大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌致犢牛腹瀉的診治

黨如意，葉 超，馮 航，馮 杰，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

腹瀉是犢牛常見的一種胃腸道疾病，通常在其出生后2 d～3 d開始發(fā)病，主要臨床表現(xiàn)為消化不良和腹瀉[1-2]。在大規(guī)模飼養(yǎng)中，犢牛腹瀉發(fā)生率高達(dá)90%～100%，病死率達(dá)50%以上，對犢牛的生長、發(fā)育、成活等具有很大影響[3-4]。犢牛腹瀉的發(fā)病原因復(fù)雜，主要有感染性因素和非感染性因素，其中感染性因素包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染等[5]。能夠引起犢牛腹瀉的致病菌主要有致病性大腸埃希氏菌[6]、蠟樣芽孢桿菌[7]、產(chǎn)氣莢膜梭菌[8]等。其中，致病性大腸埃希氏菌是引起1周齡內(nèi)犢牛腹瀉的主要致病菌，其侵入犢牛后可以釋放多種腸毒素引起腹瀉[9]。犢牛從污染的環(huán)境中攝取菌體，或者由于飼養(yǎng)管理等因素引起腸道內(nèi)環(huán)境遭到破壞、腸道菌群失調(diào)、免疫力降低，菌體大量繁殖產(chǎn)生大量毒素引起腹瀉[10]。犢牛發(fā)生腹瀉后，抵抗力下降，腸道菌群紊亂，極易誘發(fā)外源或條件性致病原感染，加劇病情和死亡[11]。

西北地區(qū)某牛場于2020年9月份開始陸續(xù)出現(xiàn)犢牛腹瀉引起的死亡，發(fā)病牛均為7日齡～10日齡，糞便帶血，且在出現(xiàn)腹瀉后3 d～5 d死亡，剖檢可見肝臟輕度腫大、邊緣泛白。2021年1月，該牛場因腹瀉死亡犢牛達(dá)20余頭。采集發(fā)病犢牛的肝臟和脾臟送西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院重大動物疫病綜合防控與凈化實驗室進(jìn)行檢測，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)診斷以及動物致病性試驗，結(jié)合病牛的臨床表現(xiàn)，最終確定為蠟樣芽孢桿菌和大腸埃希氏菌混合感染所致。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源和實驗動物 無菌采集該養(yǎng)殖場腹瀉犢牛肝臟和脾臟2份，其中1份用于總DNA的提取，置-80℃保存?zhèn)溆茫?份用于細(xì)菌分離。昆明小鼠購自中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；PCR Mix，北京市康潤生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；部分獸用藥藥敏片為本實驗室按照歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會(EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)制備；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 高壓滅菌器(YXQ-50SⅡ)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；電子天平感量，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，上海世澤生物科技有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高速低溫離心機，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；PCR儀，安諾倫(北京)生物科技有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，北京百晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 需氧性致病菌的分離與純化 將采集樣品無菌接種于50 mL/L脫纖維綿羊血瓊脂，37℃培養(yǎng)24 h，記錄菌落生長特征，挑取能使血平板溶血的單個菌落，觀察菌體形態(tài)。將初步分離的可疑菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長狀況，記錄菌落生長特征，挑取單菌落，革蘭氏染色、鏡檢，觀察記錄菌體形態(tài)。挑取上述分離培養(yǎng)得到的單菌落接種于5%脫纖維綿羊血培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果；再挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢；接種于肉湯中，在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，保菌備用。

1.2.2 厭氧性致病菌的分離與純化 取少量樣品，充分研磨，用1 mL生理鹽水稀釋，吸取100 μL稀釋液加入?yún)捬跞飧螠校?7℃培養(yǎng)18 h，收集1 mL厭氧肉肝湯培養(yǎng)物，6 000 r/min離心30 s，棄上清，用接種環(huán)蘸取少量沉淀于TSC培養(yǎng)基，厭氧環(huán)境37℃培養(yǎng)24 h，將TSC培養(yǎng)基上的菌落接種至5%脫纖維綿羊血瓊脂上，厭氧環(huán)境37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色鏡檢；接種于厭氧肉肝湯中，在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，保菌備用。

