)應(yīng)用的靶向性，有助于增強(qiáng)后續(xù)體內(nèi)治療的效果，而且有可能減輕藥物溶栓造成出血并發(fā)癥的弊端。但本研究未對(duì)血栓體內(nèi)多模態(tài)成像與體內(nèi)溶栓治療效能進(jìn)行深入探討；Fe3O4作為光吸收劑具有較好的應(yīng)用前景，但在光熱治療過(guò)程中，可能損傷相鄰組織結(jié)構(gòu)，其達(dá)到最大安全治療效果的臨界溫度尚待進(jìn)一步探究，這也是今后的研究方向。

總之，本研究構(gòu)建了靶向診療一體化的載rt-PA磁性明膠納米粒——CREKA-Fe-rt-PA-Gel，其血液相容性較好，可用于PA/MR雙模態(tài)顯像，具有良好的光熱性能；CREKA-Fe-rt-PA-Gel聯(lián)合光熱治療具備較強(qiáng)的溶栓效果。目前關(guān)于光熱溶栓的研究尚處于初級(jí)階段，值得進(jìn)一步深入探討。