海洋源降血壓肽研究進(jìn)展

胡學(xué)佳，戴致遠(yuǎn)，張曉頔，葉 劍

（浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310035）

隨著社會的發(fā)展，焦慮和壓力的與日俱增，高血壓患者人數(shù)呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在2020年非傳染性疾病類別中，高血壓等心血管疾病患病人數(shù)占較大比例，2025年，高血壓人口預(yù)計增加到15.6 億[1]。高血壓是一種常見的慢性醫(yī)學(xué)疾病，主要分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓。原發(fā)性高血壓與遺傳、生活習(xí)慣、環(huán)境以及血管結(jié)構(gòu)等各種復(fù)雜因素相關(guān)[2]。繼發(fā)性高血壓是由腎內(nèi)分泌和心血管功能障礙等引發(fā)的[3]。據(jù)美國心臟病學(xué)會的指南，當(dāng)收縮壓大于140 mm Hg 及舒張壓大于90 mm Hg 時，即高血壓癥狀[4]。當(dāng)血管長期承受過度的壓力泵送血液時，就會導(dǎo)致冠心病、動脈硬化、外周動脈疾病、腎臟疾病和中風(fēng)等高風(fēng)險疾病[5]。

高血壓患者主要通過服用降壓藥物 （包括ACE 抑制劑、利尿劑、β-受體阻滯劑、α-受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、腎上腺素能抑制阻斷劑等）來進(jìn)行治療[6]，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin converting enzyme，ACE） 是調(diào)節(jié)血壓的主要因子，在調(diào)節(jié)哺乳動物的血壓以及鹽平衡和流體中起著重要作用[7]。ACE 抑制劑是治療高血壓的主要藥物（包括卡托普利、福辛普利和賴諾普利3 大類）[8]。這些藥物雖效果顯著，但都伴隨著嚴(yán)重的副作用[9]，如頭痛、快速心率、頭暈、咳嗽、味覺障礙和皮疹等不良癥狀[10]。從天然產(chǎn)物中開發(fā)ACE 抑制劑，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[11]。

海洋占地球表面積的7I%，是世界未來的食品基地，海洋產(chǎn)品更是人類攝取蛋白質(zhì)的主要來源。據(jù)統(tǒng)計，海洋所提供食品的能力是陸地的1 000 倍[12]。海洋物種約占全球生物多樣性總量的一半，由于海洋環(huán)境的特異性和多樣性，導(dǎo)致海洋蛋白不論是一級序列還是其氨基酸組成均與陸地蛋白有所差異。總而言之海洋蛋白成為篩選新型ACE 抑制肽的重要蛋白來源[13]。

1 ACE 抑制肽作用機(jī)制

高血壓病因十分復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為腎素-血管緊張素系統(tǒng) （RAS） 和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）在調(diào)節(jié)血壓方面發(fā)揮著重要作用[14]，在RAS和KKS 系統(tǒng)中，ACE 均起著至關(guān)重要的作用[15]。ACE 抑制肽通過抑制ACE 活性，從而影響ACE在RAS 和KKS 中的調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)過程如圖1所示。在RAS 系統(tǒng)中，人體的腎小球旁器會分泌一種腎素水解酶進(jìn)入血液中，將肝臟分泌的血管緊張素原分解成Ⅰ型血管緊張素[16]，ACE 通過將二肽（HL）從活性極低的Ⅰ型血管緊張素（NRVYIHPFHL）中釋放出來，進(jìn)而降解成活性很強(qiáng)的II 型血管緊張素 （NRVYIHPF），II 型血管緊張素是導(dǎo)致血壓升高的主要物質(zhì)之一，其通過使血管強(qiáng)烈收縮，促進(jìn)醛固酮分泌，進(jìn)而增加外周血管阻力，使Na+和水滯留，導(dǎo)致血壓升高[17]。當(dāng)ACE 抑制肽作用于ACE 時，ACE 無法使血管緊張素I 轉(zhuǎn)化血管緊張素II，使得血壓下降。在KKS 中，舒緩激肽原經(jīng)激肽釋放酶的水解作用，形成舒緩激肽RPPGFSPFR。ACE 催化舒緩激肽，導(dǎo)致其脫去C端的兩個氨基酸殘基而失去活性，造成血壓升高。ACE 抑制肽能有效抑制ACE 的活性，從而阻斷RSA 的升血壓作用，同時有助于KKS 的降壓作用，最終起到治療高血壓疾病的作用。

