玉米須水提物對2型糖尿病小鼠的降血糖和保肝作用

金丹莉，陳躍文*，柴庭庭，任少天，袁燕微，程逸潮

（1 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018 2 浙江工商大學(xué)東海食品臺州研究院 杭州 310018）

2 型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM） 是世界范圍內(nèi)最普遍的代謝疾病之一，約占糖尿病病型人數(shù)的90%[1]。預(yù)計到2045年，糖尿病患者人數(shù)將可能增至7.0 億[2]。在空腹條件下，高水平的血糖值是糖尿病最顯著的特征。如果體內(nèi)長期處于異常高血糖水平狀態(tài)，就會損害機(jī)體器官組織及功能，特別是眼睛、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)等。

T2DM 具有高水平血糖和胰島素抵抗的顯著特點。一方面，血糖水平在胰島素和胰高血糖素等激素的作用下，能夠被嚴(yán)格調(diào)控在一個很狹窄的范圍內(nèi)；在餐后狀態(tài)下，高血糖水平會觸發(fā)葡萄糖攝取并抑制葡萄糖產(chǎn)生，從而能夠?qū)⒀蔷S持在恒定的正常水平。T2DM 是一種異常的生理狀態(tài)，會對葡萄糖濃度的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)造成嚴(yán)重?fù)p害，不能及時地恢復(fù)到正常血糖水平；在此過程中，患者會減弱對葡萄糖的攝取，調(diào)節(jié)葡萄糖的機(jī)制會受到嚴(yán)重?fù)p害[3]。另一方面，胰島素是體內(nèi)唯一能夠調(diào)節(jié)血糖水平的激素，然而，T2DM 患者對胰島素的敏感性降低，導(dǎo)致胰島素利用效率降低，血糖水平不能恢復(fù)到正常狀態(tài)。長時間處于血糖異常時，還可能破壞胰島β 細(xì)胞，導(dǎo)致高胰島素癥[4]。此外，肝臟是主要負(fù)責(zé)葡萄糖產(chǎn)生和釋放以及運輸工作的臟器，能夠在餐后處理絕大部分的葡萄糖。糖原是葡萄糖胞內(nèi)可儲存形式之一，其中生成糖原的主要途徑是糖異生[5]。然而，在T2DM 中，肝臟的糖異生過程被糖異生基因過度表達(dá)，導(dǎo)致該過程被異常激活，出現(xiàn)了高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗的主要癥狀[6]。

玉米須是農(nóng)作物廢棄物，具有資源豐富，容易獲取等特點。2012年，原中華人民共和國衛(wèi)生部在《關(guān)于玉米須類產(chǎn)品安全性管理原則的請示》批復(fù)中明確玉米須可以作為普通食品管理使用。玉米須的主要功能成分有蛋白質(zhì)、粗纖維、多糖、黃酮類、有機(jī)酸、皂苷、生物堿等[7]。關(guān)于玉米須功能特性的研究報道有很多，比如抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤、抗肥胖和精神保護(hù)作用等[8]。在中國，玉米須常以泡茶、入藥等方式飲用，被用于糖尿病癥狀的改善，然而，關(guān)于玉米須水提物功能特性的研究和應(yīng)用仍有限。

本研究采用超聲輔助水提法制備玉米須水提物，通過高脂飲食喂養(yǎng)db/db 小鼠誘導(dǎo)T2DM 模型，研究玉米須水提物對T2DM 小鼠模型的降血糖和保護(hù)肝臟作用，為玉米須的綜合利用和精深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須，吉林涼水灘農(nóng)牧業(yè)有限公司。C57BL/KsJ 品種的7 周齡雄性Leprdb 突變db/db 小鼠（20±5）g 和C57BL/6 品種的7 周齡雄性非糖尿病小鼠（20±5）g，江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司（證號：SCXK （蘇）2018-0008）。基礎(chǔ)飼料（LAD0011）、高脂飼料（TP23300，60%高脂模型飼料），南通特洛菲飼料科技有限公司。使用的所有其它化學(xué)品均為分析級級。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M 冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；一次性使用采血針，蘇州施萊醫(yī)療器械有限公司；血糖儀，強(qiáng)生（中國）醫(yī)療器械有限公司；光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)，尼康映像儀器銷售（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米須水提物的制備 玉米須烘干、粉碎，稱取50 g，按料液比1∶50、超聲溫度50 ℃、超聲功率360 W、提取時間2 h 重復(fù)提取3 次后合并濾液，60 ℃恒溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將濃縮液進(jìn)行低溫冷凍干燥得到玉米須水提物粉末，4 ℃冷藏保存。使用時用純水溶解并配置成所需濃度。

