雞源4種病原菌的分離鑒定及滅活疫苗的研制

高文娟，李世瑛，邢小勇，柳紀(jì)省，胡永浩*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅蘭州 730030)

禽沙門氏菌病、大腸桿菌病和禽霍亂是世界各地養(yǎng)禽業(yè)主要細(xì)菌性傳染病[1]。既可以單獨(dú)感染禽類，也可以與其他病原菌混合感染引起禽類發(fā)病[2]。沙門氏菌血清型大約有2 600多種[3-4]。雞白痢和雞傷寒分別是由雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌感染引起的，兩種病原菌的混合感染引起病雞全身性疾病。大腸埃希氏菌主要感染4周齡～6周齡的雞,患病雞臨床癥狀主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、輸卵管炎和卵黃性腹膜炎等[5]。禽霍亂又稱為禽出血性敗血病、禽巴氏桿菌病，肉雞潛伏期為2 d～9 d，患病雞主要表現(xiàn)為食欲不振、羽毛松亂、精神萎靡、飲水量減少、發(fā)熱和排灰綠色糞便等癥狀。

制備安全有效的疫苗是一種行之有效的預(yù)防措施。由于不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)多種細(xì)菌混合感染以及流行的致病菌優(yōu)勢(shì)血清型存在差異，而疫苗的抗原血清型與病原菌的血清型越吻合，其免疫效果越好[6-7]。故采用當(dāng)?shù)亓餍胁≡膬?yōu)勢(shì)血清型制備多聯(lián)滅活疫苗，對(duì)于當(dāng)前禽常見細(xì)菌病的防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究從張掖地區(qū)多個(gè)規(guī)模化養(yǎng)禽場(chǎng)分離到4種病原菌，經(jīng)分離鑒定分別為雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、禽致病性大腸埃希氏菌和多殺性巴氏桿菌，用此4種病原菌研制出三聯(lián)四價(jià)滅活疫苗，以白羽肉雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行疫苗的安全性試驗(yàn)和免疫保護(hù)試驗(yàn)，為有效預(yù)防張掖地區(qū)雞白痢、雞傷寒、大腸桿菌病和禽霍亂提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 甘肅省張掖市肉雞飼養(yǎng)場(chǎng)前期雛雞出現(xiàn)精神萎靡、厭食、腹瀉并出現(xiàn)死亡癥狀,無菌條件下取病死雞的心血、肝臟、脾臟、肺臟和腸道組織樣品共150份。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡白羽肉雞420只、14日齡白羽肉雞20只，購(gòu)自張掖某白羽肉雞種雞場(chǎng),健康昆明系小鼠30只，體重為18 g～22 g，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.1.3 主要試劑 綿羊血瓊脂平板按常規(guī)方法配置，營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、TSB培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒，均為索萊寶生物科技有限公司(北京)產(chǎn)品；細(xì)菌生化反應(yīng)管，杭州濱河微生物試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000 和PCR ExTaq酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；賽彼科ISA206佐劑，賽彼科(上海)特殊化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；甲醛等其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 PCR儀、核酸電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；低溫高速離心機(jī)、組織破碎儀、微量移液槍，均為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；低溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、培養(yǎng)箱及水浴鍋，均為北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海南榮實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海躍平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯高速攪拌器，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢 無菌環(huán)境下分別取采集的心血、肝臟、脾臟、肺臟和腸道組織樣品劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)特性。挑取優(yōu)勢(shì)菌落反復(fù)劃線接種培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，直至得到純化的菌落。將純化后的菌株分別接種于瓊脂斜面，4℃保存?zhèn)溆?。分別挑取純化后的單一菌落對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察染色特性。

1.2.2 生化試驗(yàn) 挑取初步分離的純培養(yǎng)物接種于微量生化反應(yīng)管，觀察并記錄結(jié)果，并結(jié)合菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)，判斷分離菌屬性。

1.2.3 16S rRNA分子鑒定、同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將純化后的細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯和胰蛋白胨大豆肉湯，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h～16 h后，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，以提取的各分離株DNA為模板分別擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因，用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：AAAGGAGGTGATCCAGCC，反應(yīng)總體系為：25 μL ExTaq酶混合物，上、下游引物各1.5 μL，2 μL模板DNA，ddH2O補(bǔ)至總體系為50 μL；反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，擴(kuò)增產(chǎn)物送至金唯智(天津)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，確定分離菌株的種類。選取同源性較高的分離菌株的16S rRNA序列，使用MEGA×軟件基于N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstraps重復(fù)檢驗(yàn)1000次,確定各菌株在分類學(xué)上的地位。

