維替泊芬在實(shí)驗(yàn)性哮喘氣道重塑中的作用及其機(jī)制

劉敏，王藝穎，簡鼎，李媛媛，張光莉，羅征秀

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，其特征為可逆性氣流受限及氣道高反應(yīng)性[1-2]。全球約有3.58億哮喘患者[3]，我國成年哮喘患者多達(dá)4570萬[4]，哮喘已成為全球性的重大公共衛(wèi)生問題。氣道重塑不同程度地參與了哮喘的疾病進(jìn)程，是哮喘出現(xiàn)不可逆氣流受限、激素敏感性降低、病情持續(xù)加重的關(guān)鍵因素，其病理特點(diǎn)為氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cell，ASMC)增生肥厚，且增生程度越重病情越嚴(yán)重[5-7]。Hippo/Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)通路可通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。研究證實(shí)，血管平滑肌細(xì)胞中Hippo/YAP通路的活性受到抑制可使下游分子YAP磷酸化水平降低，YAP轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(TEA domain transcription factor，TEAD)結(jié)合并激活下游靶基因，引發(fā)一系列心血管疾病[8-10]。維替泊芬(verteporfin，Vp)是治療新生血管黃斑變性的藥物，近年來發(fā)現(xiàn)其可通過改變YAP的空間構(gòu)象而抑制YAP與TEAD的結(jié)合，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的過度增殖[11]。ASMC與血管平滑肌細(xì)胞具有高度同源性，而Vp在哮喘氣道重塑中的作用尚不清楚。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討Vp在實(shí)驗(yàn)性哮喘氣道重塑中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 屋塵螨提取液(house dust mite，HDM)購自美國Geerlabs公司；Vp購自上海茁彩生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒購自合肥博美生物科技有限公司；兔抗人YAP、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain，SMMHC)多克隆抗體購自武漢Servicebio公司；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)購自上海Abcam公司；CCK-8檢測試劑盒購自中國Biosharp公司；Annexin V-APC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀購自美國ThermoFisher公司。

1.2 動物實(shí)驗(yàn) 6～8周齡SPF級BALB/c雌性小鼠12只，體重18～22 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(川)2015-030；使用許可證號：SYXK(川)2014-189]。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院動物倫理委員會審批，實(shí)驗(yàn)過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物管理及使用的規(guī)定。

1.2.1 哮喘模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將12只雌性BALB/c小鼠分為對照組、實(shí)驗(yàn)性哮喘組與Vp干預(yù)組，每組4只。

實(shí)驗(yàn)性哮喘組每周給予HDM液(0.67 g/L，30 μl)滴鼻致敏1次，持續(xù)3周，從第23天開始，間隔1 d給予同劑量HDM滴鼻激發(fā)，直至第33天，每次激發(fā)前30 min腹腔注射100 μl生理鹽水[12-14]。Vp干預(yù)組建模方式同實(shí)驗(yàn)性哮喘組，每次激發(fā)前30 min腹腔注射Vp溶液100 μl(10 mg/ml)[15]。對照組給予等量生理鹽水進(jìn)行滴鼻致敏及腹腔注射干預(yù)。飼養(yǎng)過程中觀察小鼠一般情況，如毛發(fā)、呼吸頻率、活動情況等，最終采集小鼠肺組織及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進(jìn)行后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)性哮喘小鼠模型建立方法如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)性哮喘小鼠模型建立方法Fig.1 Establishment of experimental asthma mice model

1.2.2 HE染色觀察肺組織病理變化 肺組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后，脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精染色20 min，水洗后伊紅染色5 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察，并測量氣道平滑肌厚度、支氣管基底膜厚度及支氣管管壁厚度。氣道平滑肌厚度(μm)=支氣管平滑肌面積(μm2)/管腔基底膜周長(μm)；支氣管管壁厚度(μm)=支氣管管壁總面積(μm2)/管腔基底膜周長(μm)[16]。

