新城疫病毒感染雞胚組織miRNAs表達(dá)譜的測序及分析

賈燕青，仇薪鑫，王相偉，謝曉剛，白 軍，王興龍*，楊增岐*

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程分院/動物疫病防控陜西省高校工程研究中心，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約為18nt-25 nt的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，可通過靶向結(jié)合目的基因，對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，參與多個(gè)生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡及死亡等[1-2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs作為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，可參與病毒感染時(shí)宿主基因和病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。對新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染的DF-1細(xì)胞miRNAs表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，gga-miR-19b-3p表達(dá)量增加并且可以通過靶向調(diào)控RNF11和ZMYND11基因來激活NF-κB信號傳導(dǎo)，增強(qiáng)的炎性細(xì)胞因子可以抑制NDV的復(fù)制[3-4]。對禽流感病毒(Avian influenza virus,IAV)感染時(shí)miRNAs研究發(fā)現(xiàn)，miR-188-3p可以通過直接靶向病毒PB2上的預(yù)測位點(diǎn)在mRNA和蛋白質(zhì)水平下調(diào)PB2表達(dá)，并有效抑制A549細(xì)胞中IAV(H1N1、H5N6和H7N9)的復(fù)制，這些發(fā)現(xiàn)表明細(xì)胞miR-188-3p可用于RNAi介導(dǎo)的抗IAV治療[5]。

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種病毒性傳染病，臨床癥狀以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜及漿膜出血等為特征，病死率高，傳染性強(qiáng)[6],給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。NDV基因型多、變異快、傳統(tǒng)疫苗保護(hù)力不足，不能有效地控制NDV的感染。miRNAs在病毒感染宿主的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，研究病毒感染后miRNAs表達(dá)譜有利于闡明病毒感染與宿主間的相互作用，但NDV感染后宿主miRNAs表達(dá)譜研究較少且已有研究多以細(xì)胞感染為主，對感染組織研究較少且沒有對強(qiáng)、弱毒株感染時(shí)miRNAs表達(dá)譜變化進(jìn)行比較[9]。本研究通過高通量測序檢測NDV強(qiáng)、弱毒株感染雞胚后內(nèi)臟組織miRNAs表達(dá)譜的變化，對差異表達(dá)miRNAs靶基因進(jìn)行分析，用GO和KEGG富集分析差異表達(dá)miRNAs的靶基因，篩選參與調(diào)節(jié)天然免疫或NDV基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的miRNAs，為尋找NDV新的防控靶點(diǎn)和方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SPF雞胚與病毒 9日齡～11日齡無特定病原體(specific pathogen free,SPF)雞胚購于山東省濟(jì)南賽斯家禽有限公司，并在37℃孵化箱進(jìn)行孵化。NDV強(qiáng)毒株F48E9和弱毒株La Sota為西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存毒株。

1.1.2 主要試劑 Trizol，大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒，GenStar公司產(chǎn)品；miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒和miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺，北京亞泰科隆公司產(chǎn)品；超純水儀，艾柯儀器公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，西安天隆公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀公司產(chǎn)品；電熱恒溫水槽，蘇州力意達(dá)儀器廠產(chǎn)品；超微量核酸分析儀，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 NDV感染試驗(yàn)及測序樣品準(zhǔn)備 將NDV F48E9和La Sota毒株分別以104PFU/胚的病毒粒子數(shù)接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，并用等體積的PBS接種雞胚尿囊腔作為陰性對照，每組接胚4枚。去除24 h內(nèi)死亡的雞胚后，每隔6 h觀察雞胚狀況，至感染后36 h時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)48E9雞胚活力明顯減弱，此時(shí)收胚并收集測序樣品。

在無菌超凈臺進(jìn)行無菌收集雞胚尿囊液置于1.5 mL離心管中，分離雞胚內(nèi)臟并置于含有RNA later保護(hù)液的凍存管中，置-80℃保存?zhèn)溆谩Ω鹘M收集的尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)(HA)檢測病毒含量，并選取病毒血凝價(jià)相同(28)的F48E9和La Sota試驗(yàn)組及PBS對照組雞胚內(nèi)臟組織(主要包括心、肝、胃、腸及脾)送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行small RNA測序。

