內(nèi)毒素對雌性小鼠繁殖性能指標的影響

嚴杜建，安利彥，謝丹陽，李高蕓，林彭楚彬，吳晨晨*

(1.阿克蘇職業(yè)技術學院，新疆阿克蘇 843000；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；3.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830000)

內(nèi)毒素(endotoxin)是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，也叫脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，也是其他微生物(如立克次氏體、衣原體、螺旋體等)細胞璧中的結構成分。脂多糖分為3部分，“O”特異性側鏈(也稱“O”抗原)、核心多糖及類脂體A，類脂體A作為脂多糖的毒性成分在內(nèi)毒素免疫中起了重要的作用。內(nèi)毒素一方面會直接影響動物繁殖性能，使動物胚胎早期死亡、發(fā)育緩慢，產(chǎn)出的胎兒體質(zhì)差、死亡率高等；另一方面會通過發(fā)生一系列的免疫反應，間接影響畜禽繁殖性能。有關內(nèi)毒素的研究主要集中于免疫性能的影響。本次試驗以小鼠為模型，旨在研究內(nèi)毒素對雌性小鼠繁殖性能的影響，為減少生產(chǎn)中畜禽體內(nèi)內(nèi)毒素對其繁殖性能的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡體重30 g左右的昆明小鼠，雌性30只，雄性15只，購于西安交通大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 脂多糖，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；小鼠分泌性免疫球蛋白A(sIgA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠脂多糖(LPS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠促卵泡素(FSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠促黃體生成素(LH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠雌二醇(E2)和孕酮(P4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒均為晶美公司產(chǎn)品；全波段酶標儀為Tecan公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組和樣品收集 所有小鼠在購入后適應環(huán)境7 d，然后將雌性小鼠分為對照組15(0.01 mol/L PBS)，染毒組15只(LPS 1 mg/kg)進行灌胃處理。灌胃內(nèi)毒素第8天將雌性小鼠與正常雄性小鼠合籠并確定妊娠情況。小鼠分籠后開始記錄雌性小鼠的采食量和體重。雌性小鼠分娩后5 d和15 d，記錄仔鼠存活率、體長、窩重、畸形和死胎等；并收集母鼠血液、子宮、回腸、結腸和仔鼠的腸道，快速冷凍于液氮中，置-80℃保存用于ELISA檢測LPS和sIgA,收集血清用ELISA的方法檢測生殖激素E2、P4、FH和FSH。

1.2.2 ELISA檢測 在收集到的子宮、回腸、結腸和仔鼠腸道中分別加入1 mL的PBS(pH=7.4)，用勻漿器將標本勻漿充分，置于2 mL的離心管中離心25 min (3 000 r/min)，收集上清液于另一干凈離心管中備用。將收集的血清從4℃冰箱中取出，備用，后續(xù)操作方法見試劑盒說明書。

1.2.3 統(tǒng)計分析 用GraphPad Prism 8計算并檢驗(t檢驗)組間數(shù)據(jù)的顯著性，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。結果中P值小于0.05差異顯著(*P<0.05)，P值小于0.01差異極顯著(**P<0.01)。

2 結果

2.1 內(nèi)毒素對雌性小鼠繁殖性能指標的影響

雌性小鼠妊娠期間每日平均采食量與平均體重呈現(xiàn)逐步增長的狀態(tài)。對照組與染毒組的平均體重差異不顯著(P>0.05)；對照組的平均采食量顯著高于染毒組(P<0.05)(圖1)。分娩后5 d，染毒組新生仔鼠的死亡率顯著低于對照組(P<0.05)， 染毒組雌性小鼠新生仔鼠數(shù)量、新生仔鼠體重與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)，對照組仔鼠平均出生體長顯著性的高于染毒組(P<0.05)(圖2)。

A.母鼠平均體重對比；B.平均體重變化趨勢；C.母鼠每日平均采食量對比；D.母鼠平均每日采食量變化趨勢

圖2 新生仔鼠死亡率(A)，雌性小鼠的產(chǎn)仔數(shù)(B)，仔鼠平均出生體重(C)，仔鼠平均初生體長(D)

2.2 內(nèi)毒素對母鼠和仔鼠體內(nèi)組織LPS與sIgA的影響

分娩后5 d，結腸中的LPS含量，對照組結腸、回腸和子宮組織LPS的含量與染毒組無顯著性差異(P>0.05)；仔鼠腸道的LPS含量，染毒組極顯著高于對照組(P<0.01)。分娩后15 d，結腸中的LPS含量，對照組結腸、回腸和子宮組織LPS的含量顯著高于染毒組(P<0.05)；仔鼠腸道的LPS含量，染毒組極顯著高于對照組(P<0.05)。分娩后5 d，結腸中的sIgA含量，對照組結腸和子宮組織sIgA含量與染毒組無顯著性差異(P>0.05)；回腸中的sIgA含量，染毒組極顯著高于對照組(P<0.01)。分娩后15 d，對照組結腸和回腸的sIgA含量與染毒組無顯著性差異(P>0.05)；子宮中的sIgA含量，對照組極顯著高于染毒組(P<0.01)；仔鼠腸道中的sIgA含量，染毒組極顯著高于對照組(P<0.01)(圖3)。