1.2.3 瑞氏-吉姆薩染色計數(shù)BLAF中的炎性細(xì)胞取10 μl BALF計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，剩余BALF以1000 r/min高速離心后涂片，自然干燥后用瑞氏-吉姆薩染液染色2 min，滴加等量磷酸鹽緩沖液與瑞氏-吉姆薩染液混勻并染色3 min，流水沖洗后封片鏡檢。

1.2.4 Masson染色觀察肺組織膠原纖維沉積情況肺組織切片脫蠟后使用Bouin液媒染，然后用天青石藍(lán)和蘇木精滴染3 min、麗春紅品紅滴染10 min、苯胺藍(lán)滴染5 min，梯度乙醇脫水后二甲苯透明，最后封片鏡檢。

1.2.5 過碘酸希夫(Periodic Acid-Schiff，PAS)染色觀察肺組織杯狀細(xì)胞增生情況 肺組織切片經(jīng)脫蠟、水洗后，使用高碘酸氧化液氧化10 min，蒸餾水洗后用Schiff液染色10 min，蘇木精復(fù)染2 min，乙醇分化后經(jīng)二甲苯透明，最后封片鏡檢。采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件測定PAS陽性染色面積(400倍視野)。

1.2.6 免疫組化檢測肺組織中YAP、磷酸化YAP(p-YAP)的表達(dá) 肺組織切片經(jīng)脫蠟后于檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行加熱，用磷酸鹽緩沖液沖洗后放入3%H2O2中浸泡10 min，滴加山羊血清封閉液，分別加入一抗、二抗，DAB染液室溫顯色，陽性為棕黃色，蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染3 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片鏡檢。

1.2.7 RT-PCR檢測肺組織中YAP、OPN、SMMHCm R N A 的表達(dá) 將小鼠肺組織標(biāo)本剪碎，每50～100 mg肺組織加入1 ml Trizol和0.2 ml氯仿，劇烈振蕩后12 000 r/min離心15 min提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列如表1所示。反應(yīng)體系：2×Real PCR EasyTMMix-SYBR 10 μl，上、下游引物各0.8 μl，模板DNA 2 μl，加入ddH2O至20 μl。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)45次。使用Thermo Scientific PikoReal軟件進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt法計算YAP、OPN、SMMHCmRNA的相對表達(dá)水平。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

1.2.8 Western blotting檢測肺組織中YAP、p-YAP、OPN、SMMHC蛋白的表達(dá) 用RIPA液冰上裂解肺組織10 min，然后12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗(兔抗人YAP、p-YAP、OPN、SMMHC、β-actin抗體稀釋倍數(shù)分別為1:1000、1:2000、1:1000、1:1000、1:100 000)孵育過夜；洗滌3次，加入二抗(1:5000)孵育3 h；洗滌3次，加入ECL發(fā)光液顯色，曝光顯影后，以β-actin為內(nèi)參，采用圖像分析軟件分析YAP、p-YAP、OPN、SMMHC蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 人氣道平滑肌細(xì)胞(human airway smooth muscle cell，HASMC)購自湖南豐暉生物科技有限公司，37 ℃復(fù)蘇后，于RPMI 1640培養(yǎng)基中在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用PBS洗滌、離心后，接種于96孔板中(100 μl/孔)，于37 ℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)。設(shè)置對照組、HDM組與不同濃度(0.025、0.05、0.08、0.10 mg/L)Vp+HDM組。不同濃度Vp+HDM組細(xì)胞用0.025、0.05、0.08、0.10 mg/L Vp刺激2 h后，再加入50 μg/ml HDM作用24 h；HDM組細(xì)胞以等量生理鹽水代替Vp，采用與Vp+HDM組相同的培養(yǎng)方法；對照組細(xì)胞以等量生理鹽水代替Vp和HDM。每孔加入10 μl CCK-8液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm波長處每孔的吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。選取Vp發(fā)揮有效抑制能力的最低濃度(0.05 mg/L)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.05 mg/L Vp作用9 h、12 h、24 h后，采用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm波長處每孔的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。選取0.05 mg/L Vp作用細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，設(shè)置對照組、HDM組與HDM+Vp組。HDM+Vp組細(xì)胞用0.05 mg/L Vp刺激2 h后，加入50 μg/ml HDM作用24 h；HDM組細(xì)胞以等量生理鹽水代替Vp，采用與HDM+Vp組相同的培養(yǎng)方法；對照組細(xì)胞以等量生理鹽水代替Vp和HDM。取上清液，PBS洗滌細(xì)胞并離心，棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 Western blotting檢測YAP、OPN、SMMHC蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，設(shè)置對照組、HDM組與HDM+Vp組，各組處理方法同1.3.2。采用Western blotting檢測各組細(xì)胞中YAP、OPN、SMMHC蛋白的相對表達(dá)水平，操作步驟同1.2.8。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較若方差齊則采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況及氣道炎癥比較 對照組小鼠毛發(fā)光亮，呼吸及活動良好，肺組織HE染色未見炎性細(xì)胞浸潤；實(shí)驗(yàn)性哮喘組小鼠呼吸頻率加快、毛發(fā)豎立、口唇發(fā)紺、四肢乏力、活動減少，肺組織HE染色顯示支氣管腔、肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤；Vp干預(yù)組小鼠的癥狀介于上述兩組之間，肺組織HE染色可見炎性細(xì)胞明顯減少(圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織病理變化(HE染色)Fig.2 Pathological changes of lung tissues of mice in each group (HE staining)

瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)性哮喘組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例明顯高于對照組，巨噬細(xì)胞比例明顯低于對照組(P＜0.05)，與實(shí)驗(yàn)性哮喘組比較，Vp干預(yù)后小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯降低，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞比例明顯升高(P＜0.05)；與對照組比較，Vp干預(yù)后小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例明顯升高(P＜0.05)(表2)。

表2 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞計數(shù)比較(±s, n=4)Tab.2 Comparison of the number of inflammatory cells in BALF of mice in each group (±s, n=4)

表2 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞計數(shù)比較(±s, n=4)Tab.2 Comparison of the number of inflammatory cells in BALF of mice in each group (±s, n=4)

BALF. 支氣管肺泡灌洗液；Vp. 維替泊芬；與對照組比較，(1)P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)性哮喘組比較，(2)P＜0.05

組別 細(xì)胞總數(shù)(×108/ml) 嗜酸性粒細(xì)胞比例(%) 中性粒細(xì)胞比例(%) 淋巴細(xì)胞比例(%) 巨噬細(xì)胞比例(%)對照組 3.75±2.06 2.95±2.45 1.75±1.26 5.50±0.58 89.25±2.21實(shí)驗(yàn)性哮喘組 11.50±2.08(1) 19.59±9.06(1) 5.01±1.82(1) 9.25±1.71(1) 64.25±4.43(1)Vp干預(yù)組 7.75±3.20(2) 8.98±0.43(1)(2) 8.15±1.63(1)(2) 8.57±2.58 71.75±11.21(2)

2.2 各組小鼠氣道結(jié)構(gòu)變化情況 HE、Masson和PAS染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)性哮喘組小鼠支氣管基底膜厚度、氣道平滑肌厚度、支氣管管壁厚度及肺組織膠原纖維沉積面積、PAS染色陽性面積明顯高于對照組[(1.13±0.38) μmvs. (0.79±0.36) μm，P＜0.05；(6.49±2.36) μmvs. (4.56±1.52) μm，P＜0.05；(33.85±5.95) μmvs. (22.08±3.30) μm，P＜0.05；5.85%±2.35%vs. 0.36%±0.12%，P＜0.01；28.81%±5.89%vs. 13.57%±2.08%，P＜0.01]；Vp干預(yù)后上述指標(biāo)明顯降低[分別為(0.93±0.27) μm、(4.9 9±1.7 5) μ m、(2 6.5 9±2.7 6) μ m、2.14%±0.89%、17.92%±1.89%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與對照組比較，Vp干預(yù)后小鼠支氣管基底膜厚度、支氣管管壁厚度明顯增加(P＜0.05)，其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3－5)。

