Mfn2在不同繁殖生理時(shí)期牦牛卵巢和輸卵管中的表達(dá)及定位

張博寧，張同享，何翃閎，王 彪，任鈺昕，張 鑒，潘陽(yáng)陽(yáng)，王立斌，王強(qiáng)龍，閆翠霞，崔 燕，余四九，徐庚全*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070；2.中華人民共和國(guó)煙臺(tái)海關(guān)，山東煙臺(tái) 264000)

線粒體融合蛋白2(Mitofusin 2,Mfn2)位于線粒體外膜，由757個(gè)氨基酸殘基組成，在調(diào)節(jié)線粒體外膜融合、維持其形態(tài)和功能等方面具有重要作用[1]。20世紀(jì)90年代，有學(xué)者在大鼠血管平滑肌細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了一種新的與血管平滑肌細(xì)胞增殖或高血壓相關(guān)的基因[2]。隨后克隆出Mfn2基因，并發(fā)現(xiàn)與線粒體融合蛋白1(Mitofusin 1,Mfn1)作用類似，故被定名為Mfn2[3]。視神經(jīng)萎縮蛋白1 分布在于線粒體內(nèi)膜上，其和Mfn1以及Mfn2共同控制線粒體的融合[4]。視神經(jīng)萎縮蛋白1的缺失會(huì)導(dǎo)致其融合功能受阻甚至下降以及間接導(dǎo)致片段化，也會(huì)造成其內(nèi)膜結(jié)構(gòu)嵴異常[5]。Mfn N端的GTP酶結(jié)構(gòu)域及與RAS結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，對(duì)于Mfn發(fā)揮特異性功能有重要意義[6]。已有研究表明，Mfn2在哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。

牦牛是牛屬動(dòng)物，屬于珍稀畜種資源，是青藏高原地區(qū)的主要家畜[8]。Mfn2在哺乳動(dòng)物線粒體融合、雄性不育和胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用，但尚未見(jiàn)關(guān)于Mfn2在牦牛相關(guān)器官中表達(dá)和定位的報(bào)道。本試驗(yàn)以不同繁殖生理時(shí)期牦牛卵巢和輸卵管為試驗(yàn)材料，用RT-qPCR、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)方法檢測(cè)Mfn2在不同繁殖生理時(shí)期牦牛卵巢和輸卵管中的表達(dá)及定位，為進(jìn)一步探討Mfn2在牦牛生殖生理調(diào)控中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 選年齡相近、處于不同繁殖生理時(shí)期健康牦牛15頭，分為卵泡期、黃體期以及妊娠期3組，每組5頭，動(dòng)物處死后，迅速打開(kāi)腹腔，分別采集處于卵泡期(有優(yōu)勢(shì)卵泡)、黃體期(可見(jiàn)新鮮黃體)以及妊娠期(子宮中有胎兒，胎兒約長(zhǎng)15 cm)的卵巢和輸卵管樣品，將采集到的樣品按照不同繁殖生理時(shí)期和不同部位分成6組2份，1份置于液氮中運(yùn)回甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，用于RT-qPCR和Western blot試驗(yàn)；另1份樣品修剪，固定于40 mL/L多聚甲醛溶液，用于免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；4×蛋白上樣緩沖液、氨芐青霉素，北京Solarbio科技有限公司產(chǎn)品；Western blot所用試劑，武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品；HistostainTM-Plus Kits、羊抗兔IgG/HRP 抗體，北京Bioss生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Mfn2兔多克隆抗體，武漢proteintech生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀，德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品；熒光定量 PCR 儀，瑞士Roch公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠電泳槽、高電流高電壓通用電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；組織切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、自動(dòng)脫水機(jī)，美國(guó)Leica公司產(chǎn)品；-80℃超低溫冰箱，中國(guó)海爾集團(tuán)產(chǎn)品；顯微照相系統(tǒng)Olympus DP71，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量分析 總RNA提取與cDNA合成 將6個(gè)組的組織樣品液氮研磨后提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA，置于-20℃保存。1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中牛Mfn2基因和β-actin基因的mRNA序列，通過(guò)Primer6.0設(shè)計(jì)引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成引物。

