乳酸菌代謝物中黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選

崔方超，韓瑜娟，李婷婷，趙貴琴，勵建榮*，林 洪，勞敏軍，于建洋，郭曉華，王 轟

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116600 3 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266100 4 浙江興業(yè)集團有限公司 浙江舟山 316022 5 榮成泰祥食品股份有限公司 山東榮成 264300 6 山東美佳食品股份有限公司 山東日照 276800 7 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺 264000）

隨著我國經(jīng)濟水平的飛速發(fā)展，國民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，其中以高能量、高嘌呤類食物攝入顯著增加為特征。在人體內(nèi)的代謝途徑中，嘌呤類物質(zhì)在黃嘌呤氧化酶 （Xanthine oxidase，XOD）的催化作用下最終轉(zhuǎn)化為尿酸。XOD 活性過高或患有代謝系統(tǒng)疾病會使尿酸大量累積，進而引發(fā)運動功能受損、高尿酸血癥和痛風(fēng)，長期高尿酸血癥還可誘發(fā)高血壓、糖尿病、冠心病、腎衰竭等疾病[1]。隨著高尿酸血癥和痛風(fēng)病發(fā)率呈逐年增加且年輕化的趨勢，高尿酸血癥成為繼“三高”之后的第4 個危險因素[2]。

目前，對痛風(fēng)的治療主要從兩方面入手：一方面是抑制尿酸的生成，另一方面是促進尿酸的排泄。抑制尿酸生成是通過抑制腺苷脫氨酶（Adenosine Deaminase，ADA） 和XOD 的活性達成，它們是催化并調(diào)控尿酸生成的關(guān)鍵酶。促進尿酸排泄是通過調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達來完成，抑制其在腎臟的重吸收，減少尿酸在血液中的積累，降低血清尿酸水平[3]。其中對XOD 的抑制研究較多，在臨床治療中，別嘌呤醇、非布司他等已被廣泛用于痛風(fēng)、高尿酸血癥等的治療，然而這些藥物具有較大的副作用，如引起患者肝功能損害，出現(xiàn)頭痛、胃腸道疾病以及腹瀉等不良癥狀[4]。關(guān)于植物活性物質(zhì)抑制XOD、降低尿酸含量的研究主要集中在多酚、黃酮和皂苷類物質(zhì)。多酚類物質(zhì)如葛根素[5]、山奈酚（木犀草素）[6]、芥子酸[7]、阿魏酸[7]、丁香酸[7]、綠原酸[8]、咖啡酸[9]等都具有明顯XOD 抑制性。黃酮類物質(zhì)如槲皮素[10]、黃芩苷[11]也具有相同功效。皂苷類物質(zhì)如穿山甲總皂苷[12]，是從藥材穿山甲中提取的可抑制XOD 的活性成分。

由于活性肽具有分子質(zhì)量小，容易被人體吸收等優(yōu)點，近些年作為抑制劑成為新的研究熱點。Li 等[13]以核桃蛋白衍生肽為研究對象，對其體外XOD 抑制活性及其機制進行研究，結(jié)果表明：含色氨酸（Trp） 的核桃蛋白源肽能有效抑制XOD，Trp 數(shù)量的增加可顯著提高肽的XOD 抑制活性，且含Trp 的肽具有很好的抗氧化活性。He 等[14]從金槍魚蛋白水解物中分離出13 種二肽和三肽，采用高效液相色譜法驗證了它們的XOD 抑制活性，結(jié)果表明：含苯丙氨酸（Phe）的肽比含Trp 的肽具有更高的XOD 抑制活性，其中Phe-His 的XOD抑制活性最高。趙謀明等[15]通過酶解金槍魚制備XOD 抑制肽，得到XOD 抑制率為30.96%的金槍魚酶解物。鄒琳[16]從鰹魚酶解物中分離得到具有XOD 抑制作用的五肽，人工合成此五肽證實其具有較強的XOD 抑制活性，分子對接結(jié)果顯示其能夠進入XOD 中含Mo 原子的活性中心，并通過氫鍵、疏水相互作用及范德華力等與活性中心周圍的氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用，與黃嘌呤之間存在競爭性抑制作用。