圖5 各組小鼠肺組織PAS染色陽性面積比較(PAS染色，×400)Fig.5 Comparison of PAS staining positive areas in lung tissues of mice in each group (PAS staining ×400)

2.3 各組小鼠肺組織中YAP、p-YAP蛋白表達(dá)情況比較 免疫組化檢測顯示，對照組小鼠肺組織中YAP表達(dá)較低；實(shí)驗(yàn)性哮喘組細(xì)胞核呈深棕黃色，提示細(xì)胞核內(nèi)YAP蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)；而Vp干預(yù)后棕黃色染色較實(shí)驗(yàn)性哮喘組明顯減少，與對照組相近，提示Vp干預(yù)后YAP蛋白呈弱陽性表達(dá)，且大部分位于細(xì)胞質(zhì)，YAP蛋白核移位明顯減少(圖6)。對照組p-YAP表達(dá)較高；實(shí)驗(yàn)性哮喘組棕黃色染色減少，提示p-YAP蛋白表達(dá)降低；而Vp干預(yù)后棕黃色繼續(xù)減少，提示p-YAP蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(圖6)。

圖6 各組小鼠肺組織中YAP、p-YAP蛋白表達(dá)情況比較(免疫組化染色，×400)Fig.6 Comparison of the expressions of YAP and p-YAP protein in lung tissue of mice in each group (Immunohistochemistry staining ×400)

2.4 各組小鼠肺組織中YAP、p-YAP、OPN、SMMHC表達(dá)情況比較 RT-PCR及Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)性哮喘組YAPmRNA(2.27±0.55vs. 1.01±0.09)和蛋白(2.37±0.06vs. 1.01±0.07)以及OPNmRNA(2.17±0.43vs.1.04±0.36)和蛋白(3.64±0.63vs. 1.73±0.76)表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05或P＜0.01)，S M M HCmRNA(1.06±0.46vs. 2.86±0.68)和蛋白(0.92±0.15v s. 2.1 6±0.2 6)表達(dá)水平明顯降低(P＜0.0 5 或P＜0.01)；而Vp干預(yù)后YAPmRNA(1.15±0.34)和蛋白(1.14±0.08)以及OPNmRNA(1.28±0.34)和蛋白(2.16±0.78)表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，SMMHCmRNA(1.91±0.68)和蛋白(1.69±0.27)表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)；而Vp干預(yù)組與對照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖7－8)。

圖7 各組小鼠肺組織中YAP、OPN、SMMHC mRNA表達(dá)水平比較Fig.7 Comparison of the mRNA expression levels of YAP, OPN and SMMHC in lung tissue of mice in each group

與對照組比較，實(shí)驗(yàn)性哮喘組p-YAP/YAP比值明顯降低(0.60±0.10vs. 1.80±0.07，P＜0.01)，而Vp干預(yù)后p-YAP/YAP比值(1.21±0.07)明顯升高(P＜0.05)；而Vp干預(yù)組與對照組p-YAP/YAP比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖8)。

圖8 各組小鼠肺組織中YAP、p-YAP、OPN、SMMHC蛋白表達(dá)水平比較Fig.8 Comparison of the protein expression levels of YAP, p-YAP, OPN and SMMHC in lung tissue of mice in each group