1.3.2 動物實驗設(shè)計 所有實驗均按照中華人民共和國動物倫理程序和機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行。動物福利評價依據(jù)《實驗動物——動物福利倫理審查指南》（GB/T 35892-2018）執(zhí)行。小鼠均飼養(yǎng)于（22±2）℃的環(huán)境，定時12 h 明暗交替，相對濕度保持在（50±5）%。給予無菌水和普通飼料，適應(yīng)1 周，再進(jìn)行后續(xù)實驗。體質(zhì)量增加至為肥胖糖尿病小鼠（T2DM 模型）后，用普通標(biāo)準(zhǔn)飼料繼續(xù)喂養(yǎng)至實驗結(jié)束。

成功建模為T2DM 后，每日上午9～10 時固定時間，TLD 組和THD 組小鼠分別灌胃0.2 mL 的低、高劑量的玉米須水提物，對照組和T2DM 組灌胃等體積生理鹽水，灌胃深度為3 cm，連續(xù)灌胃12 周。分組情況如下：1）生理鹽水處理的C57BL/6小鼠 （對照組）；2） 生理鹽水處理的db/db 小鼠（T2DM 組）；3）玉米須水提物低劑量（300 mg/kg）處理的db/db 小鼠（TLD 組）；4）玉米須水提物高劑量（600 mg/kg）處理的db/db 小鼠（THD 組）。

1.3.3 誘發(fā)2 型糖尿病 除對照組外，其余所有小鼠均被高脂飲食喂養(yǎng)2 周[9]。當(dāng)小鼠體質(zhì)量超過40 g 時，能夠被定義為飲食誘導(dǎo)的T2DM 小鼠，并進(jìn)行空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）的測定。連續(xù)2 周空腹血糖水平大于11.1 mmol/L 即造模成功[10]。

1.3.4 體質(zhì)量和一般體征的記錄 記錄小鼠初始、每周及處死前體質(zhì)量。觀察每只小鼠的活動情況。

1.3.5 空腹血糖的測定 在實驗期間，每周使用血糖測定儀及配套試紙條進(jìn)行FBG 水平的快速測量。

1.3.6 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）的測定 小鼠禁食不禁水16 h 后，尾靜脈采血，測定血清血糖[11]。此時血糖值定為-40 min 的血糖值，隨后即用0.2 mL 的低、高劑量的玉米須水提物給小鼠灌胃。40 min 后，以2.0 g/kg 劑量的葡萄糖給小鼠灌胃。小鼠尾靜脈采血，采用血糖測定儀及配套試紙條進(jìn)行快速測定，待3 s 后讀取顯示屏的血糖值。測定小鼠灌胃葡萄糖后0，15，30，60，90，120 min的血糖值，比較小鼠的葡萄糖耐量曲線的變化以及葡萄糖糖耐量曲線下面積（AUC）值。

1.3.7 胰島素耐量試驗（ITT）的測定 小鼠禁食不禁水16 h 后，尾靜脈采血，測定血清血糖[6]。然后立即向?qū)φ战M、T2DM 組、TLD 組和TLD 組（1.0 U/kg）腹腔注射胰島素。測定注射后0，15，30，60，90，120 min 的血糖值。根據(jù)血糖值繪制血糖變化圖，并計算胰島素耐量AUC 值。

1.3.8 肝臟病理形態(tài)的觀察及臟器指數(shù)的測定小鼠脫頸處死，取肝臟組織，生理鹽水清洗去除組織上血跡，用濾紙吸干水分后，稱重。按照公式（1）計算臟器指數(shù)[12]。然后立即在液氮中速凍并存儲于-80 ℃直至使用。

1.3.9 組織學(xué)分析 小鼠肝臟組織用PBS 沖洗并在室溫下用4%福爾馬林固定24 h，脫水，然后嵌入石蠟中切片。最后，將4 μm 的切片用蘇木精和伊紅染色，在顯微鏡200 倍和400 倍視野下進(jìn)行拍照[13]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0、Origin 2021 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析法進(jìn)行多組間差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠體質(zhì)量和一般體征的影響

如圖1所示，在實驗過程中，T2DM 小鼠表現(xiàn)出行動遲緩、逐漸消瘦的身體狀態(tài)，并且常伴有飲水多、吃食多、排尿多以及后期體重減輕的病癥，皮毛變得蓬松且無光澤。體質(zhì)量下降和肝腎質(zhì)量增加是糖尿病小鼠的典型特征，這可能與糖代謝缺陷和組織蛋白分解有關(guān)[14]。第7 周后，玉米須水提物TLD 組和THD 組的小鼠體質(zhì)量增長速率開始減緩，體質(zhì)量出現(xiàn)下降現(xiàn)象，小鼠的精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好。Siram 等[15]通過飲食改善體質(zhì)量能夠影響機(jī)體內(nèi)的代謝環(huán)境，更好地控制血糖、血脂和血壓水平。然而，T2DM 組、TLD 組和THD 組均為糖尿病小鼠，所以小鼠體質(zhì)量沒有出現(xiàn)明顯差異。