表1 引物信息

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)Mfn2 mRNA的表達(dá) 反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，56℃ 15 s，72℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)，每組數(shù)據(jù)做4個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。反應(yīng)體系：TB Green? Premix ExTaqTM Ⅱ 10 μL，模板cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，dd H2O 6.4 μL，共20 μL。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè) 液氮中研磨組織后，稱取100 mg，加入RIPA 1 mL，PMSF 10 μL，振蕩裂解后離心，吸取上清。取蛋白樣品90 μL加入4×上樣緩沖液30 μL混合，100℃ 10 min 金屬浴變性后放置-20℃保存。配制80 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠，SDS-PAGE凝膠電泳，變性蛋白經(jīng)電泳分離后，根據(jù)Mfn2蛋白(87 ku)和β-actin蛋白(42 ku)大小切膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜上， 50 g/L脫脂奶粉中室溫下封閉2 h。一抗 Mfn2 (1∶1 000 稀釋)中4℃孵育過(guò)夜，PBST浸洗6次，每次5 min，二抗(1∶1 000稀釋)中室溫孵育1 h；PBST浸洗膜6次，每次10 min。在膜上滴加ECL發(fā)光液，GEAI600成像系統(tǒng)掃描目的條帶。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Mfn2蛋白定位 取充分固定后的組織塊，脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，在檸檬酸鹽緩沖液中，高火煮沸后轉(zhuǎn)中火10 min，室溫冷卻。滴加3% H2O2，37℃作用10 min。擦干，滴加A液 封閉，室溫孵育15 min；滴加一抗(1∶200稀釋)，對(duì)照組用PBS代替一抗，4℃孵育過(guò)夜；滴加B液，37℃孵育10 min；滴加C液，37℃孵育15 min; 加DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，室溫晾干后采用 Olympus(DP71,日本)拍照系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用SPSS 25.0對(duì)Mfn2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。Mfn2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算?；叶戎涤肐mage J 軟件分析，每組重復(fù)5次，計(jì)算Mfn2蛋白的相對(duì)表達(dá)量(目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值),GraphPad Prism 8.4繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果

2.1 不同繁殖生理時(shí)期牦牛卵巢和輸卵管中Mfn2 mRNA的表達(dá)

Mfn2 mRNA在6個(gè)組的組織樣品中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。檢測(cè)的組織中Mfn2 mRNA均有表達(dá)且存在差異，Mfn2 mRNA在妊娠期卵巢和輸卵管中表達(dá)量最高(P<0.05)，其次為黃體期的卵巢和輸卵管(P<0.05)，卵泡期的卵巢和輸卵管最低(P<0.05)。

圖1 Mfn2 mRNA在卵巢和輸卵管中的相對(duì)表達(dá)量

2.2 不同繁殖生理時(shí)期牦牛卵巢和輸卵管中Mfn2蛋白的表達(dá)

Mfn2蛋白在組織中的表達(dá)情況見(jiàn)圖2和圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mfn2蛋白在組織中均有所表達(dá)。在卵巢組織中(圖3左)，妊娠期最高，與黃體期和卵泡期差異顯著(P<0.05)，黃體期與卵泡期差異顯著(P<0.05)。而在輸卵管中(圖3右)，黃體期最高，與妊娠期差異顯著(P<0.05)；在卵泡期次之，與妊娠期差異顯著(P<0.05)，與黃體期差異不顯著(P>0.05)。而在輸卵管中，Mfn2蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量不一致。

1.卵泡期卵巢；2.黃體期卵巢；3.妊娠期卵巢；4.卵泡期輸卵管；5.黃體期輸卵管；6.妊娠期輸卵管

圖3 Mfn2蛋白在卵巢和輸卵管中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Mfn2蛋白組織定位

Mfn2蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色(圖4)。Mfn2在卵巢上的表達(dá)(圖4A、B、D、E)主要分布在卵泡膜(TF)、黃體細(xì)胞(CL)、生殖上皮(GE);Mfn2在輸卵管上的表達(dá)(圖4G、H)主要分布在黏膜上皮(EM)和肌層。

