玉米須水提物對2型糖尿病小鼠的降血糖和保肝作用

金丹莉，陳躍文*，柴庭庭，任少天，袁燕微，程逸潮

（1 浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州 310018 2 浙江工商大學東海食品臺州研究院 杭州 310018）

2 型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM） 是世界范圍內最普遍的代謝疾病之一，約占糖尿病病型人數(shù)的90%[1]。預計到2045年，糖尿病患者人數(shù)將可能增至7.0 億[2]。在空腹條件下，高水平的血糖值是糖尿病最顯著的特征。如果體內長期處于異常高血糖水平狀態(tài)，就會損害機體器官組織及功能，特別是眼睛、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)等。

T2DM 具有高水平血糖和胰島素抵抗的顯著特點。一方面，血糖水平在胰島素和胰高血糖素等激素的作用下，能夠被嚴格調控在一個很狹窄的范圍內；在餐后狀態(tài)下，高血糖水平會觸發(fā)葡萄糖攝取并抑制葡萄糖產(chǎn)生，從而能夠將血糖維持在恒定的正常水平。T2DM 是一種異常的生理狀態(tài)，會對葡萄糖濃度的穩(wěn)態(tài)調節(jié)造成嚴重損害，不能及時地恢復到正常血糖水平；在此過程中，患者會減弱對葡萄糖的攝取，調節(jié)葡萄糖的機制會受到嚴重損害[3]。另一方面，胰島素是體內唯一能夠調節(jié)血糖水平的激素，然而，T2DM 患者對胰島素的敏感性降低，導致胰島素利用效率降低，血糖水平不能恢復到正常狀態(tài)。長時間處于血糖異常時，還可能破壞胰島β 細胞，導致高胰島素癥[4]。此外，肝臟是主要負責葡萄糖產(chǎn)生和釋放以及運輸工作的臟器，能夠在餐后處理絕大部分的葡萄糖。糖原是葡萄糖胞內可儲存形式之一，其中生成糖原的主要途徑是糖異生[5]。然而，在T2DM 中，肝臟的糖異生過程被糖異生基因過度表達，導致該過程被異常激活，出現(xiàn)了高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗的主要癥狀[6]。

玉米須是農作物廢棄物，具有資源豐富，容易獲取等特點。2012年，原中華人民共和國衛(wèi)生部在《關于玉米須類產(chǎn)品安全性管理原則的請示》批復中明確玉米須可以作為普通食品管理使用。玉米須的主要功能成分有蛋白質、粗纖維、多糖、黃酮類、有機酸、皂苷、生物堿等[7]。關于玉米須功能特性的研究報道有很多，比如抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤、抗肥胖和精神保護作用等[8]。在中國，玉米須常以泡茶、入藥等方式飲用，被用于糖尿病癥狀的改善，然而，關于玉米須水提物功能特性的研究和應用仍有限。

本研究采用超聲輔助水提法制備玉米須水提物，通過高脂飲食喂養(yǎng)db/db 小鼠誘導T2DM 模型，研究玉米須水提物對T2DM 小鼠模型的降血糖和保護肝臟作用，為玉米須的綜合利用和精深加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須，吉林涼水灘農牧業(yè)有限公司。C57BL/KsJ 品種的7 周齡雄性Leprdb 突變db/db 小鼠（20±5）g 和C57BL/6 品種的7 周齡雄性非糖尿病小鼠（20±5）g，江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司（證號：SCXK （蘇）2018-0008）?；A飼料（LAD0011）、高脂飼料（TP23300，60%高脂模型飼料），南通特洛菲飼料科技有限公司。使用的所有其它化學品均為分析級級。

1.2 儀器與設備

TGL-16M 冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；一次性使用采血針，蘇州施萊醫(yī)療器械有限公司；血糖儀，強生（中國）醫(yī)療器械有限公司；光學顯微鏡及成像系統(tǒng)，尼康映像儀器銷售（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米須水提物的制備 玉米須烘干、粉碎，稱取50 g，按料液比1∶50、超聲溫度50 ℃、超聲功率360 W、提取時間2 h 重復提取3 次后合并濾液，60 ℃恒溫下旋轉蒸發(fā)濃縮。將濃縮液進行低溫冷凍干燥得到玉米須水提物粉末，4 ℃冷藏保存。使用時用純水溶解并配置成所需濃度。