2.5 Vp對HASMC細(xì)胞增殖能力的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HDM組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(0.2874±0.0055vs. 0.2626±0.0051，P＜0.01)；與HDM組比較，0.05、0.08、0.10 mg/L Vp干預(yù)后細(xì)胞增殖能力減弱(0.2748±0.0043、0.2627±0.0037、0.2519±0.0048，P＜0.05或P＜0.0 1)，且呈濃度依賴性；與對照組比較，0.025 mg/L Vp+HDM組、0.05 mg/L Vp+HDM組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，0.10 mg/L Vp+HDM組細(xì)胞增殖能力減弱(P＜0.05或P＜0.01)(圖9A)。據(jù)此選擇Vp發(fā)揮有效抑制能力的最低濃度0.05 mg/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用0.05 mg/L Vp作用12 h后細(xì)胞增殖能力明顯減弱(0.2748±0.0043vs. 0.2874±0.0055，P＜0.05)，作用24 h對細(xì)胞增殖能力的抑制作用最強(qiáng)(0.4273±0.0087vs. 0.4811±0.0046，P＜0.01)(圖9B)。據(jù)此選擇0.05 mg/L Vp作用細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖9 CCK-8法檢測Vp對HASMC細(xì)胞增殖能力的影響Fig.9 Effect of Vp on the proliferation ability of HASMC cells detected by CCK-8 method

2.6 各組HASMC細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HDM組細(xì)胞凋亡率明顯降低(5.14%±0.82%vs. 6.75%±0.21%，P＜0.05)；與HDM組比較，HDM+Vp組細(xì)胞凋亡率明顯增高(6.29%±0.49%，P＜0.05)；而對照組與HDM+Vp組與對照組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖10)。

圖10 各組HASMC細(xì)胞凋亡率比較Fig.10 Comparison of the apoptosis rate of HASMC cells in each group

2.7 各組HASMC細(xì)胞中YAP、OPN、SMMHC蛋白相對表達(dá)量比較 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HDM組細(xì)胞中YAP、OPN蛋白相對表達(dá)量明顯升高(3.14±0.48vs. 1.51±0.61，P＜0.01；5.87±2.42vs. 0.94±0.23，P＜0.01)，SMMHC蛋白相對表達(dá)量明顯降低(0.80±0.19vs.2.96±0.96，P＜0.01)。與HDM組比較，HDM+Vp組YAP、OPN蛋白相對表達(dá)量明顯降低(2.02±0.53、2.93±1.09，P＜0.05)，SMMHC蛋白相對表達(dá)量明顯升高(2.11±0.85，P＜0.05)；而HDM+Vp組與對照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖11)。

圖11 各組HASMC細(xì)胞中YAP、OPN、SMMHC蛋白相對表達(dá)量比較Fig.11 Comparison of the relative expression levels of YAP, OPN and SMMHC proteins in HASMC cells of each group

3 討 論

哮喘是一種以可逆性氣流受限及氣道高反應(yīng)性為特征的氣道炎癥性疾病[17]。隨著疾病進(jìn)展，氣道組織發(fā)生異常修復(fù)致使結(jié)構(gòu)改變，形成氣道重塑，將可逆性氣流受限變?yōu)椴豢赡?，同時肺功能下降[18]；氣道重塑和肺功能下降可增加哮喘再次發(fā)作的頻率及嚴(yán)重程度，并形成惡性循環(huán)。ASMC增生和肥大是氣道重塑最顯著的病理學(xué)特征[6,19]，可引起氣道壁增厚、氣道平滑肌收縮功能增強(qiáng)，進(jìn)而出現(xiàn)氣管腔狹窄、阻力增大，同時重塑后的平滑肌細(xì)胞對激素等藥物的敏感性下降，最終出現(xiàn)持續(xù)性氣流受限，這也是哮喘病情持續(xù)加重的重要因素。