圖1 玉米須水提物對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of corn silk extract on the body weight of mice

2.2 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠空腹血糖（FBG）的影響

FBG 升高是T2DM 最典型和最重要的癥狀。如圖2所示，第8 周時，T2DM 組、TLD 組和THD組小鼠的空腹血糖值均高于11.1 mmol/L，為典型的2 型糖尿病特征。對照組組小鼠空腹血糖水平顯著低于各個實驗組（P<0.05）。隨玉米須水提物灌胃時間的延長，各個實驗組之間血糖水平及增長速度開始出現(xiàn)變化?？梢钥闯觯?0 和12 周時，THD 組的空腹血糖水平低于TLD 組，顯著低于T2DM 組（P<0.05）。研究表明多糖可以促進(jìn)胰島素分泌，保護(hù)胰島β 細(xì)胞從而提高胰島素敏感性和改善糖代謝紊亂[16]。玉米絲的乙酸乙酯成分能夠通過改善胰島素、葡萄糖激酶表達(dá)，刺激胰島素分泌，增強(qiáng)處理葡萄糖的速率[17]。植物性多糖不會提高血糖水平，反而具有降血糖活性[18]。

圖2 玉米須水提物對小鼠FBG 的影響Fig.2 Effects of corn silk extract on FBG in mice

2.3 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）的影響

如圖3a 所示，灌胃葡萄糖30 min 過后，各實驗組的血糖水平均顯著高于對照組，表明T2DM小鼠的葡萄糖分解能力明顯低于正常小鼠[19]。此外，在灌胃的30～120 min 內(nèi)，THD 組和TLD 組小鼠血糖下降速度均比T2DM 組快，特別是THD組。如圖3b 所示，TLD 組和THD 組小鼠AUC 值分別（3 217±140）mmol/L 和（2 967±125）mmol/L，與T2DM 組相比，均有所下降。此外，THD 組小鼠AUC 顯著低于T2DM 組（P<0.05），TLD 組與THD組小鼠AUC 具有顯著性差異（P<0.05）。Ma 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，玉米須多糖能夠有效抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，從而通過控制淀粉代謝來有效控制餐后血糖水平。同時，植物化學(xué)分析揭示了生物堿、黃酮類化合物、酚類、皂苷、單寧和植物甾醇作為玉米須水提物中可能存在的成分，也具備抑制作用[21]。玉米須多糖和黃酮類物質(zhì)是通過范德華力和氫鍵自發(fā)發(fā)生的，能夠協(xié)同抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性[22]，減緩葡萄糖進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)的速率，從而起到降血糖的效果。綜上，通過灌胃玉米須水提物，TLD 組和THD 組糖尿病小鼠均顯著降低了餐后血糖水平，表明玉米須水提物能有效控制糖尿病小鼠的餐后血糖，改善其糖耐量，提高其對葡萄糖的耐受力，具有一定的降血糖功能且具有量效關(guān)系。

圖3 玉米須水提物對小鼠OGTT 及AUC 的影響Fig.3 Effects of corn silk extract on OGTT and AUC in mice

2.4 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠胰島素耐量的影響

如圖4a 所示，在0～30 min 內(nèi)，與對照組相比，各實驗組腹腔注射胰島素后，血糖均快速下降，表現(xiàn)出更高的胰島素敏感性。當(dāng)注射60～120 min 內(nèi)，TLD 組和THD 組小鼠血糖緩慢上升至原有水平；而T2DM 組小鼠的血糖仍在緩慢下降，未出現(xiàn)上升趨勢。此外，各實驗組的胰島素耐量均顯著高于對照組（P<0.05），說明灌胃玉米須水提物雖有效用，但不能達(dá)到正常小鼠的胰島素耐量水平。如圖4b 所示，TLD 組和THD 組的AUC 值分別 （3 361±67）mmol/L 和 （3 151±156）mmol/L，與T2DM 組相比，均顯著下降（P<0.05）。此外，THD組小鼠AUC 顯著低于T2DM 組（P<0.05），TLD 組和THD 組小鼠AUC 具有顯著性差異 （P<0.05）。Sabiu 等[21]表明玉米須水提物中存在生物堿、酚類、單寧、類黃酮、皂苷和甾醇等活性物質(zhì)。這些物質(zhì)還具有再生胰腺β 細(xì)胞和抑制碳水化合物代謝酶活性的抗糖尿病能力[23]。許多研究發(fā)現(xiàn)玉米須提取物對血糖代謝的作用機(jī)制是通過增加胰島素水平和恢復(fù)受損的β 細(xì)胞，促進(jìn)胰島素分泌，而不是通過增加糖原和抑制糖異生的方式[24]。這表明，低、高劑量的玉米須水提物灌胃后，能夠增強(qiáng)機(jī)體對胰島素敏感性，改善胰島素抗性，從而改善糖代謝通路，增加組織、細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力，最終有效控制血糖水平，對代謝健康產(chǎn)生積極健康的影響。