益生菌不僅能夠促進人體健康，而且能改善食品屬性，被越來越多地應(yīng)用于食品工業(yè)。陳沈梁等[17]從泡菜中分離得到56 株乳酸菌，研究其對嘌呤核苷的降解能力，最終篩選到1 株具有高效降解嘌呤核苷的乳酸菌，進一步的試驗證明此菌株為短乳桿菌，具有耐膽鹽、耐酸以及耐受飽腹人工胃腸液的能力，這為進一步研發(fā)功能性乳酸菌食品提供了理論依據(jù)。鄧英等[18]用短乳桿菌DM9218干預(yù)高果糖飲食誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠，結(jié)果表明：短乳桿菌DM9218 一方面可以通過改善腸屏障功能，降低內(nèi)毒素水平，從而緩解XOD 的表達及活性，另一方面由“肝-腸循環(huán)”直接降解肌苷，從而影響血清尿酸水平。牛春華等[19]從5 株植物乳桿菌中篩選出1 株UA149，具有較強的嘌呤核苷降解能力，能夠顯著降低高尿酸血癥模型大鼠血尿酸水平，降低血清XOD 活性，同時降低白三烯、血栓素和炎癥因子水平，可應(yīng)用于高尿酸血癥的預(yù)防和輔助治療。

目前研究較多的是益生菌自身對高尿酸血癥的影響，而對益生菌代謝產(chǎn)物的研究相對較少。本文將研究乳酸菌代謝產(chǎn)物對XOD 的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌 NRRLB-14768、IMAU 4005、NCL 13、SC 3-2-1、DLL-500 均為實驗室自主分離鑒定的乳酸菌菌株。

MRS 肉湯、黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜純級），上海麥克林生化科技有限公司；冰乙酸（色譜純級）、十二烷二酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四丁基氫氧化銨離子對試劑（色譜純級），上海邁瑞爾公司；二氫咖啡酸，北京天威泰達科技有限公司；4-十二烷基苯磺酸，上海賢鼎生物科技有限公司；16-羥基棕櫚酸，北京格瑞通達科技有限公司；其它試劑（均為分析純級）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS 立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-D 臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠；Multifuge X1R 高速冷凍離心機，賽默飛世爾（中國）有限公司；LC-2030高效液相色譜儀島津，日本島津公司；MS105DU電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；imark 酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD；分子模擬軟件Discovery Studio （DS）2017 R2 Client，美 國Accelrys 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 取-80 ℃冰箱保存的菌種，以2%接種量接種于10 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h 左右。以2%接種量依次傳代，取第2代培養(yǎng)液1 mL 于50 mL 培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。

1.3.2 乳酸菌代謝產(chǎn)物的獲得 取第3 代培養(yǎng)液30 mL 于離心管中，4 000 r/min 離心10 min，收集上清液，經(jīng)細菌過濾器（0.22 μm）過濾，所得無菌濾液即為乳酸菌的代謝產(chǎn)物[20]，將無菌濾液在95℃高溫條件下滅酶10 min 備用。

1.3.3 乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制XOD 效果驗證 參考宋敏杰[21]的方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取0.0100 g黃嘌呤標(biāo)品用超純水溶解，并用1 mol/L 的NaOH助溶，用50 mL 的容量瓶定容，配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。隨后所需溶液均用超純水進行稀釋，所有待測樣品過0.22 μm 濾膜，在特定的色譜條件下進行嘌呤含量的測定，從而確定代謝產(chǎn)物對XOD 抑制效果。

色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse C18 Plus（4.6 mm×250 mm × 5 μm）；流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10.0 μL；檢測波長254 nm。將超純水、冰乙酸、四丁基氫氧化銨按體積比997∶1.5∶1.5 混合作為流動相C，再與甲醇（流動相B）按95∶5 混合作為最終流動相。