YAP存在于多種哺乳動物體內(nèi)，具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、促進(jìn)組織器官生長的作用，其過表達(dá)可導(dǎo)致多種疾病甚至形成腫瘤[20-21]。YAP主要受Hippo信號通路的調(diào)控，當(dāng)外界信號刺激細(xì)胞膜上的膜蛋白受體時，通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)使Hippo信號通路核心成員哺乳動物不育系20樣激酶(mammalian sterile 20-like kinases，MST)、大腫瘤抑制因子(large tumor suppressor，LATS)逐級磷酸化，YAP被磷酸化后可轉(zhuǎn)化為失活狀態(tài)的p-YAP，并在細(xì)胞質(zhì)中與蛋白結(jié)合，進(jìn)而被泛素化降解失去生理功能[22-23]。當(dāng)Hippo信號通路被抑制或核心成員缺失時，p-YAP水平降低，YAP水平升高并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活靶基因，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖并誘發(fā)相應(yīng)疾病[24-26]。Vp在臨床上被用于治療黃斑變性，近年來發(fā)現(xiàn)其能改變YAP的空間構(gòu)象，干擾YAP的核移位及其與TEAD的結(jié)合，從而抑制靶基因的表達(dá)及細(xì)胞增殖[27-28]。Hippo/YAP信號通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[29-31]，但是否參與哮喘的進(jìn)展尚不明確。

本研究采用HDM建立實(shí)驗(yàn)性哮喘小鼠模型，并使用Vp干預(yù)Hippo信號通路的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織發(fā)生明顯炎癥改變，支氣管旁膠原纖維沉積增多，支氣管基底膜、氣道平滑肌及支氣管管壁明顯增厚，提示采用HDM建立的小鼠哮喘模型具有顯著的氣道重塑改變，與其他研究結(jié)果相符[32-33]。本研究動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性哮喘組小鼠肺組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)p-YAP蛋白表達(dá)減少，而細(xì)胞核YAP蛋白表達(dá)增多，提示YAP在哮喘模型細(xì)胞核內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，此外，本研究還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性哮喘組小鼠肺組織的p-YAP/YAP比值下降，提示p-YAP去磷酸化后核移位可能是氣道重塑的發(fā)病機(jī)制之一。而用Vp干預(yù)后，小鼠肺組織炎癥減輕，支氣管旁膠原纖維沉積減少，支氣管基底膜、氣道平滑肌及支氣管管壁明顯變薄，提示Vp可抑制HDM引起的氣道重塑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Vp干預(yù)后細(xì)胞質(zhì)p-YAP蛋白表達(dá)稍降低，細(xì)胞核YAP蛋白表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致p-YAP/YAP比值明顯升高，提示Vp抑制氣道重塑的機(jī)制可能與降低YAP的表達(dá)、減少YAP核移位有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HDM刺激后HASMC的增殖能力增強(qiáng)、凋亡率下降，同時YAP蛋白表達(dá)增加，而Vp干預(yù)可抑制HDM誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增高，YAP蛋白表達(dá)降低，與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

ASMC的表型轉(zhuǎn)化也是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一。正常情況下，ASMC處于收縮表型，可調(diào)控氣道管徑、改善肺通氣功能，其主要表型標(biāo)志物為SMMHC；但在哮喘模型中，ASMC可轉(zhuǎn)化為合成型，分泌多種趨化因子和細(xì)胞因子，參與哮喘的發(fā)病過程，其主要表型標(biāo)志物為OPN。本研究檢測小鼠肺組織及HASMC中YAP、SMMHC、OPN的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Vp對YAP的抑制作用可在一定程度上逆轉(zhuǎn)哮喘ASMC的表型轉(zhuǎn)化，提示YAP可能是ASMC表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，肺組織p-YAP去磷酸化導(dǎo)致YAP核移位增多可能是氣道重塑的重要機(jī)制，而Vp可通過降低YAP的表達(dá)水平、減少YAP核移位、逆轉(zhuǎn)HASMC的表型轉(zhuǎn)化而抑制實(shí)驗(yàn)性哮喘小鼠的氣道重塑。該結(jié)果為哮喘氣道重塑的發(fā)生機(jī)制及治療提供了新的思路和理論依據(jù)，但不足之處在于研究分組未涉及正常小鼠及細(xì)胞+Vp處理組，且僅探討了哮喘氣道重塑過程中YAP、p-YAP表達(dá)的變化，該通路的具體分子機(jī)制尚不明確，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。