1.2.4 致病性試驗(yàn) 將雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、禽致病性大腸埃希氏菌和多殺性巴氏桿菌分離株分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h～22 h，通過平板計(jì)數(shù)并調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL，將25只健康小鼠分為5組，1組～4組為試驗(yàn)組，第5組為對(duì)照組，依次將上述4種純培養(yǎng)物腹腔注射健康小鼠，每只注射0.2 mL，對(duì)照組注射0.2 mL PBS，觀察小鼠的死亡情況并進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.2.5 半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定 將14日齡雛雞隨機(jī)分為5組，每組8只，1組～4組為試驗(yàn)組，第5組為對(duì)照組。用無菌PBS調(diào)整各分離菌株純培養(yǎng)物濃度，依次將各濃度純培養(yǎng)物(2×109、2×108、2×107、2×106CFU/mL)以0.2 mL腹腔注射14日齡雛雞，對(duì)照組注射無菌PBS，觀察雛雞死亡情況，用改良寇氏法[8]計(jì)算雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、禽致病性大腸埃希氏菌和多殺性巴氏桿菌的LD50。

1.2.6 疫苗制備 將分離的雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、禽致病性大腸埃希氏菌和多殺性巴氏桿菌菌液作為研制滅活疫苗的種子液，分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，收集菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)和雜菌檢驗(yàn)，使菌液濃度達(dá)到2×109CFU/mL,然后加入終濃度為3 mL/L的甲醛溶液，置37℃、100 r/min搖床中滅活24 h,吸取100 μL滅活后的菌液涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，置于37℃溫箱中培養(yǎng)48 h，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，若無細(xì)菌生長(zhǎng)說明本次滅活完全。無菌檢驗(yàn)合格后將制備的抗原按一定的比例加入ISA 206佐劑進(jìn)行乳化，制成水包油包水滅活疫苗。

1.2.7 疫苗物理性狀檢驗(yàn)

1.2.7.1 黏度測(cè)定 在室溫下，用出口內(nèi)徑為1.2 mm的吸管吸取1 mL乳劑，記錄垂直向下流出0.4 mL乳劑所需的時(shí)間。

1.2.7.2 穩(wěn)定性測(cè)定 將疫苗以3 000 r/min離心15 min，觀察疫苗的水相析出量；且將疫苗37℃放置21 d，觀察是否分層。

1.2.8 疫苗的無菌檢驗(yàn) 無菌狀態(tài)下，將制備好的疫苗涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上，設(shè)置3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)48 h，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2.9 疫苗的安全性檢驗(yàn) 分別取10只1日齡和10只14日齡的雛雞，按照正常免疫劑量的兩倍進(jìn)行免疫接種，1日齡雛雞按0.2 mL/只、14日齡雛雞按0.4 mL/只頸部皮下注射免疫，免疫接種后繼續(xù)飼養(yǎng)2周，觀察雞接種部位、精神狀況有無異常及是否出現(xiàn)死亡。

1.2.10 疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將50只1日齡雞隨機(jī)分為5組，每組10只，4個(gè)免疫組接種疫苗進(jìn)行免疫，二免后第14天進(jìn)行攻毒，用本試驗(yàn)分離出的雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、禽致病性大腸埃希氏菌和多殺性巴氏桿菌攻毒，攻毒量為10 LD50，攻毒后觀察各組雞的死亡率。

1.2.11 疫苗的免疫效果 1日齡白羽肉雞隨機(jī)分為3組，試驗(yàn)組1組，100只白羽肉雞，對(duì)照組2組，每組50只，分別為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照組。將試驗(yàn)組中每只雞頸部皮下注射0.1 mL滅活疫苗，第1次免疫間隔14 d后進(jìn)行二免。陽性對(duì)照組全程使用抗生素(4 d～6 d黃霉素+金霉素，26 d～28 d鹽酸大觀霉素，飼料中全程使用桿菌肽鋅)，陰性對(duì)照組全程不使用任何抗生素，統(tǒng)計(jì)肉雞存活數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭染色

分離從病死雞采集的150份組織樣品，根據(jù)其培養(yǎng)特性和染色特性可將其分為三大類。第1類為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上呈圓形、濕潤(rùn)、表面光滑的灰白色菌落；第2類為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板生長(zhǎng)不良，鮮血瓊脂平板呈灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊的露珠狀小菌落；第3類為革蘭氏陰性球桿菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板為圓形、表面光滑、半透明的灰白色小菌落。

2.2 生化試驗(yàn)

分離菌初步判定A群為埃希氏菌屬，B、C為沙門氏菌屬，D群為巴氏桿菌屬(表1)。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S r RNA分子鑒定、同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從病死雞中分離的病原，以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，用16S rRNA基因擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳中片段大小約1 500 bp，與預(yù)期的目的片段大小一致(圖1)。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果表明A與大腸埃希氏菌位于同一分支，B與雞傷寒沙門氏菌同源性為100%，C與雞白痢沙門氏菌位于同一分支，D與多殺性巴氏桿菌同源性為95%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; A～D.分離菌株M.DNA Marker DL 2 000; A-D.Strains

圖2 基于16S rRNA序列構(gòu)建的A、B菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠全部死亡，對(duì)照組小鼠未表現(xiàn)出異常且食欲正常，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行病原菌分離鑒定，結(jié)果分別為雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、禽致病性大腸埃希氏菌和多殺性巴氏桿菌。

