多黏菌素耐藥基因mcr-1重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增方法的建立及應(yīng)用

車勇良，陳秋勇，陳如敬，吳學(xué)敏，王隆柏，劉玉濤，周倫江

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建福州 350013)

抗生素是抵抗人類和動(dòng)物細(xì)菌感染最重要的藥物。然而，由于抗生素被大量不合理使用，導(dǎo)致了耐藥菌株的大量產(chǎn)生，給全球公共衛(wèi)生和食品安全帶來了巨大威脅。多黏菌素作為人類抵抗細(xì)菌感染的最后“一道防線”，也相繼出現(xiàn)了大量耐藥菌株[1-3]。mcr-1作為一種多黏菌素耐藥基因，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就引起了全世界的廣泛關(guān)注[4-5]。隨之，為了更好地檢測mcr-1基因，建立了多種檢測方法，其中包括普通PCR方法[4]、熒光定量PCR方法[6-8]。

重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增方法 (recombinase-aided amplification assay,RAA)是近年創(chuàng)建的一種新的檢測核酸的方法[9-10]。通過設(shè)計(jì)一對(duì)RAA特異性引物(引物長度30 bp左右)，在源于細(xì)菌或真菌的重組酶、DNA聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白的共同作用下，完成目的片段的RAA擴(kuò)增，并結(jié)合特異性熒光標(biāo)記或金顆粒標(biāo)記探針，通過熒光定量顯示儀或金標(biāo)試紙進(jìn)行結(jié)果判斷。該方法具有靈敏度高、特異性好、檢測時(shí)間短、恒溫?cái)U(kuò)增、不需要昂貴儀器、結(jié)果判斷方法多樣等多種優(yōu)勢[9-10]。

本研究以多黏菌素耐藥基因mcr-1為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針，通過反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化，建立了一種快速、敏感且特異的檢測mcr-1基因的RAA方法，為多黏菌素耐藥基因的流行病學(xué)調(diào)查和耐藥分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多黏菌素耐藥基因mcr-1陽性的大腸埃希氏菌菌株由福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心保存，mcr-1陰性的沙門氏菌、志賀氏菌、克雷伯氏菌和摩根摩氏菌均由福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心保存。4株臨床分離細(xì)菌來自福建省2個(gè)豬場的豬糞樣品，4株細(xì)菌均為大腸埃希氏菌菌株。

1.1.2 主要試劑與儀器 細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和PCR試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RAA基礎(chǔ)擴(kuò)增試劑盒和熒光檢測試劑盒，杭州眾測生物科技有限公司產(chǎn)品。PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(RTQ-960 Pro型)，艾康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取 復(fù)蘇細(xì)菌，挑取單個(gè)菌落接種液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(OD600=0.6)，3 000 r/min離心收集細(xì)菌，按照試劑盒說明書用細(xì)菌DNA抽提試劑盒提取大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、克雷伯氏菌和摩根摩氏菌的基因組DNA。

1.2.2 引物和探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中多黏菌素耐藥基因mcr-1的保守片段及重組酶擴(kuò)增方法(RAA)的引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)2對(duì)PCR引物及其探針(表1)。并且根據(jù)文獻(xiàn)[11]合成一對(duì)PCR引物。

表1 設(shè)計(jì)的引物和探針

1.2.3 多黏菌素耐藥基因mcr-1的PCR擴(kuò)增、克隆及序列測定 按照文獻(xiàn)[11]應(yīng)用特異性引物(mcr1-F和mcr1-R)對(duì)多黏菌素耐藥的大腸埃希氏菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并回收PCR片段，與克隆質(zhì)粒pMD18-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，陽性鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng)并提取陽性質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行序列測定。所測序列與GenBank中的mcr-1序列進(jìn)行同源性比較，以確認(rèn)是多黏菌素耐藥基因mcr-1。

1.2.4 RAA基礎(chǔ)擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件 按照RAA基礎(chǔ)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括A buffer37.5 μL、mcr-F1(mcr-F2) 4.0 μL、mcr-R1(mcr-R2) 4.0 μL、DNA模板2.0 μL，最后在蓋子上加入B buffer 2.5 μL。瞬時(shí)離心混勻后，放入恒溫水浴鍋中，按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。39℃反應(yīng)40 s，39℃反應(yīng)30 s、40個(gè)循環(huán)。使用擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑盒純化擴(kuò)增后的RAA產(chǎn)物，電泳檢測。

1.2.5 RAA熒光擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件 按照RAA熒光試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括A buffer 36.9 μL、引物F 4.0 μL、引物R 4.0 μL、探針(10 μmol/L)0.6 μL、DNA模板2.0 μL，最后在蓋子上加入B buffer 2.5 μL。瞬時(shí)離心混勻后，放入熒光定量PCR儀中，按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。39℃反應(yīng)40 s，39℃反應(yīng)30 s，40個(gè)循環(huán)，收集熒光。