圖1 ACE 抑制肽的降壓機(jī)制Fig.1 Antihypertensive mechanism of ACE inhibitory peptides

2 ACE 活性抑制肽的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系

ACE 抑制肽是酶抑制劑，其結(jié)構(gòu)直接影響著抑制ACE 的能力。影響ACE 抑制肽活性的主要因素包括分子質(zhì)量、肽鏈長度和氨基酸序列等[18]。大量研究表明，ACE 抑制肽通常為分子質(zhì)量小的短肽。由于短肽容易與ACE 活性位點(diǎn)結(jié)合，且易吸收進(jìn)入血液循環(huán)并保持其活性，因此2～12 個氨基酸短鏈肽的ACE 抑制肽活性更強(qiáng)[19]。涂丹等[20]利用堿性蛋白酶從羅非魚魚鱗中制備ACE 抑制肽，結(jié)果表明活性最高的ACE 抑制肽分子質(zhì)量均分布于300～3 000 u 之間，其抑制率為88.26%。Zhao 等[21]以海參為原料，采用酶解法制備降血壓肽，將酶解產(chǎn)物按分子質(zhì)量分為＜10 ku、＜5 ku 和＜1 ku 3 種類型，其中分子質(zhì)量＜1 ku 的ACE 抑制活性最高，IC50值為35 μmol/L。雖然大部分長鏈肽由于不能和ACE 的活性位點(diǎn)結(jié)合，沒有ACE抑制活性，但晶體學(xué)研究表明，具有螯合鋅原子酸性氨基酸【天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）】的長肽具有ACE 抑制活性，由此可見氨基酸序列組成也尤為重要[22]。研究表明酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和精氨酸的存在對ACE 抑制肽活性有顯著影響[23]。賈俊強(qiáng)等[24]對270 種ACE 抑制肽組成進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表1所示，ACE 抑制肽的抑制活性主要在于N 端或C 端的氨基酸[25]。當(dāng)活性肽的C 端是疏水氨基酸【如Glu、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）】時，抑制活性較強(qiáng)。當(dāng)活性肽N 端是Phe、Tyr、Ala、色氨酸（Trp）、脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly）時，有利于提高活性肽的ACE 抑制活性[26]。另外，大量被證實(shí)具有ACE 抑制活性的肽中至少含有一個Gly 殘基或Pro 殘基[27]。ACE 抑制肽的氨基酸的序列有如下特點(diǎn)：1） 二肽含有大量疏水側(cè)鏈的氨基酸；2） 三肽結(jié)構(gòu)中第1 殘基處是芳香氨基酸，第2 殘基處是正電荷氨基酸，第3 殘基處是疏水氨基酸[28]；3）ACE 抑制四肽的序列的第1位是Tyr 和半胱氨酸 （Cys），第2 位是組氨酸（His）、Trp 和甲硫氨酸（Met），第3 位是異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）和Met，第4 位是Trp，且其抑制作用與C 端氨基酸有關(guān)[29]。

表1 降血壓肽鏈兩端氨基酸性質(zhì)分析表[25]Table 1 Property analysis table of two terminal amino acids of antihypertensive peptides[25]

3 海洋ACE 來源

海洋蛋白源具有很高的生物價值，在人體中發(fā)揮各種保健功能，提高身體健康水平。海洋源降壓肽首次在名為“bekasam”的發(fā)酵魚中被發(fā)現(xiàn)[30]。此后，在魚類、甲殼類、貝類和藻類中發(fā)現(xiàn)了各種降壓肽。表2列出了部分海洋源降壓肽的相關(guān)研究。

表2 海洋源降血壓肽的研究Table 2 Study on antihypertensive peptides derived marine sources

3.1 魚類

魚類是高質(zhì)量蛋白質(zhì)的重要來源。目前，大多數(shù)研究是以魚類蛋白質(zhì)作為抗高壓肽的來源。Yang 等[31]選用木瓜蛋白酶酶解軍曹魚，并采用超濾進(jìn)行分離，制備出降血壓肽，經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)表明，篩選出的降血壓肽顯著降低了原發(fā)性高血壓大鼠的鼠的收縮壓（SBP）。Taheri 等[32]以鮪為研究對象，采用胃蛋白酶水解，超分餾法分離，得到蛋白水解物FPH-I（<1 ku）、FPH-II（1～3 ku）、FPH-III（3～10 ku）和FPH-IV（>10 ku）4 種不同組分，其IC50值在0.45～1.86 mg/mL 之間，F(xiàn)PH-I （IC50為0.45 mg/mL）的活性較高。通過分析這4 種組分的氨基酸分布發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PH-I 組分中有大量的疏水氨基酸，可以作為氫供體并抑制ACE 活性。王晶晶等[33]以遠(yuǎn)東擬沙丁魚肌肉為原料，通過雙酶水解法（動物蛋白水解酶和風(fēng)味蛋白酶）制備其酶解產(chǎn)物，通過超濾膜將其進(jìn)行分離，運(yùn)用色譜法對其進(jìn)一步純化，得到兩種ACE 抑制肽，分別為Val-Glu-Pro-Leu-Pro（IC50為22.9 μmo/L）和Pro-Ala-Leu（IC50為12.2 μmo/L）。Wijesekara 等[34]以海龍魚為原料，利用堿性蛋白酶制備粗肽，經(jīng)多步分離純化得到氨基酸序列為Thr-Phe-Pro-His-Gly-Pro和His-Trp-Thr-Thr-Arg 的兩種多肽。