1.2.2 Small RNA測序 按照Trizol說明提取內(nèi)臟混合樣品的總RNA，然后用QIAGEN RNeasy Kit進(jìn)行純化總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度，Nanodrop檢測RNA純度，Agilent 2100 Bioanalyzer精確檢測RNA完整性，Qubit檢測RNA濃度，檢測合格后置于-80℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)樣品取3 μg總RNA用于small RNA文庫構(gòu)建，用small RNA sample Pre kit構(gòu)建文庫，用small RNA的5′端有完整的磷酸基團(tuán)及3′端有羥基，直接在RNA 5′及3′端添加測序接頭，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳分離目標(biāo)片段，最后膠回收獲得cDNA文庫。檢驗(yàn)建立的small RNA文庫，用Qubit 2.0初步定量并稀釋文庫至1 ng/μL，文庫的insert size用Agilent 2100進(jìn)行檢驗(yàn)，最后用RT-qPCR方法精確定量文庫的有效濃度，應(yīng)大于2 nmol/L，以確保文庫質(zhì)量。用Illumina Hiseq 2500測序平臺對樣品進(jìn)行高通量測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及分析 對測序獲得的原始序列，進(jìn)行去低質(zhì)量、去接頭、去污染等過濾篩選后獲得所需的序列，然后對其進(jìn)行長度分布統(tǒng)計(jì)及樣品間公共序列統(tǒng)計(jì)。對得到的small RNA進(jìn)行序列分類注釋后，獲得樣品各組分及其表達(dá)量等信息，再用未注釋片段進(jìn)行novel miRNAs預(yù)測及已知miRNAs堿基編輯預(yù)測。分析miRNAs表達(dá)差異，預(yù)測miRNAs靶基因，再利用生物信息學(xué)對靶基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG信號通路注釋。

1.2.4 miRNAs引物設(shè)計(jì) miRNA熒光定量檢測使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒，下游引物為試劑盒的通用引物，只需設(shè)計(jì)上游引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)遵循引物設(shè)計(jì)的普遍原則，將成熟的miRNA序列中的U替換成T；根據(jù)下游引物調(diào)整Tm值(60℃～65℃)，如Tm值過低，在引物5′端添加幾個(gè)G或C堿基，或在3′端添加幾個(gè)A堿基，或在5′和3′端同時(shí)修飾；Tm值過高，在引物5′或3′端去掉幾個(gè)堿基(表1)。

表1 本研究所用引物

1.2.5 miRNA反轉(zhuǎn)錄 miRNA反轉(zhuǎn)錄按照miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄配制體系為20 μL體系，置冰上進(jìn)行操作，具體體系為：total RNA 2 μL,2×miRNA RT reaction buffer 10 μL,miRNA RT enzyme Mix 2 μL,RNase-free ddH2O 6 μL，混勻上述反應(yīng)液，在42℃反應(yīng)60 min，對miRNA加A尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再在95℃反應(yīng)3 min，完成酶失活反應(yīng)。合成的cDNA放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 Real-time quantitative PCR 按照miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明進(jìn)行操作，具體如下：2×miRcute miRNA Premix和Reverse Primer室溫融化并混勻，于冰上配制反應(yīng)體系(20 μL)，反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，上游引物 (10 μmol/L) 0.4 μL，下游引物 (10 μmol/L) 0.4 μL，2×miRcute miRNA Premix 10 μL，ddH2O 8.2 μL；混勻后，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，程序?yàn)椋?4℃ 2 min，94℃ 20 s，60℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 NDV的感染

用104PFU/胚F48E9或La Sota感染雞胚36 h，剖檢發(fā)現(xiàn)F48E9感染雞胚胚體有明顯出血，內(nèi)臟組織也有明顯出血；La Sota感染雞胚胚體及內(nèi)臟均無明顯出血現(xiàn)象(圖1)。對收集的尿囊液進(jìn)行HA檢測，結(jié)果表明F48E9感染組血凝價(jià)分別為27、28和29，La Sota感染組HA分別為27、27和28，空白對照組HA均為20，表明NDV感染成功。選擇HA均為28的F48E9和La Sota試驗(yàn)組雞胚內(nèi)臟組織進(jìn)行Small RNA測序。