1.2.3 分子生物學(xué)診斷 利用DNA提取試劑盒分別提取需氧和厭氧條件下獲取培養(yǎng)物的DNA，以此為模板用16S rDNA基因引物進(jìn)行PCR擴增，以大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)為陽性對照。

1.2.4 動物致病性試驗 取所分離細(xì)菌培養(yǎng)物于無菌離心管中，用生理鹽水調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛鹊?.5，隨后以200 μL/只分別腹腔注射6只8周齡雄性昆明小鼠，作為試驗組；同時以200 μL/只生理鹽水腹腔注射6只8周齡雄性昆明小鼠作為對照組。一定時間后觀察小鼠狀態(tài)，如有死亡，對其進(jìn)行剖檢。

1.2.5 藥敏試驗 用藥敏紙片瓊脂擴散法[11]分別對分離的蠟樣芽孢桿菌(10種抗生素)和大腸埃希氏菌(19種抗生素)進(jìn)行藥敏試驗。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷

病牛精神沉郁，喜躺臥，吮乳減少或者廢絕，部分犢牛還出現(xiàn)瘤胃鼓氣并呈現(xiàn)反復(fù)發(fā)作，平均體溫在37.5℃左右。病牛排糞量減少，排便次數(shù)增加，初期排不成形、黃或白色軟糞，隨著病癥加重，病牛排青灰色稀糞，內(nèi)含黏液、血液等混雜物。聽診病牛心率增加、心音增強、腸蠕動音高朗；眼球凹陷。發(fā)病后期犢牛站立不穩(wěn)，全身戰(zhàn)栗，瀕死期倒地，四肢作劃水狀。

2.2 細(xì)菌學(xué)診斷

需氧條件下獲取培養(yǎng)物鏡檢發(fā)現(xiàn)為大量革蘭氏陽性桿狀菌和少量中等大小的革蘭氏陰性桿狀菌；厭氧條件獲取的培養(yǎng)物在TSC培養(yǎng)基上出現(xiàn)單一白色菌落，鏡檢發(fā)現(xiàn)為單一中等大小的革蘭氏陰性桿狀菌，形態(tài)與需氧培養(yǎng)物中的革蘭氏陰性桿菌一致。

2.3 分子生物診斷

分別對需氧和厭氧培養(yǎng)物DNA進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小均為1 386 bp(圖1)。然后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)需氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的革蘭氏陽性菌擴增產(chǎn)物和NCBI中的1株蠟樣芽孢桿菌的同源性為100%；需氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌和厭氧環(huán)境下培養(yǎng)的革蘭氏陰性擴增產(chǎn)物與大腸埃希氏菌ATCC 44102的同源性都為99.89%，判定不同條件下分離的2株革蘭氏陰性菌為相同的克隆株。

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；2.陽性對照；3.陰性對照；4.需氧型革蘭氏陽性菌DNA擴增產(chǎn)物；5.需氧型革蘭氏陰性菌DNA擴增產(chǎn)物；6.厭氧型革蘭氏陰性菌DNA擴增產(chǎn)物

2.4 動物致病性試驗

分離的大腸埃希氏菌培養(yǎng)物接種小鼠36 h全部死亡，剖檢，取肝臟和腸道樣本涂片鏡檢，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性桿狀菌；分離的臘樣芽孢桿菌培養(yǎng)物接種小鼠24 h后全部死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟腫大充血，肝臟涂片鏡檢，可觀察到中等大小革蘭氏陽性桿狀菌。

2.5 藥敏試驗

按照EUCAST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，分別對分離的致病性大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行藥敏試驗(表1、表2)。