試驗設(shè)計如下：空白組為黃嘌呤（880 μL）+磷酸鹽緩沖液（120 μL）；對照組為黃嘌呤（880 μL）+磷酸鹽緩沖液（40 μL）+XOD（80 μL）；試驗組：黃嘌呤（880 μL）+無菌濾液（40 μL）+XOD（80 μL）。試驗所用黃嘌呤質(zhì)量濃度均為50 μg/mL，XOD 為0.1 U/mL，XOD 作用時間為30 min，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)結(jié)束后，需將反應(yīng)管放在95 ℃水浴滅酶10 min，滅酶后用高效液相色譜法檢測體系中黃嘌呤的含量。為排除空白培養(yǎng)基的影響，將無菌濾液換成等量的培養(yǎng)基進行驗證。

1.3.4 乳酸菌代謝物成分的搜集 通過對在線數(shù)據(jù)庫PubChem（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）以及已經(jīng)出版的文獻進行檢索，對無菌濾液中的化學(xué)成分進行收集、整理。對搜集的化學(xué)物質(zhì)進行優(yōu)化，包括2D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)，加氫、能量最小化以及添加HRRMM 力場，建立無菌濾液所含成分3D 結(jié)構(gòu)的化合物庫。

1.3.5 抑制劑特性研究

1.3.5.1 pH 值排除試驗 由于乳酸菌發(fā)酵會產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸等酸類物質(zhì)，從而使上清液的pH 降低，為排除pH 值對XOD 活性的影響，對上清液的pH 值進行檢測。

1.3.5.2 有機酸排除試驗 為確定有機酸是否為抑制XOD 的活性物質(zhì)，將乳酸菌上清液使用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 為7，采用高效液相色譜法測定中和后的乳酸菌上清液對黃嘌呤氧化酶的抑制作用[22]。

1.3.6 分子對接 分子對接可以通過研究分子間相互作用從而預(yù)測分子間的結(jié)合方式，因而被廣泛地應(yīng)用于分析小分子配體與蛋白相互作用的結(jié)合機制以及進行抑制劑的篩選。參考Li 等[23]的方法，進行適當(dāng)調(diào)整。從RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb）選擇XOD 的3D 結(jié)構(gòu)（PDB ID：3NVY），去水加氫，修復(fù)不完整殘基，刪除配體，準(zhǔn)備分子對接。

XOD 的X 射線晶體結(jié)構(gòu)表明，它有兩個對稱相關(guān)的結(jié)構(gòu)域單體，是以同型二聚體形式表示的氧化還原酶，每個單體都包含一個C-末端的鉬（Mo）結(jié)構(gòu)域，包括4 個氧化還原中心、1 個中心黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔因子和1 個具有兩個鐵硫中心的N-端結(jié)構(gòu)域。XOD 含有兩個分離的底物結(jié)合位點，Mo 中心和FAD 中心。黃嘌呤的氧化發(fā)生在Mo 中心，底物氧的還原發(fā)生在FAD 中心，轉(zhuǎn)移電子產(chǎn)生超氧陰離子（O2-）或過氧化氫（H2O2）自由基[11]。

3NVY 是牛乳中的XOD 與槲皮素相結(jié)合的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)，張岑等[24]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過占據(jù)底物黃嘌呤進入XOD 活性中心的通道，抑制了XOD 對黃嘌呤的催化，從而減少了尿酸的生成。在本次分子對接過程中選擇槲皮素所在位置作為結(jié)合位點，即活性位點AC5。該結(jié)合位點共有18個氨基酸殘基結(jié)合位點：Phe1150、Ser1008、Ala1079、Arg880、Thr1010、Phe1009、Phe914、Ser876、Leu1014、Leu873、Leu648、Val1011、Phe649、Phe1013、Lys771、Pro1076、Glu802、Ala1078 在該結(jié)合位點處能與這些氨基酸殘基結(jié)合，則有抑制XOD 的可能性。

