云南省豬札幌病毒感染情況調(diào)查及VP1基因遺傳進(jìn)化分析

劉應(yīng)華，程美玲，王馨嫻，王云華，畢峻宇，姚海燕，張夢晨，王 蓉，尹革芬

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201)

札幌病毒(Sapovirus，SaV)是重要的人畜共患腸道病原之一，近年來已成為主要的公共衛(wèi)生問題，SaV在世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高，是引起兒童和老人腹瀉的重要病原之一[1-3]。1980年在仔豬腹瀉樣本中首次分離到第1株豬札幌病毒(Porcine Sapovirus，PoSaV)，命名為Cowden毒株[4]。隨后在多個國家流行，2008年首次證實(shí)PoSaV在我國流行[5]。SaV屬于杯狀病毒科札幌樣病毒屬，病毒粒子表面有典型的杯狀凹陷，呈20面體結(jié)構(gòu)，直徑約30 nm～38 nm，表面無囊膜，為單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為7.1 kb～7.7 kb，3′末端有poly A[6]。大多數(shù)基因組包含2個開放閱讀框(ORF1和ORF2)，ORF1編碼一個大的多聚蛋白，含有7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-7)和1個主要衣殼蛋白(VP1)，ORF2編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白(VP2)[7]，少數(shù)毒株還有ORF3。衣殼蛋白VP1在不同基因型毒株中具有豐富遺傳變異性，與病毒的免疫原性密切相關(guān)，是研究SaV遺傳變異和基因型特異性的關(guān)鍵蛋白[8-9]。目前，區(qū)分札幌病毒的基因型是參照杯狀病毒科諾如病毒的分類方法，基于VP1基因完整序列對其進(jìn)行基因型分型[3,6]，SaV現(xiàn)已被鑒定出19個基因型和52個基因亞型[10]。

SaV不僅能夠感染人，還可感染豬、水貂、蝙蝠和鼠等多種哺乳動物，其中人札幌病毒主要為GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ基因型，豬札幌病毒主要為GⅢ、GⅤ、GⅥ、GⅦ、GⅧ、GⅨ、GⅩ、GⅪ基因型[11]。最為流行的是豬札幌病毒GⅢ型毒株，主要感染哺乳仔豬和斷奶仔豬，引起仔豬出現(xiàn)急性腹瀉和胃腸炎癥狀，甚至死亡。該病無明顯季節(jié)性，常與其他腹瀉性病原混合感染，增加了仔豬的死亡率。該病的診斷方法較為單一，由于病毒體外培養(yǎng)條件較為苛刻，分離病毒較為困難[12]，故核酸檢測是最為有效的快速診斷方法。本研究擬建立PoSaV GⅢ基因型毒株的RT-qPCR檢測方法，了解云南省各地區(qū)PoSaV感染狀況和與腹瀉相關(guān)病原的混合感染情況，對云南省PoSaV關(guān)鍵衣殼蛋白VP1基因進(jìn)行遺傳特征分析，為云南省豬札幌病毒的預(yù)警和防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1 材料

1.1.1 樣品來源 2020年4月～8月于云南省13個州市的規(guī)?；B(yǎng)殖場，按約1∶1∶1∶1比例隨機(jī)采集哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬及母豬的糞便樣品共679份。

1.1.2 主要試劑和儀器 RT-PCR相關(guān)試劑cDNA Synthesis Mix、PCR SuperMix Ⅱ 購自北京全式金公司；核酸提取試劑RNAiso plus、pMD-18T vector、DH5α、核酸電泳Marker、T4 Linkase購自大連寶生物公司；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；RT-qPCR試劑iScript TM cDNA Synthesis Kit、熒光染料SYBR SsoFast TMEva Green? Supermix購自Bio-Rad公司；氯仿、異丙醇、LB培養(yǎng)基等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。實(shí)時熒光定量PCR儀(CFX 96)、RT-PCR儀(T100 Thermal)，購自Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)(上海)有限公司；高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 13R)，購自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tauon 1600)，購自上海天能科技有限公司；超凈工作臺(BCM)，購自欽德機(jī)電科技(科技)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測及測序 根據(jù)NCBI參考序列設(shè)計PoSaV的檢測引物(表1)，運(yùn)用RT-qPCR方法對采集樣本進(jìn)行檢測。按分子克隆方法將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳，然后膠純化回收，并連接到pMD-18T載體，然后轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)富集，提取質(zhì)粒后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 引物序列

1.2.2 VP1基因遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫設(shè)計衣殼蛋白VP1全基因擴(kuò)增引物(表1)，提交生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。提取陽性樣本的總RNA，經(jīng)cDNA Synthesis Mix逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用PCR SuperMix Ⅱ進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物純化回收并連接入pMD-18T，然后轉(zhuǎn)化入DH5α中，涂板挑取單個菌落進(jìn)行富集，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，利用DNA Star 6.0進(jìn)行序列拼接，得到PoSaV-VP1全基因序列并進(jìn)行核苷酸同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品檢測