3.2 甲殼類

甲殼類降血壓肽具有分子質(zhì)量小、易吸收等特點(diǎn)[35]。Cao 等[36]使用胃蛋白酶來水解中國毛蝦，制備出具有ACE 抑制活性的水解物，通過凝膠過濾法（Gel filtration chromatography，GFC）和反相高效液相色譜法（Reverse-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離，得到抑制率為92.7%的肽序列（Leu-His-Pro）。Zhang 等[37]以中國毛蝦為研究對象，經(jīng)水解超濾制備出具有ACE 抑制活性的毛蝦水解液，通過胃腸道消化模擬和動物實(shí)驗(yàn)表明，該水解液具有較強(qiáng)的降壓作用。He 等[38]利用芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶對中國毛蝦進(jìn)行酶解，通過超濾、凝膠滲透層析和反相高效液相色譜分離純化出3 種具有較高ACE 抑制活性的新型肽并對其序列進(jìn)行鑒定，分別為Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro、Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe和Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。

3.3 貝類

海洋貝類以其高產(chǎn)量和高蛋白優(yōu)勢，成為降血壓肽中的研究的熱點(diǎn)[39]。Ou 等[40]以牡蠣為研究對象，利用酸性蛋白酶制備出ACE 抑制率為71.71%的酶解產(chǎn)物。Wu 等[41]利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解鮑魚性腺，通過凝膠過濾柱層析和埃德曼降解法，分離鑒定出ACE 抑制肽Ala-Met-Asn，其分子質(zhì)量小于1 ku，IC50值為106.24 μg/mL。Wang 等[42]對牡蠣中的降血壓肽進(jìn)行研究，經(jīng)過優(yōu)化，選取胃蛋白酶為酶解牡蠣蛋白的最佳蛋白酶，將酶解產(chǎn)物用Sephadex LH-20 凝膠過濾層析和RP-HPLC 進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，從而制備出一種新的降血壓肽 （Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe），對其進(jìn)行ACE 抑制活性檢測，IC50值為66 μmol/L，并且該肽具有良好的熱穩(wěn)定性和pH 值穩(wěn)定性。最后，將經(jīng)胃蛋白酶處理制備的牡蠣水解蛋白以20 mg/kg 的劑量喂食原發(fā)性高血壓大鼠（SHR），結(jié)果表明該肽具有降血壓活性。

3.4 藻類

海洋中藻類植物的產(chǎn)量比小麥總產(chǎn)量多20倍，并且藻類植物中含有豐富的生物活性物質(zhì)，其中降血壓活性肽的研究相對較多[43]。Li 等[44]對海洋小球藻中的降壓肽進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白酶N水解液具有最高的ACE 抑制活性，通過分離提純得到Trp-Val、Val-Trp、Ile-Trp 和Leu-Trp 4 種降壓肽；Barkia 等[45]采用木瓜蛋白酶對微藻的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行酶解，將水解液給原發(fā)性高血壓大鼠口服5 d 后發(fā)現(xiàn)血壓降低17 mm Hg。

3.5 其它海洋原料

根據(jù)以往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，學(xué)者們不僅以常見的海洋生物為研究對象，進(jìn)行了降血壓肽的相關(guān)研究，也對腸腔動物、軟體動物中的降血壓肽進(jìn)行了研究報道。Balti 等[46]以烏賊肌肉為研究對象，并對其進(jìn)行酶解和層析，分離純化出9 種ACE 抑制肽并分別用ESI-MS 和ESI-MS/MS 測定其分子質(zhì)量和氨基酸序列，并通過動物實(shí)驗(yàn)證明其具有明顯的降壓活性。Ikeda 等[47]利用蛋白酶將凍干烏賊進(jìn)行水解制備ACE 抑制肽，并采用Sephadex G-25 凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜進(jìn)行分離純化得到Glu-Lys-Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro，Val-Glu-Leu-Tyr-Pro 和Ala-Phe-Val-Gly-Yyr-Val-Leu-Pro 3種肽，這3 種肽IC50值分別為18.02，5.22 μmol/L和14.41 μmol/L，結(jié)果表明這3 種肽具有較好的降壓活性。