圖1 XOD 與槲皮素結(jié)合活性位點2D 示意圖Fig.1 2D schematic diagram of XOD binding active site with quercetin

將得到的XOD 晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入分子模擬軟件DS 中，并對其進行分子對接前的去水、加氫等一系列準(zhǔn)備操作。從NCBI 數(shù)據(jù)庫中收集酸類代謝產(chǎn)物的3D 結(jié)構(gòu)，并將3D 結(jié)構(gòu)作為配體，進行能量最小化，并建立分子庫。

以3NVY 作為受體蛋白，以乳酸菌代謝物為配體，以原配體結(jié)合作用位點（X：36.3141，Y：11.793，Z：17.8448） 為對接中心，以15 為對接半徑，采用配體對接工具欄的半柔性對接，并且設(shè)置參數(shù)為剛性優(yōu)化、快速篩選，其余設(shè)置為默認值進行分子對接。按打分將篩選出的乳酸菌代謝產(chǎn)物進行下一步操作。

1.3.7 黃嘌呤氧化酶抑制效果驗證 對比已經(jīng)研究出的具有XOD 抑制活性的物質(zhì)所具有的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合分子對接的打分，選出打分較高的物質(zhì)通過高效液相色譜法進行活性驗證，以黃嘌呤轉(zhuǎn)化量反映酶活性變化，通過梯度濃度反應(yīng)探索抑制率與抑制劑之間的關(guān)系。用880 μL 黃嘌呤（50 μg/mL）與80 μL XOD（0.1 U/mL）反應(yīng)作為對照，在反應(yīng)體系中分別加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品40 μL，根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品后對整個反應(yīng)體系中黃嘌呤轉(zhuǎn)化量的影響確定其抑制作用。整個反應(yīng)體系在35 ℃下反應(yīng)30 min，隨后在95 ℃條件下水浴10 min 進行滅酶。用1.3.3 節(jié)的色譜條件進行等度洗脫檢測。抑制率計算公式為：

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 使用Excel 2010 及OriginPro 8.5 對試驗中的數(shù)據(jù)進行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌代謝物對XOD 抑制效果驗證

由圖2可知，在設(shè)定的液相條件下，黃嘌呤的出峰時間為6.596 min，其峰面積為3 294 685；在相同條件下加入80 μL XOD 后黃嘌呤的峰面積明顯減?。ǚ迕娣e為1 821 383），說明在該反應(yīng)條件下XOD 具有良好的酶活，能夠催化黃嘌呤。在相同反應(yīng)體系中分別加入40 μL NRRLB-14769、IMAU 4008、DLL-500、NCL 13、SC 3-2-1 5 株乳酸菌的代謝產(chǎn)物后黃嘌呤的峰面積分別為3 222 677，3 099 157，3 096 238，2 415 234，2 161 694，可以看出5 株乳酸菌的代謝產(chǎn)物均對XOD 具有明顯的抑制作用，且抑制效果大小為NRRLB-14769>IMAU 4008>DLL-500>NCL 13>SC 3-2-1，其中菌株NRRLB-14769、IMAU 4008和DLL-500 的代謝產(chǎn)物對XOD 的抑制效果較強。由此可以得出不同乳酸菌代謝物對XOD 抑制性有顯著差異，可能是不同的乳酸菌所產(chǎn)生的代謝物質(zhì)及其含量不同影響對XOD 的抑制率。

圖2 不同乳酸菌代謝產(chǎn)物對XOD 的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of different metabolites of lactic acid bacteria on XOD

從圖3中可以看出，與不加XOD 組相比，加入XOD 組黃嘌呤的含量顯著減少。加入空白培養(yǎng)基的試驗組與對照組相比，黃嘌呤的含量沒有明顯變化，說明空白培養(yǎng)基不含有抑制XOD 的活性成分，從而說明是乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制了XOD活性。