2.5 半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定

大腸埃希氏菌的半數(shù)致死量LD50為3.6×106CFU，雞白痢沙門氏菌的半數(shù)致死量LD50為1.8×106CFU，雞傷寒沙門氏菌的半數(shù)致死量LD50為2.3×106CFU，禽巴氏桿菌的半數(shù)致死量LD50為1.6×106CFU。

2.6 疫苗物理性狀檢測(cè)

黏度測(cè)定：在室溫下，用內(nèi)徑為1.2 mm的吸管吸取1 mL乳劑，垂直向下流出0.4 mL乳劑的時(shí)間為5 s。穩(wěn)定性測(cè)定：將疫苗以3 000 r/min 離心15 min，管底無水相析出，將疫苗37℃放置21 d，疫苗無分層，試驗(yàn)結(jié)果符合《中國(guó)獸藥典》的標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.7 無菌和安全性檢驗(yàn)

無菌狀態(tài)下，將制備好的疫苗接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，均無細(xì)菌生長(zhǎng)。 制備的疫苗接種1日齡和14日齡雞后，接種后雞精神狀況良好，采食量與對(duì)照組無變化；雞注射部位沒有發(fā)生腫脹、硬結(jié)、潰爛且無一發(fā)病或死亡，無不良反應(yīng)，表明疫苗安全合格。

圖3 基于16S rRNA序列構(gòu)建的C、D菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.8 疫苗的攻毒保護(hù)試驗(yàn)

攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，攻毒后對(duì)照組雞全部死亡，試驗(yàn)組的雞全部存活，保護(hù)率為100%。

2.9 疫苗的免疫效果

將疫苗接種1日齡雞，首免后14 d進(jìn)行二免。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組肉雞的出欄率為90%，全程用抗生素的陽性對(duì)照組出欄率為94%，全程不用任何抗生素的陰性對(duì)照組出欄率僅為70%。

3 討論

單一疫苗在臨床中需要多次接種，易引起肉雞應(yīng)激反應(yīng)且成本較高[9]。本研究通過分離采集的150份組織樣品，共計(jì)得到42株病原菌，共分離出4種致病菌，分別為雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、禽致病性大腸埃希氏菌和多殺性巴氏桿菌，并根據(jù)分離菌株制備出三聯(lián)四價(jià)滅活疫苗。研發(fā)上述4種病的聯(lián)苗可簡(jiǎn)化免疫程序，減少免疫應(yīng)激，降低免疫成本。

表2 疫苗的免疫效果

通常情況下滅活疫苗通過加熱、甲醛、丙酮等方法進(jìn)行滅活[10]，這類疫苗不能在環(huán)境中存活且能刺激免疫動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。但該類疫苗表達(dá)的抗原數(shù)量有限且在很短的時(shí)間內(nèi)被宿主消滅，在實(shí)際生產(chǎn)中需要免疫接種2次以達(dá)到最佳免疫效果[11-12]。本研究制備的禽沙門氏菌、大腸埃希氏菌、巴氏桿菌三聯(lián)四價(jià)滅活疫苗，經(jīng)過物理性狀檢驗(yàn)和無菌檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果均符合《中國(guó)獸藥典》的標(biāo)準(zhǔn)。用該疫苗接種1日齡和14日齡的白羽肉雞，試驗(yàn)雞精神狀況良好、食欲正常無任何不良反應(yīng)且無一死亡，說明疫苗對(duì)肉雞具有良好的安全性。疫苗免疫試驗(yàn)雞后，用雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、禽致病性大腸埃希氏菌和多殺性巴氏桿菌攻毒，免疫雞在攻毒后7 d內(nèi)全部存活，攻毒保護(hù)率達(dá)到100%，對(duì)照組在攻毒后全部發(fā)病死亡，死亡率為100%，表明本試驗(yàn)制備的多聯(lián)滅活疫苗具有良好的保護(hù)效果。將疫苗接種1日齡雞，首免后14 d進(jìn)行二免，試驗(yàn)組的出欄率為90%，全程使用抗生素的陽性對(duì)照組出欄率為94%，全程不用任何抗生素的陰性對(duì)照組出欄率僅為70%，表明本試驗(yàn)研制的疫苗具有較好的免疫效果，其中全程用抗生素的陽性對(duì)照組出欄率略高于試驗(yàn)組，在畜禽養(yǎng)殖過程中長(zhǎng)期使用抗生素將導(dǎo)致多種細(xì)菌出現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[13]。綜上所述，本研究制備的禽沙門氏菌、大腸埃希氏菌、巴氏桿菌三聯(lián)四價(jià)滅活疫苗安全有效，對(duì)張掖地區(qū)雞白痢、雞傷寒、禽大腸桿菌病和禽霍亂的防控具有重要現(xiàn)實(shí)意義。