圖4 玉米須水提物對小鼠ITT 及AUC 的影響Fig.4 Effects of corn silk extract on ITT and AUC in mice

2.5 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠胰腺、肝臟、附睪脂肪的臟器指數(shù)的影響

表1所示，T2DM 組小鼠肝臟和附睪脂肪指數(shù)明顯大于對照組小鼠（P<0.05），胰腺指數(shù)明顯小于對照組小鼠（P<0.05）。經(jīng)過玉米須水提物灌胃后，TLD 組和THD 組小鼠的附睪脂肪的臟器指數(shù)有所下降，胰腺的臟器指數(shù)有所上升。Zhang 等[18]闡述了玉米須多糖在小鼠肝毒性模型中的作用，研究表明血清中的谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶的水平顯著降低，并且能夠明顯觀察到小鼠肝臟中丙二醛水平的降低，這說明玉米須含有多糖成分對機(jī)體無毒性，還對肝臟、胰腺組織具有保護(hù)作用，免受損傷。玉米須多糖能夠降低膽固醇和總甘油三酯在內(nèi)的血脂水平，能夠在一定程度上保護(hù)肝臟[25]。玉米須中含有蛋黃素等黃銅類物質(zhì)能夠有效地改善肝臟的膽固醇水平[26]。上述結(jié)果表明玉米須水提物具有修復(fù)肝臟、胰腺、附睪的損傷器官的潛力。

表1 玉米須水提物對小鼠胰腺、肝臟、附睪脂肪臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of corn silk extract on the index of pancreas，liver and epididymal fat organs in mice

2.6 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠肝臟病理形態(tài)的影響

圖5所示，對照組小鼠中肝細(xì)胞分布密集，細(xì)胞形態(tài)良好，具有豐富的細(xì)胞質(zhì)，血管形狀整齊，未見明顯病變。與對照組相比，T2DM 組肝細(xì)胞內(nèi)有大空泡形成，脂肪面積較大，出現(xiàn)脂肪滴，血管周圍纖維增生，炎性細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞壞死，表明T2DM 組小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪代謝障礙癥狀，過多的脂類物質(zhì)在肝臟中積累沉積。低、高劑量玉米須水提物攝入的TLD 組和THD 組相比T2DM 組小鼠脂肪空泡減小，炎性細(xì)胞浸潤減少，血管周圍增生減弱，小鼠肝臟脂質(zhì)積累顯著改善。隨著灌胃劑量的升高，小鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得更加清晰和完整，表明低、高劑量的玉米須水提物不同程度上減輕、修復(fù)和保護(hù)T2DM 小鼠的肝臟組織。研究表明，水溶性多糖比堿溶性多糖表現(xiàn)出了更好的生物活性[27]，其中植物性多糖還對肝損傷具有保護(hù)作用[28]。玉米多糖能夠通過介導(dǎo)自由基清除和調(diào)節(jié)肝臟微粒體細(xì)胞色素P450 活性，有效保護(hù)肝臟[18]。玉米須水提物灌胃能夠減少肝臟脂質(zhì)累積，從而防止T2DM 小鼠肝臟的形態(tài)的病變[29]。

圖5 玉米須水提物對小鼠肝臟HE 染色的影響Fig.5 Effects of corn silk extract on HE staining in mouse liver

3 結(jié)論

超聲輔助水提法制備玉米須水提物，通過高脂飼料誘導(dǎo)db/db 小鼠為T2DM 模型，進(jìn)行降血糖實驗，不同劑量的玉米須水提物均可有效改善2 型糖尿病小鼠的血糖水平。與T2DM 組小鼠相比，低劑量玉米須水提物可降低小鼠空腹血糖水平，提高葡萄糖耐受能力、改善胰島素抵抗以及保護(hù)肝臟；高劑量玉米須水提物能顯著降低小鼠空腹血糖水平（P<0.05），顯著提高葡萄糖耐受能力（P<0.05），顯著改善胰島素抵抗（P<0.05），減小肝臟脂肪空泡，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得清晰，具有保護(hù)和修復(fù)肝臟作用，說明玉米須水提物對降血糖及保肝作用具有量效關(guān)系。本文研究了玉米須水提物的降血糖活性以及保護(hù)肝臟的作用，可為玉米須在功能性食品中的深加工開發(fā)和產(chǎn)業(yè)衍生應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。