4 抗高血壓肽的分離

生物活性肽是由氨基酸組成，肽鍵連接，具有特定的功能特性，對身體健康有益的特定蛋白質(zhì)片段，例如抗氧化、抗菌、抗糖尿病和免疫調(diào)節(jié)等。從以往的文獻(xiàn)中看，生產(chǎn)降血壓肽的最常用的方法有酶解法、化學(xué)合成法和基因工程法3 種[51]。

4.1 酶解法

酶解法是目前獲得降血壓肽最常用的方法，通過選用合適的酶，在最優(yōu)的反應(yīng)條件下使ACE抑制肽活性片段得以釋放。制備降血壓肽常用的蛋白酶主要包括堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等[52]。不同的酶有不同的酶解條件，其中溫度和pH 值是影響酶解的最主要因素[53]。表3中列出了制備海洋源降血壓肽常用酶的最佳溫度和pH 值。Li 等[54]利用胃蛋白酶水解鱈魚骨架制備降血壓肽，通過超濾膜獲得ACE抑制率最高的組分，采用SP-Sephadex C-25 凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜對ACE 抑制肽進(jìn)行進(jìn)一步的純化分離，最終制得IC50值為14.7 μmol/L 的降血壓肽Phe-Gly-Ala-Ser-Thr-Ara-Gly-Ala。Wang 等[42]選用胃蛋白酶酶解牡蠣蛋白，并采用Sephadex LH-20 凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜對ACE 抑制肽進(jìn)行分離，制備出具有序列Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe 的九肽，通過動物實(shí)驗(yàn)，證明其ACE 抑制活性的有效性。Liu 等[55]采用酶法從珍珠牡蠣肉蛋白中制備降血壓抑制肽，采用超濾、聚乙二醇甲基醚改性的固定化金屬離子親和介質(zhì)以及反相高效液相色譜對其水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到2 種新型的ACE抑制肽（His-Leu-His-Thr 和Gly-Trp-Ala）。結(jié)果表明，2 種肽均具有較高ACE 抑制活性值，IC50值分別為（458.1 ± 3.2）μmol/L 和（109.3 ± 1.5）μmol/L，可通過降低大鼠血壓來證明其降壓活性。酶解法的優(yōu)點(diǎn)是成本較低，安全性能高，無毒副作用。

表3 不同蛋白酶制備ACE 抑制肽的最佳條件Table 3 Optimum condition for the preparation ACE using different enzymes

4.2 化學(xué)合成法

化學(xué)合成制備法分為液相合成法和固相合成法，該方法是將已知序列進(jìn)行多肽合成，以提高制備效率。1963年，Merrifield[64]研究發(fā)明了固相合成法。與經(jīng)典液相合成法相比，固相合成法的應(yīng)用范圍更廣泛，該方法分離純化更加簡便、快捷且可自動化操作。陸東濤等[65]完成了海洋環(huán)肽stylissamide Ⅰ的全合成，以2-氯三苯甲基氯樹脂（簡稱二氯樹脂）為載體，選用6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N-二異丙基乙胺為縮合試劑依次連接9-笏甲氧羰基保護(hù)的氨基酸，在三氟乙醇的作用下將直鏈肽從樹脂上切割下來，然后使用（3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基） 三-1-吡咯烷基六氟磷酸鹽，N-羥基-7-氮雜苯并三氮唑和N-甲基嗎啡啉在溶液中完成環(huán)合，最后在三氟乙酸的處理下脫去側(cè)鏈保護(hù)基，獲得環(huán)肽粗品。經(jīng)反相高效液相色譜對所合成的環(huán)肽粗品進(jìn)行純化，終產(chǎn)物純度98.9%。Kem 等[66]對?？舅鞯慕Y(jié)構(gòu)進(jìn)行了全合成，首先對8 個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行合成，然后選擇性引入雙鍵對接，最終完成海葵毒素全分子的合成。固相合成多肽已成為合成多肽的主要方法，廣泛應(yīng)用于合成小肽?；瘜W(xué)合成法多用于人工合成藥物的制備，然而，其具有成本高、有毒副作用和化合物殘留等缺點(diǎn)。