1.3.2 動物實驗設計 所有實驗均按照中華人民共和國動物倫理程序和機構指南進行。動物福利評價依據(jù)《實驗動物——動物福利倫理審查指南》（GB/T 35892-2018）執(zhí)行。小鼠均飼養(yǎng)于（22±2）℃的環(huán)境，定時12 h 明暗交替，相對濕度保持在（50±5）%。給予無菌水和普通飼料，適應1 周，再進行后續(xù)實驗。體質量增加至為肥胖糖尿病小鼠（T2DM 模型）后，用普通標準飼料繼續(xù)喂養(yǎng)至實驗結束。

成功建模為T2DM 后，每日上午9～10 時固定時間，TLD 組和THD 組小鼠分別灌胃0.2 mL 的低、高劑量的玉米須水提物，對照組和T2DM 組灌胃等體積生理鹽水，灌胃深度為3 cm，連續(xù)灌胃12 周。分組情況如下：1）生理鹽水處理的C57BL/6小鼠 （對照組）；2） 生理鹽水處理的db/db 小鼠（T2DM 組）；3）玉米須水提物低劑量（300 mg/kg）處理的db/db 小鼠（TLD 組）；4）玉米須水提物高劑量（600 mg/kg）處理的db/db 小鼠（THD 組）。

1.3.3 誘發(fā)2 型糖尿病 除對照組外，其余所有小鼠均被高脂飲食喂養(yǎng)2 周[9]。當小鼠體質量超過40 g 時，能夠被定義為飲食誘導的T2DM 小鼠，并進行空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）的測定。連續(xù)2 周空腹血糖水平大于11.1 mmol/L 即造模成功[10]。

1.3.4 體質量和一般體征的記錄 記錄小鼠初始、每周及處死前體質量。觀察每只小鼠的活動情況。

1.3.5 空腹血糖的測定 在實驗期間，每周使用血糖測定儀及配套試紙條進行FBG 水平的快速測量。

1.3.6 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）的測定 小鼠禁食不禁水16 h 后，尾靜脈采血，測定血清血糖[11]。此時血糖值定為-40 min 的血糖值，隨后即用0.2 mL 的低、高劑量的玉米須水提物給小鼠灌胃。40 min 后，以2.0 g/kg 劑量的葡萄糖給小鼠灌胃。小鼠尾靜脈采血，采用血糖測定儀及配套試紙條進行快速測定，待3 s 后讀取顯示屏的血糖值。測定小鼠灌胃葡萄糖后0，15，30，60，90，120 min的血糖值，比較小鼠的葡萄糖耐量曲線的變化以及葡萄糖糖耐量曲線下面積（AUC）值。

1.3.7 胰島素耐量試驗（ITT）的測定 小鼠禁食不禁水16 h 后，尾靜脈采血，測定血清血糖[6]。然后立即向對照組、T2DM 組、TLD 組和TLD 組（1.0 U/kg）腹腔注射胰島素。測定注射后0，15，30，60，90，120 min 的血糖值。根據(jù)血糖值繪制血糖變化圖，并計算胰島素耐量AUC 值。

1.3.8 肝臟病理形態(tài)的觀察及臟器指數(shù)的測定小鼠脫頸處死，取肝臟組織，生理鹽水清洗去除組織上血跡，用濾紙吸干水分后，稱重。按照公式（1）計算臟器指數(shù)[12]。然后立即在液氮中速凍并存儲于-80 ℃直至使用。

1.3.9 組織學分析 小鼠肝臟組織用PBS 沖洗并在室溫下用4%福爾馬林固定24 h，脫水，然后嵌入石蠟中切片。最后，將4 μm 的切片用蘇木精和伊紅染色，在顯微鏡200 倍和400 倍視野下進行拍照[13]。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0、Origin 2021 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理，結果以平均值±標準差（±s）表示。采用單因素方差分析法進行多組間差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠體質量和一般體征的影響

如圖1所示，在實驗過程中，T2DM 小鼠表現(xiàn)出行動遲緩、逐漸消瘦的身體狀態(tài)，并且常伴有飲水多、吃食多、排尿多以及后期體重減輕的病癥，皮毛變得蓬松且無光澤。體質量下降和肝腎質量增加是糖尿病小鼠的典型特征，這可能與糖代謝缺陷和組織蛋白分解有關[14]。第7 周后，玉米須水提物TLD 組和THD 組的小鼠體質量增長速率開始減緩，體質量出現(xiàn)下降現(xiàn)象，小鼠的精神狀態(tài)轉好。Siram 等[15]通過飲食改善體質量能夠影響機體內的代謝環(huán)境，更好地控制血糖、血脂和血壓水平。然而，T2DM 組、TLD 組和THD 組均為糖尿病小鼠，所以小鼠體質量沒有出現(xiàn)明顯差異。