圖3 分娩后5 d和15 d對照組與染毒組小鼠各組織的LPS和sIgA含量

2.3 內(nèi)毒素對母鼠生殖激素水平的影響

分娩后5 d，血清中E2和P4的含量，對照組與染毒組差異不顯著(P>0.05)；血清中的LH含量，對照組顯著高于染毒組(P<0.05)；血清中的FSH含量，對照組顯著高于染毒組(P<0.05)。分娩后15 d，血清中E2和P4的含量，對照組與染毒組差異不顯著(P>0.05)；血清中的LH含量，對照組顯著高于染毒組(P<0.05)；血清中的FSH含量，對照組顯著高于染毒組(P<0.05)(圖4)。

A.分娩5 d和15 d后E2含量；B.分娩5 d和15 d后P4含量；C.分娩5 d和15 d后LH含量；D.分娩5 d和15 d后FSH含量

3 討論

內(nèi)毒素干預雌性小鼠會使卵母細胞和胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響[1]。本試驗發(fā)現(xiàn)對照組仔鼠出生后5 d和15 d對照組存活率顯著高于染毒組。分娩后5 d，染毒組仔鼠存活率差和仔鼠呈弱胎。內(nèi)毒素進入小鼠體內(nèi)后，蓄積在腸道中，當一定量時突破腸道屏障，進入循環(huán)系統(tǒng)。隨著血液的循環(huán)卵泡發(fā)育受到影響，卵子排出困難，受孕率下降。內(nèi)毒素的免疫刺激下，所產(chǎn)生的免疫應答在某些方面也會改變機體的代謝，飼料利用率下降[2]。內(nèi)毒素作用下小鼠的采食量下降、飼料利用率下降，間接導致小鼠繁殖性能下降[3]。本試驗通過ELISA檢測雌性小鼠在分娩后5 d和15 d的生殖激素水平，染毒組的E2含量和P4含量相較于對照組無顯著差異，而FSH與LH的含量顯著高于對照組。生殖激素促進生殖器官的發(fā)育成熟，包括卵子的產(chǎn)生、排出、精子的產(chǎn)生、受精、著床、妊娠及泌乳等一系列生殖過程。LPS對卵巢顆粒細胞具有增促作用，而E2和P4與卵巢顆粒細胞關系非常密切，顆粒細胞會分泌雌激素，然后促進雌性動物發(fā)情和卵泡生長，形成黃體后能夠分泌孕激素，維持妊娠[4]。LPS會通過下丘腦-垂體-性腺軸，使正常的激素調(diào)控發(fā)生紊亂，影響性腺功能，同時抑制E2、FSH、LH的分泌，促進P4分泌。50 μg/mL的LPS濃度下能促進雌激素的合成和分泌[5]。本研究注射0.3 mL的1 mg/kg LPS溶液產(chǎn)生的影響，結果與相關研究有部分差異，其中是否是劑量的原因有待進一步探究。

仔鼠的回腸中，染毒組LPS的含量極顯著高于對照組，說明胚胎在子宮中發(fā)育時受到了內(nèi)毒素的影響。分娩后5 d，雌性小鼠的結腸和回腸中LPS含量都高于對照組，表明內(nèi)毒素進入機體后，會在腸道內(nèi)蓄積，當腸道內(nèi)毒素蓄積過多就會突破腸道屏障，進入循環(huán)系統(tǒng)。分娩后15 d，母鼠子宮中的LPS含量升高，這是由于內(nèi)毒素已經(jīng)穿過腸道屏障侵入到其他的組織器官中蓄積到了子宮中[6]。內(nèi)毒素入侵機體直接影響到免疫系統(tǒng)，所以sIgA的變化與LPS的含量有關。胎兒在子宮內(nèi)發(fā)育成熟離開母體后，便暴露于存在著許多抗原的環(huán)境中。胎兒出生后，必須從母體那里獲得被動免疫(即免疫球蛋白)，在本試驗中，分娩后5 d，染毒組結腸、回腸、仔鼠腸道sIgA的含量高于對照組，在回腸和仔鼠腸道差異極顯著；分娩后15 d，sIgA的含量呈下降趨勢；雌性小鼠的子宮中，sIgA從分娩后5 d到15 d呈現(xiàn)上升的趨勢。結合LPS含量的變化，可能是因為腸道內(nèi)的LPS含量減少，使機體免疫應答正在逐漸減弱，腸黏膜中主要的免疫球蛋白-腸黏膜第一道防線的sIgA含量也隨之降低[7-9]。進而也可以推斷，仔鼠腸道內(nèi)的sIgA大多是從胎盤傳遞而來，后期的哺乳會傳遞一部分免疫球蛋白，子宮中內(nèi)毒素含量越來越高，也就導致了子宮的sIgA含量逐步升高。

綜上所述，給小鼠注射0.3 mL的1 mg/kg的LPS溶液時，會使小鼠采食量和體重下降，出現(xiàn)難產(chǎn)，產(chǎn)出弱胎、死胎、畸形胎等，嚴重影響了小鼠的繁殖性能。此外，sIgA的濃度隨著LPS含量的變化而改變，當LPS含量高時，sIgA的含量也有一定的升高(激活了免疫應答)，間接的影響了小鼠的繁殖性能。其中染毒組FSH與LH的含量分泌紊亂進一步加劇繁殖性能的降低。但LPS如何致小鼠繁殖性能降低的發(fā)病機理還有待進一步深入研究。