4.3 基因工程法

近些年，重組技術(shù)的迅速發(fā)展為降血壓肽的開發(fā)利用開啟了新篇章。該方法在已知ACE 抑制肽氨基酸序列的前提下，通過將目標(biāo)肽克隆到載體上，進(jìn)而構(gòu)建重組基因工程菌，通過工程菌發(fā)酵制備ACE 抑制肽[67]。吳亞麗等[68]利用基因工程手段將高活性的降血壓肽單體克隆到大腸桿菌融合表達(dá)載體DGEX-4T-2 之上，構(gòu)建了重組降血壓肽基因工程菌。通過細(xì)胞破碎和酶解制得融合蛋白GST-AHP，利用高效液相色譜對融合蛋白進(jìn)行酶切，分離純化得到較高活性的降血壓肽段?；蚬こ谭ù嬖诘闹饕獑栴}是短肽容易被蛋白酶降解[69]，該方法適合制備長肽和蛋白質(zhì)，然而，ACE抑制肽大部分為短肽，因此基因工程法制備降血壓肽受到很大限制。

5 ACE 抑制肽的評價方法

隨著人們對ACE 抑制肽的關(guān)注度與日俱增，建立方便可靠的ACE 抑制肽檢測方法也日益迫切，目前的檢測方法主要包括體外檢測ACE 抑制活性和體內(nèi)檢測ACE 抑制活性兩種方法。

體外檢測ACE 抑制活性常用的主要有分光光度法和高效液相色譜法。分光光度法利用ACE水解底物，根據(jù)吸光度的變化來測定ACE 活性。N-[3-（2-呋喃基） 丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）和馬脲酰組氨酰亮氨酸（HHL）是測定ACE 抑制肽的常用底物。有研究表明，F(xiàn)APGG 和HHL 均可有效的測定ACE 抑制肽活性，然而，F(xiàn)APGG 的穩(wěn)定性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于HHL，因此使用FAPGG 做底物不僅靈敏度高，還可以減少化學(xué)物質(zhì)的消耗，節(jié)約試驗(yàn)成本[70]。盡管分光光度法非常有效，但該方法也存在著明顯的不足，例如操作復(fù)雜、耗時且對痕量樣品的分析有限。高效液相色譜法通過UV 監(jiān)測器檢測馬尿酸的含量以確定ACE 活性。該方法雖操作簡單，靈敏度高，但測樣前需要大量的流動相和時間清洗柱子，以減少檢測結(jié)果的誤差，在檢測過程中難以實(shí)現(xiàn)高通量。

體內(nèi)測定ACE 抑制活性又稱動物實(shí)驗(yàn)法，該試驗(yàn)通常以原發(fā)性高血壓大白鼠為實(shí)驗(yàn)對象，將不同劑量的待檢樣品通過口服給藥或靜脈注射后測量大鼠血壓的變化，通過記錄攝入ACE 抑制肽前后收縮壓的變化，判斷ACE 抑制肽的活性。Jung 等[60]采用α-糜蛋白酶水解黃鰭鰈魚骨架蛋白質(zhì)制備了降血壓多肽Met-lle-Phe-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Glu-Leu，其IC50值為28.7 μg/mL，將制備的多肽喂食原發(fā)性高血壓大鼠，結(jié)果表明大鼠血壓明顯下降。Barkia 等[45]以海洋硅藻作為降血壓肽的新來源，選用木瓜蛋白酶水解海洋硅藻，并持續(xù)5 d 將水解液喂食原發(fā)性高血壓大鼠，結(jié)果表明400 mg/kg 劑量的水解液可以使原發(fā)性高血壓大鼠血壓降低約17 mm Hg。

6 結(jié)論

高血壓是心血管疾病的主要病因，由于高血壓沒有明顯癥狀，因此被稱為“無聲殺手”[71]。與降血壓合成藥物的嚴(yán)重副作用相比，海洋源降壓肽更容易被人體吸收利用，且沒有任何副作用。因此，海洋源ACE 抑制肽在世界范圍內(nèi)受到廣泛的關(guān)注。然而，目前ACE 抑制肽臨床應(yīng)用較少，需要進(jìn)一步研究其臨床功效、在人體內(nèi)的生物利用度和組織親和力等。其次，ACE 抑制肽的分離純化存在操作復(fù)雜，成本較高且難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等方面的不足。在ACE 抑制肽的研發(fā)中著重彌補(bǔ)臨床應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)中的不足，將成為未來海洋源ACE 抑制肽的研究難點(diǎn)和重點(diǎn)。