圖3 培養(yǎng)基對XOD 的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of culture medium on XOD

2.2 乳酸菌中代謝產(chǎn)物成分收集

通過文獻收集、整理、分析，共得到乳酸菌的代謝產(chǎn)物76 種（見表1）。目前，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物在食品行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，如發(fā)酵乳制品、肉制品、泡菜、酒類飲料等，是生產(chǎn)中非常重要的發(fā)酵劑和風(fēng)味物質(zhì)。乳酸菌發(fā)酵代謝的最終產(chǎn)物包括多種酸類物質(zhì)（乳酸、乙酸、甲酸）和乙醇等[25]，具體成分因菌種不同有較大差異，本文主要研究乳酸菌的胞外代謝物。從表1中可以看出，乳酸菌代謝物除有機酸外，還含有一些氨基酸、嘌呤和嘧啶類物質(zhì)為乳酸菌生長所需要的物質(zhì)，另外甜菜堿、對香豆酸、別嘌呤醇是經(jīng)研究證明具有XOD抑制活性。

表1 乳酸菌代謝產(chǎn)物Table 1 Lactobacillus metabolites

2.3 抑制劑特性研究

乳酸菌代謝會產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，使上清液呈現(xiàn)酸性環(huán)境，為排除pH 值對XOD 活性的影響，對上清液的pH 值進行了檢測，結(jié)果顯示上清液的pH 值為4.20～4.9，有文獻[30]表明，在此pH 值條件下，XOD 的活性不受影響，說明導(dǎo)致XOD 活性降低的物質(zhì)來源于乳酸菌代謝產(chǎn)物。使用氫氧化鈉溶液將上清液的pH 值調(diào)至中性，研究上清液對XOD 的抑制作用。從圖4可以看出中和后的上清液對XOD 沒有抑制作用，而沒有中和的上清液對XOD 具有明顯的抑制作用，判斷對XOD 產(chǎn)生抑制作用的是有機酸類物質(zhì)。

圖4 pH 值對XOD 活性的影響Fig.4 Effect of pH value on XOD activity

2.4 有機酸類物質(zhì)XOD 分子對接結(jié)果

已經(jīng)判斷出上清液中的有機酸類物質(zhì)抑制了XOD 活性，將表1中的有機酸與XOD 進行分子對接，并且選擇打分較高的幾個物質(zhì)進行驗證。從表中可以看出3，4-二羥基苯基丙酸（Dihydrogen caffeic acid，DHCA）、16-羥基十六烷酸、十二烷二酸（Dodecanedioic acid，DDA）、4-十二烷基苯磺酸這4 種物質(zhì)與XOD 分子對接打分較高，處于前列。

化合物需要與XOD 結(jié)合后，才能產(chǎn)生正向或反向的作用，基于此分析DHCA、16-羥基十六烷酸、DDA、4-十二烷基苯磺酸等化合物在分子對接過程中與XOD 的結(jié)合形式。圖5為4 種化合物與XOD 結(jié)合后的2D 可視化分析圖。

圖5a 為DHCA 和XOD 的相互作用模式圖，其中DHCA 與XOD 的氨基酸殘基Ser876、Val1011、Ala1079 以及XOD 中心Mos1328 之間形成氫鍵相互作用，并與Val1011 之間形成疏水相互作用。圖5b 為4-十二烷基苯磺酸與XOD 相互作用模式圖，其中4-十二烷基苯磺酸與XOD 的氨基酸殘基Lys771 之間形成氫鍵相互作用，與Leu1014、Ser876 之間形成疏水相互作用。圖5c 為16-羥基十六烷酸與XOD 的相互作用模式圖，其中16-羥基十六烷酸與XOD 的氨基酸殘基Arg880 之間形成氫鍵相互作用。圖5d 為DDA 與XOD 的相互作用模式圖，其中DDA 與XOD 的氨基酸殘基Asn768、Ala179 以 及 XOD 中 心Mos1328 之間形成氫鍵相互作用。以上小分子與黃嘌呤氧化酶之間形成的化學(xué)鍵有助于小分子發(fā)揮作用，從而對酶產(chǎn)生一定的促進或抑制作用。