圖1 玉米須水提物對小鼠體質量的影響Fig.1 Effects of corn silk extract on the body weight of mice

2.2 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠空腹血糖（FBG）的影響

FBG 升高是T2DM 最典型和最重要的癥狀。如圖2所示，第8 周時，T2DM 組、TLD 組和THD組小鼠的空腹血糖值均高于11.1 mmol/L，為典型的2 型糖尿病特征。對照組組小鼠空腹血糖水平顯著低于各個實驗組（P<0.05）。隨玉米須水提物灌胃時間的延長，各個實驗組之間血糖水平及增長速度開始出現(xiàn)變化。可以看出，第10 和12 周時，THD 組的空腹血糖水平低于TLD 組，顯著低于T2DM 組（P<0.05）。研究表明多糖可以促進胰島素分泌，保護胰島β 細胞從而提高胰島素敏感性和改善糖代謝紊亂[16]。玉米絲的乙酸乙酯成分能夠通過改善胰島素、葡萄糖激酶表達，刺激胰島素分泌，增強處理葡萄糖的速率[17]。植物性多糖不會提高血糖水平，反而具有降血糖活性[18]。

圖2 玉米須水提物對小鼠FBG 的影響Fig.2 Effects of corn silk extract on FBG in mice

2.3 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）的影響

如圖3a 所示，灌胃葡萄糖30 min 過后，各實驗組的血糖水平均顯著高于對照組，表明T2DM小鼠的葡萄糖分解能力明顯低于正常小鼠[19]。此外，在灌胃的30～120 min 內，THD 組和TLD 組小鼠血糖下降速度均比T2DM 組快，特別是THD組。如圖3b 所示，TLD 組和THD 組小鼠AUC 值分別（3 217±140）mmol/L 和（2 967±125）mmol/L，與T2DM 組相比，均有所下降。此外，THD 組小鼠AUC 顯著低于T2DM 組（P<0.05），TLD 組與THD組小鼠AUC 具有顯著性差異（P<0.05）。Ma 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，玉米須多糖能夠有效抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，從而通過控制淀粉代謝來有效控制餐后血糖水平。同時，植物化學分析揭示了生物堿、黃酮類化合物、酚類、皂苷、單寧和植物甾醇作為玉米須水提物中可能存在的成分，也具備抑制作用[21]。玉米須多糖和黃酮類物質是通過范德華力和氫鍵自發(fā)發(fā)生的，能夠協(xié)同抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性[22]，減緩葡萄糖進入體內循環(huán)的速率，從而起到降血糖的效果。綜上，通過灌胃玉米須水提物，TLD 組和THD 組糖尿病小鼠均顯著降低了餐后血糖水平，表明玉米須水提物能有效控制糖尿病小鼠的餐后血糖，改善其糖耐量，提高其對葡萄糖的耐受力，具有一定的降血糖功能且具有量效關系。

圖3 玉米須水提物對小鼠OGTT 及AUC 的影響Fig.3 Effects of corn silk extract on OGTT and AUC in mice

2.4 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠胰島素耐量的影響

如圖4a 所示，在0～30 min 內，與對照組相比，各實驗組腹腔注射胰島素后，血糖均快速下降，表現(xiàn)出更高的胰島素敏感性。當注射60～120 min 內，TLD 組和THD 組小鼠血糖緩慢上升至原有水平；而T2DM 組小鼠的血糖仍在緩慢下降，未出現(xiàn)上升趨勢。此外，各實驗組的胰島素耐量均顯著高于對照組（P<0.05），說明灌胃玉米須水提物雖有效用，但不能達到正常小鼠的胰島素耐量水平。如圖4b 所示，TLD 組和THD 組的AUC 值分別 （3 361±67）mmol/L 和 （3 151±156）mmol/L，與T2DM 組相比，均顯著下降（P<0.05）。此外，THD組小鼠AUC 顯著低于T2DM 組（P<0.05），TLD 組和THD 組小鼠AUC 具有顯著性差異 （P<0.05）。Sabiu 等[21]表明玉米須水提物中存在生物堿、酚類、單寧、類黃酮、皂苷和甾醇等活性物質。這些物質還具有再生胰腺β 細胞和抑制碳水化合物代謝酶活性的抗糖尿病能力[23]。許多研究發(fā)現(xiàn)玉米須提取物對血糖代謝的作用機制是通過增加胰島素水平和恢復受損的β 細胞，促進胰島素分泌，而不是通過增加糖原和抑制糖異生的方式[24]。這表明，低、高劑量的玉米須水提物灌胃后，能夠增強機體對胰島素敏感性，改善胰島素抗性，從而改善糖代謝通路，增加組織、細胞對葡萄糖的攝取能力，最終有效控制血糖水平，對代謝健康產(chǎn)生積極健康的影響。