1.2.6 敏感性測定 把mcr-1陽性質(zhì)粒稀釋成4個(gè)梯度進(jìn)行敏感度驗(yàn)證，分別為101拷貝/μL、102拷貝/μL、103拷貝/μL、104拷貝/μL，應(yīng)用RAA熒光檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.7 特異性檢測 分別以大腸埃希氏菌(mcr-1陽性)、沙門氏菌(mcr-1陰性)、志賀氏菌(mcr-1陰性)、克雷伯氏菌(mcr-1陰性)和摩根摩氏菌(mcr-1陰性)的基因組DNA為模板，應(yīng)用建立的RAA方法對(duì)其進(jìn)行檢測。

1.2.8 臨床應(yīng)用 應(yīng)用所建立的RAA方法對(duì)臨床分離的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行檢測，驗(yàn)證其實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 mcr-1的PCR擴(kuò)增、克隆及測序

PCR鑒定結(jié)果顯示了目的條帶320 bp(圖1)。并挑選陽性細(xì)菌進(jìn)行克隆，提取陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序，所測序列與GenBank中的mcr-1序列同源性達(dá)到了99%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.mcr-1基因陽性質(zhì)粒1；2.mcr-1基因陽性質(zhì)粒2

2.2 mcr-1基因的RAA擴(kuò)增結(jié)果

按照RAA擴(kuò)增條件，使用引物mcr-F1和mcr-R1或引物mcr-F2和mcr-R2的擴(kuò)增結(jié)果基本一致，都可以擴(kuò)增出156 bp的目的片段(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.mcr-F1(R1)引物的基礎(chǔ)RAA擴(kuò)增；2.mcr-F2(R2)引物的基礎(chǔ)RAA擴(kuò)增

2.3 敏感性驗(yàn)證

將含有mcr-1基因保守片段的質(zhì)粒稀釋成4個(gè)梯度，檢測不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增(圖3)，該RAA方法最低可檢測出102拷貝/μL的質(zhì)粒DNA。

1.陽性對(duì)照; 2.104拷貝; 3.103拷貝; 4.102拷貝; 5.101拷貝; 6.陰性對(duì)照

2.4 特異性驗(yàn)證

分別對(duì)mcr-1基因陽性的大腸埃希氏菌基因組DNA和mcr-1基因陰性的其他各種細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行熒光RAA檢測。結(jié)果顯示，只有mcr-1基因陽性的大腸埃希氏菌基因組DNA能被檢測出mcr-1基因，其他4種細(xì)菌基因組DNA未被檢測出mcr-1基因(圖4)。

1.mcr-1基因陽性大腸埃希氏菌; 2.陽性對(duì)照; 3-7.其他mcr-1基因陰性細(xì)菌和陰性對(duì)照

2.5 RAA方法的臨床應(yīng)用

應(yīng)用所建立的mcr-1基因RAA方法檢測臨床分離細(xì)菌，從4份樣品中檢測出2份陽性樣品，2份陰性樣品(圖5)。

1.mcr-1基因陽性樣品; 2.陽性對(duì)照; 3.mcr-1基因陽性樣品; 4.mcr-1基因陰性樣品; 5.mcr-1基因陰性樣品; 6.陰性對(duì)照

3 討論

本研究選取mcr-1基因的保守片段為目的片段，并根據(jù)該片段，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和一條特異性探針，建立了檢測耐藥基因mcr-1的RAA方法。這對(duì)特異性引物和探針在mcr-1基因中高度保守，適宜用來作為分子檢測的目的基因。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明該RAA方法只能檢測到mcr-1陽性基因，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的特異性。

RAA方法在應(yīng)用于檢測時(shí)敏感性高[9-10]，本研究設(shè)計(jì)的特異引物和探針?biāo)⒌臋z測mcr-1耐藥基因的RAA技術(shù)，最低可檢測到102拷貝/μL的mcr-1基因陽性質(zhì)粒，表明該方法具有高度的敏感性。檢測多黏菌素耐藥基因mcr-1的方法主要是PCR和熒光定量PCR，這些方法不僅耗時(shí)，而且價(jià)格昂貴。RAA方法不僅具有更高的敏感性，而且耗時(shí)較短；因?yàn)槭呛銣財(cái)U(kuò)增，無需專有儀器，只需要恒溫水浴鍋就能運(yùn)行，且結(jié)果判斷有3種方式，分別為凝膠電泳、熒光定量曲線和金標(biāo)試紙[9-10,12-15]。

本研究選取多黏菌素耐藥基因mcr-1為研究對(duì)象，通過設(shè)計(jì)特異性引物和探針，優(yōu)化擴(kuò)增條件，建立了一種快速、特異性好且高度敏感能檢測mcr-1基因的RAA方法，這將為多黏菌素耐藥基因mcr-1的流行病學(xué)調(diào)查及耐藥機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。