表1 大腸埃希氏菌藥敏試驗結(jié)果

表2 蠟樣芽孢桿菌藥敏試驗結(jié)果

3 討論

在大規(guī)模飼養(yǎng)中，犢牛腹瀉是犢牛常見的胃腸道疾病，具有很高的發(fā)病率[1,12]。該牛場發(fā)病犢牛在發(fā)病初期出現(xiàn)明顯的排便次數(shù)增加，隨后病牛排青灰色惡臭稀糞，內(nèi)含黏液、血液等混雜物，最后發(fā)病犢牛無法站立，瀕死期倒地，整個發(fā)病過程持續(xù)3 d～5 d左右。采集發(fā)病犢牛的肝脾在需氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)得到一株致病菌，后經(jīng)分子生物學(xué)診斷確定為致病性蠟樣芽孢桿菌。該致病菌屬于革蘭氏陽性、β溶血性的桿狀細(xì)菌，犢牛感染會引起水樣腹瀉和腹痛，很少伴有嘔吐[7]，該癥狀和發(fā)病犢牛癥狀相符。另外，發(fā)病犢牛病情進(jìn)展較快，并出現(xiàn)腹痛，開始懷疑為魏氏梭菌感染，但是對采集的肝脾進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有單一白色菌落，和產(chǎn)氣莢膜梭菌的黑色伴隨白圈的菌落不符。隨后，對厭氧條件培養(yǎng)物進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，序列比對確定為大腸埃希氏菌。致病性大腸埃希氏菌感染多發(fā)生在10日齡以內(nèi)的犢牛，特別是產(chǎn)后的1 d～3 d內(nèi)，四季均可發(fā)生。臨床上致病性大腸埃希氏菌分為敗血型、腸毒素型和腸型[13]，其中產(chǎn)腸毒素型大腸埃希氏菌感染犢牛腹瀉最為明顯，病牛排黃色惡臭糞便，繼而出現(xiàn)淺灰色水樣腹瀉，混有血塊、血絲和氣泡[14]。產(chǎn)腸毒素型大腸埃希氏菌的癥狀和該牛場發(fā)病犢牛的癥狀也較為相符。

綜上所述，根據(jù)流行病學(xué)特點、臨床表現(xiàn)、病理剖檢以及實驗室診斷，確診該牛場犢牛腹瀉是由致病性蠟樣芽孢桿菌和致病性大腸埃希氏菌混合感染。致病性細(xì)菌引起的犢牛腹瀉發(fā)病率較高，本研究對該病的防治提出以下建議：首先對有臨床癥狀的犢牛進(jìn)行隔離，以對癥治療、解毒保肝為原則，結(jié)合藥敏試驗，選擇對致病性大腸埃希氏菌和蠟樣芽孢桿菌分別敏感的抗菌藥物(如頭孢噻呋鈉聯(lián)合恩諾沙星)各一種進(jìn)行，切忌多種抗菌藥物同時使用。然后配合中藥處方：黃柏、黃芩、豬苓、澤瀉、車前子、茯苓、白芍、神曲、麥芽、山楂、石榴皮、黨參、當(dāng)歸、熟地、甘草各10 g，水煎，口服2次～3次。對于體溫下降明顯、脫水嚴(yán)重的犢牛，給予抗生素治療的同時配合50 g/L葡萄糖生理鹽水、復(fù)方氯化鈉、維生素B1、碳酸氫鈉等，每天2次靜脈注射[15]。保持牛舍通風(fēng)保暖和干燥，徹底清理廄舍內(nèi)所有病牛排泄物和被污染的墊料、用具等，進(jìn)行全面消毒。通過采取以上處理措施，該牛場犢牛病情得到有效控制，未再出現(xiàn)新的病例，被隔離病牛經(jīng)過治療也基本康復(fù)。

目前，在我國的養(yǎng)牛地區(qū)和規(guī)模養(yǎng)殖場，犢牛腹瀉的發(fā)生很普遍，且一旦發(fā)生，極易引起死亡，使養(yǎng)牛戶或養(yǎng)牛企業(yè)蒙受重大損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，故需引起足夠重視。希望本文所做工作能對養(yǎng)牛戶或養(yǎng)殖企業(yè)提供參考。