設(shè)計PoSaV特異性引物對所采集的樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測，擴(kuò)增曲線及熔解曲線顯示，檢測到PoSaV GⅢ型陽性樣本(圖1A)，將陽性樣本進(jìn)行核酸電泳檢測，在預(yù)期片段(198 bp)處出現(xiàn)特異性條帶(圖1B)。純化產(chǎn)物經(jīng)分子克隆后送生工生物工程(上海)有限公司測序，將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，證實(shí)樣本為PoSaV陽性樣本。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.陰性對照；2～7.樣品檢測結(jié)果

2.2 PoSaV陽性率

用PoSaV GⅢ型檢測引物對所采集679樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測，結(jié)果顯示，云南省除迪慶州以外，所有州/市均存在PoSaV感染，各地區(qū)感染率為0～73.3%(表2)，各年齡段豬的感染率為16.4%～39.4%(表3)。

表2 云南省各地區(qū)PoSaV陽性率

表3 不同年齡段PoSaV陽性率

2.3 混合感染率

用云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗室先前已建立的豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、Delta冠狀病毒、星狀病毒、博卡病毒的檢測方法，對196份PoSaV呈陽性的樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示PoSaV與豬星狀病毒(PAstV)的混合感染率最高，為69.9%；196份PoSaV陽性樣品中存在多重感染的現(xiàn)象(表4)。

表4 PoSaV與腹瀉主要病原的混合感染情況

2.4 VP1遺傳特征分析

測序拼接獲得兩條PoSaV-VP1基因序列(YNXW2-VP1和YNTH2-VP1)，長度為1635 bp，編碼545 aa，基于SaV分類原則，結(jié)合GenBank相應(yīng)的VP1蛋白基因(表5)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，YNXW2-VP1和YNTH2-VP1序列與GⅢ代表株Cowden毒株等序列聚集在一個獨(dú)立分支(圖2)，表明YNXW2和YNTH2毒株屬于PoSaV GⅢ毒株類型，所得的兩條VP1基因序列與GⅢ型參考毒株LC215880和MK965898之間的核苷酸同源性最高，分別為89.3%和93.5%(圖3)。

圖2 基于PoSaV-VP1基因的遺傳進(jìn)化分析

圖3 PoSaV-VP1基因的核苷酸同源性比較

表5 參考毒株序列信息

3 討論

SaV是引起人和多種哺乳動物急性胃腸炎的病毒性病原之一。PoSaV是養(yǎng)殖場中繼PEDV和TGEV之后的又一病毒性腹瀉“殺手”，在國內(nèi)外多個養(yǎng)殖場均有報道，制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[13-14]。所以，了解PoSaV在臨床上的感染狀況及混合感染情況，對云南省PoSaV的預(yù)警、防控及流行病學(xué)監(jiān)測非常重要。SaV宿主廣泛，基因型多樣，可跨物種傳播，且該病毒的培養(yǎng)條件特殊，體外分離培養(yǎng)難度較大[12]，現(xiàn)無有效的商品化疫苗，增加了該病的防控難度。

本次調(diào)查顯示，云南省豬群中PoSaV陽性率為28.9%，其中哺乳仔豬的陽性率最高(39.4%)，表明PoSaV在云南省豬群中廣泛流行，呈現(xiàn)以仔豬感染發(fā)病為主的特征，與先前研究比較，陽性率呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，提示PoSaV可能已在我國豬群中普遍流行。對云南省豬群中腹瀉相關(guān)病原的混合感染情況分析顯示，PoSaV與腹瀉相關(guān)病原的總混合感染率為85.7%，其中與豬星狀病毒和豬博卡病毒混合感染的陽性率分別為69.9%和48.9%，表明豬星狀病毒和豬博卡病毒在云南豬群中的感染率較高，豬札幌病毒在臨床上以混合感染病例為主，可能會加劇豬群的腹瀉情況。另外，還呈現(xiàn)多重感染的趨勢，其中雙重感染和三重感染率分別為31.1%和42.9%，甚至還有四重感染和五重感染的現(xiàn)象存在，尤其是在流行性腹瀉或傳染性胃腸炎陽性的病例中，札幌病毒的陽性率很高，盡管札幌病毒在豬群中的致死率不高，但是在與嚴(yán)重致死性病原(PEDV、TGEV)混合感染的病例中可能會進(jìn)一步增加豬群的死亡率。另一方面，在札幌病毒單一感染的病例中，存在嚴(yán)重腹瀉導(dǎo)致哺乳仔豬死亡，可能與豬場的疾病防控措施、基礎(chǔ)免疫、豬群免疫力等因素有關(guān)，提示札幌病毒在豬群中暴發(fā)的可能，應(yīng)當(dāng)引起業(yè)界的重視和關(guān)注。

根據(jù)VP1蛋白基因可將PoSaV分成多個基因型，其中最主要流行的是GⅢ型毒株，本研究擴(kuò)增獲得2條VP1序列(YNXW2-VP1、YNTH2-VP1)，遺傳進(jìn)化分析顯示均屬于PoSaV GⅢ型，其核苷酸同源性為81%，與GⅢ型參考毒株LC215880和MK965898同源性最高，分別為89.3%和93.5%，表明其主要免疫原性相關(guān)蛋白VP1基因存在較大變異，可能導(dǎo)致不同基因型毒株間的交叉保護(hù)性降低及毒株間的高頻變異和重組，給后續(xù)疫苗的研發(fā)增加了難度。