表2 分子對接結(jié)果Table 2 The results of molecular docking

圖5 二氫咖啡酸-XOD（a）、4-十二烷基苯磺酸-XOD（b）、16-羥基十六烷酸-XOD（c）和十二烷二酸-XOD（d）Mo中心結(jié)合位點2D 模式圖Fig.5 2D pattern diagram of Mo binding sites of DHCA-XOD （a），4-dodecyl benzene sulfonic acid-XOD （b），16-hydroxyhexadecanoic acid-XOD （c） and DDA-XOD （d）

2.5 黃嘌呤氧化酶抑制效果的驗證

從圖6中可以看出，16-羥基十六烷酸和DHCA 對XOD 的抑制率都是呈先上升后下降的趨勢，其中16-羥基十六烷酸在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時達到最大抑制率（90%），DHCA 在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 左右時達到最大抑制率 （約為67%）。16-羥基十六烷酸又稱16-羥基棕櫚酸，在此處表現(xiàn)出很強的XOD 抑制能力，這可能與棕櫚酸具有抗氧化性[31]相關(guān)，16-羥基十六烷酸作為棕櫚酸的衍生物可能也具有抗氧化活性。DHCA 表現(xiàn)出良好的XOD 抑制作用，同樣與其很強的抗氧化能力有關(guān)。據(jù)報道，酚類化合物具有減少自由基形成的特性，其中咖啡酸對氧自由基的生成具有良好的抑制作用，具有較強的DPPH 自由基清除能力，并且咖啡酸能在一定程度上抑制XOD 活性[9，32]。從圖6中可以看出十二烷二酸和4-十二烷基苯磺酸對XOD 的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著抑制劑質(zhì)量濃度的升高，抑制率也在增加，十二烷二酸的抑制率最終會趨于平緩，而4-十二烷基苯磺酸的抑制率緩慢上升。

圖6 16-羥基十六烷酸（a）、DHCA（b）、DDA（c）、4-十二烷基苯磺酸（d）的抑制曲線Fig.6 Inhibition curve of 16-hydroxyhexadecanoic acid （a），hydrocaffeic acid （b），dodecanedioic acid （c）and 4-dodecylbenzenesulfonic acid （d）

3 總結(jié)

本文選取實驗室保藏的5 株乳酸菌，對菌株上清液XOD 抑制性進行驗證。結(jié)果顯示，5 株菌上清液對XOD 均具有良好的抑制效果并且抑制能力大小為：NRRLB-14769>IMAU 4008>DLL-500>NCL 13>SC 3-2-1。進一步試驗證明上清液中的有機酸類物質(zhì)抑制了XOD，利用Discovery Studio 2017 R2 Client 將有機酸類代謝產(chǎn)物與XOD 的晶體結(jié)構(gòu)進行對接。根據(jù)分子對接的結(jié)果，選擇了DHCA、16-羥基十六烷酸、十二烷二酸、4-十二烷基苯磺酸4 種物質(zhì)對XOD 的抑制效果進行了驗證，結(jié)果表明這4 種物質(zhì)都對XOD 具有不同程度的抑制作用，其中16-羥基十六烷酸表現(xiàn)出良好的XOD 抑制作用。

4 展望

乳酸菌能夠改善宿主腸道菌群平衡并有效增強食用者身體健康水平，具有改善便秘、緩解腹瀉、抗腫瘤、保護口腔健康等重要身體功能，而其代謝物數(shù)以百計，其中許多生物活性物質(zhì)能夠提高產(chǎn)品的功能特性，后續(xù)試驗中將對乳酸菌代謝物進行深入的研究，期望找到能夠用于食品中的黃嘌呤氧化酶抑制劑。