A、B、D、E、G、H.陽(yáng)性表達(dá)；C、F、I.陰性對(duì)照；A、B、C、D、E、F.卵巢；G、H、I.輸卵管；CL.黃體細(xì)胞；EM.黏膜上皮；FC.卵泡腔；GE.生殖上皮；SG.顆粒層；TF.卵泡膜

3 討論

Mfn2除了在維持線粒體形態(tài)完整和調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)功能外，Mfn2還參與卵泡的發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟。本試驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Mfn2在卵巢上主要分布在卵泡膜、黃體細(xì)胞以及生殖上皮，在輸卵管上主要分布在黏膜上皮和肌層。研究發(fā)現(xiàn)Mfn2廣泛表達(dá)于大鼠卵巢顆粒細(xì)胞、濾泡液、內(nèi)層卵泡膜細(xì)胞、黃體和卵巢間質(zhì)，但在外層卵泡膜細(xì)胞表達(dá)弱[9]。這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Mfn2 mRNA和蛋白在不同繁殖生理時(shí)期牦牛卵巢中均有表達(dá)，妊娠期最高，黃體期次之，卵泡期最低。黃體作為哺乳動(dòng)物重要的內(nèi)分泌腺，其分泌的孕酮(P4)和雌二醇(E2)對(duì)子宮分泌有促進(jìn)作用。在黃體期和妊娠期，孕激素濃度明顯上升[10]，此時(shí)Mfn2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于妊娠期，Mfn2 mRNA和蛋白在不同年齡階段的小鼠卵巢組織中均有表達(dá)，并且老齡組Mfn2表達(dá)水平顯著低于青年組，Mfn2表達(dá)水平可能參與卵巢功能的維持[11]。

輸卵管不僅是類固醇激素的靶器官外，而且還是精卵結(jié)合受精的主要部位。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Mfn2 mRNA和蛋白在不同繁殖生理時(shí)期的牦牛輸卵管中均有表達(dá)，Mfn2 mRNA在妊娠期最高，黃體期次之，卵泡期最低。但Mfn2蛋白在黃體期最高，妊娠期最低。本試驗(yàn)結(jié)果在輸卵管中出現(xiàn)了基因和蛋白表達(dá)差異，這可能與兩種方法的敏感性、RNA或者蛋白在組織中的穩(wěn)定性有關(guān)，如果輸卵管中Mfn2蛋白穩(wěn)定性差，則可能會(huì)導(dǎo)致蛋白表達(dá)降低，RNA表達(dá)反而上調(diào)的情況[12]。此外，Mfn2還可能受其他因素的調(diào)控，如Migal/2 除了調(diào)節(jié)線粒體融合，還參與線粒體活性以及代謝水平的調(diào)節(jié)[13]；皮質(zhì)酮通過(guò)調(diào)節(jié)Mfn2表達(dá)進(jìn)而損傷線粒體并促使細(xì)胞凋亡[14]；BMSCs可調(diào)節(jié)Mfn2的表達(dá)以及改善線粒體功能[15]。高糖高脂可使線粒體融合蛋白Mfn2的表達(dá)降低[16]；Mfn2的基因和蛋白表達(dá)水平隨激素水平上升而上升[17]。此外，Mfn2在妊娠期牦牛的輸卵管中的表達(dá)差異可能還與年齡有關(guān)，其真正的原因還待進(jìn)一步研究。

Mfn2在不同繁殖生理時(shí)期的牦牛卵巢和輸卵管中均有表達(dá)且存在差異，Mfn2蛋白定位在卵巢卵泡膜、黃體細(xì)胞、生殖上皮以及輸卵管黏膜上皮和肌層，因此，Mfn2可能與牦牛的卵巢功能維持等過(guò)程有關(guān)，為研究牦牛生殖生理提供了理論基礎(chǔ)。