圖4 玉米須水提物對小鼠ITT 及AUC 的影響Fig.4 Effects of corn silk extract on ITT and AUC in mice

2.5 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠胰腺、肝臟、附睪脂肪的臟器指數(shù)的影響

表1所示，T2DM 組小鼠肝臟和附睪脂肪指數(shù)明顯大于對照組小鼠（P<0.05），胰腺指數(shù)明顯小于對照組小鼠（P<0.05）。經(jīng)過玉米須水提物灌胃后，TLD 組和THD 組小鼠的附睪脂肪的臟器指數(shù)有所下降，胰腺的臟器指數(shù)有所上升。Zhang 等[18]闡述了玉米須多糖在小鼠肝毒性模型中的作用，研究表明血清中的谷氨酸丙酮酸轉氨酶、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶和乳酸脫氫酶的水平顯著降低，并且能夠明顯觀察到小鼠肝臟中丙二醛水平的降低，這說明玉米須含有多糖成分對機體無毒性，還對肝臟、胰腺組織具有保護作用，免受損傷。玉米須多糖能夠降低膽固醇和總甘油三酯在內的血脂水平，能夠在一定程度上保護肝臟[25]。玉米須中含有蛋黃素等黃銅類物質能夠有效地改善肝臟的膽固醇水平[26]。上述結果表明玉米須水提物具有修復肝臟、胰腺、附睪的損傷器官的潛力。

表1 玉米須水提物對小鼠胰腺、肝臟、附睪脂肪臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of corn silk extract on the index of pancreas，liver and epididymal fat organs in mice

2.6 玉米須水提物對2 型糖尿病小鼠肝臟病理形態(tài)的影響

圖5所示，對照組小鼠中肝細胞分布密集，細胞形態(tài)良好，具有豐富的細胞質，血管形狀整齊，未見明顯病變。與對照組相比，T2DM 組肝細胞內有大空泡形成，脂肪面積較大，出現(xiàn)脂肪滴，血管周圍纖維增生，炎性細胞浸潤，部分細胞壞死，表明T2DM 組小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪代謝障礙癥狀，過多的脂類物質在肝臟中積累沉積。低、高劑量玉米須水提物攝入的TLD 組和THD 組相比T2DM 組小鼠脂肪空泡減小，炎性細胞浸潤減少，血管周圍增生減弱，小鼠肝臟脂質積累顯著改善。隨著灌胃劑量的升高，小鼠肝臟細胞結構變得更加清晰和完整，表明低、高劑量的玉米須水提物不同程度上減輕、修復和保護T2DM 小鼠的肝臟組織。研究表明，水溶性多糖比堿溶性多糖表現(xiàn)出了更好的生物活性[27]，其中植物性多糖還對肝損傷具有保護作用[28]。玉米多糖能夠通過介導自由基清除和調節(jié)肝臟微粒體細胞色素P450 活性，有效保護肝臟[18]。玉米須水提物灌胃能夠減少肝臟脂質累積，從而防止T2DM 小鼠肝臟的形態(tài)的病變[29]。

圖5 玉米須水提物對小鼠肝臟HE 染色的影響Fig.5 Effects of corn silk extract on HE staining in mouse liver

3 結論

超聲輔助水提法制備玉米須水提物，通過高脂飼料誘導db/db 小鼠為T2DM 模型，進行降血糖實驗，不同劑量的玉米須水提物均可有效改善2 型糖尿病小鼠的血糖水平。與T2DM 組小鼠相比，低劑量玉米須水提物可降低小鼠空腹血糖水平，提高葡萄糖耐受能力、改善胰島素抵抗以及保護肝臟；高劑量玉米須水提物能顯著降低小鼠空腹血糖水平（P<0.05），顯著提高葡萄糖耐受能力（P<0.05），顯著改善胰島素抵抗（P<0.05），減小肝臟脂肪空泡，使細胞結構變得清晰，具有保護和修復肝臟作用，說明玉米須水提物對降血糖及保肝作用具有量效關系。本文研究了玉米須水提物的降血糖活性以及保護肝臟的作用，可為玉米須在功能性食品中的深加工開發(fā)和產(chǎn)業(yè)衍生應用提供一定的理論基礎。