圖1 NDV感染SPF雞胚病理變化

2.2 Small RNA測序結(jié)果

2.2.1 數(shù)據(jù)概況及長度分布 經(jīng)small RNA測序后，F(xiàn)48E9感染組、La Sota感染組及對照組分別獲得11382301，11852540和12423522條原始序列，對數(shù)據(jù)過濾后，分別得到11009409，11429107和12134443 clear reads，錯誤率小于0.01%，且Q20和Q30質(zhì)量檢測均符合要求，以上結(jié)果表明本次測序結(jié)果符合測序要求，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。測序原始數(shù)據(jù)以上傳至NCBI GEO數(shù)據(jù)庫，F(xiàn)48E9感染組、La Sota感染組及對照組登錄號分別為：GSM3042969，GSM3042970和GSM3042971。對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行長度分析，本次測序sRNA的長度主要分布在20-24 nt間，且長度峰值均在22 nt，占34.67%～42.36%，符合動物miRNA測序長度分布。

2.2.2 Small RNA分類注釋 根據(jù)對known miRNA>rRNA>tRNA>snRNA>snoRNA>repeat>gene>novel miRNA檢測的優(yōu)先級順序?qū)λ衧mall RNA與各類RNA進(jìn)行比對注釋，在small RNA總量上，對照組、F48E9組及La Sota組已知miRNAs所占比例分別為40.85%、29.32%及36.25%，但small RNA種類上miRNAs所占比例較少，對照組、F48E9組及La Sota組分別占0.74%、0.48%和0.65%；新預(yù)測的miRNAs比例較少，分別占0.02%，0.01%和0.02%；絕大部分是未注釋的small RNA，所占比例分別為72.14%、73.91%和72.78%。

2.3 miRNAs差異分析及RT-qPCR結(jié)果驗(yàn)證

對各樣品中已知miRNAs和新miRNAs進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，并用TPM進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理，在用DEGseq對兩兩樣品進(jìn)行差異比較分析，通過比對分析得到：F48E9感染組與對照組間表達(dá)差異顯著的miRNAs有64個(gè)，其中33個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)，31個(gè)miRNAs的表達(dá)量下調(diào)；La Sota感染組與對照組間表達(dá)差異顯著的miRNAs有61個(gè)，其中36個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)，25個(gè)miRNAs的表達(dá)量下調(diào)；La Sota感染組與F48E9感染組間表達(dá)差異顯著的miRNAs有49個(gè)，其中27個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)，22個(gè)miRNAs的表達(dá)量下調(diào)(表2)。

表2 差異表達(dá)miRNAs統(tǒng)計(jì)表

2.4 RT-qPCR結(jié)果驗(yàn)證

用RT-qPCR技術(shù)對隨機(jī)選取的10個(gè)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證(圖2)，熒光定量PCR結(jié)果與small RNA測序結(jié)果相似，gga-miR-34a-5p、gga-miR-375、gga-miR-122-3p和gga-miR-187-3p均為表達(dá)上調(diào)miRNAs，gga-miR-124a-3p、gga-miR-203a、gga-miR-205a、gga-miR-183和gga-miR-9-3p均為表達(dá)下調(diào)miRNAs，gga-miR-451在F48E9和La Sota感染時(shí)分別為上調(diào)和下調(diào)趨勢，這些驗(yàn)證結(jié)果表明測序結(jié)果比較可靠，可用于數(shù)據(jù)分析。

C.對照組,1.gga-miR-122-3p,2.gga-miR-187-3p,3.gga-miR-34a-5p,4.gga-miR-375,5.gga-miR-451,6.gga-miR-205a,7.gga-miR-183,8.gga-miR-124a-3p,9.gga-miR-9-3p,10.gga-miR-203a

2.5 差異表達(dá)miRNAs靶基因的預(yù)測及生物信息學(xué)分析

篩選好各組間的差異表達(dá)miRNAs后，利用miRanda對差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，得到差異表達(dá)miRNAs與其靶基因間的對應(yīng)關(guān)系，再對每組差異表達(dá)miRNAs靶基因的集合分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析。對靶基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)48E9感染組與對照組相比，這些靶基因主要富集在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞死亡、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)結(jié)合等方面；La Sota感染組與對照組相比，這些靶基因主要富集在細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白結(jié)合及分子調(diào)節(jié)等方面；La Sota感染組與F48E9感染組相比，這些靶基因主要富集在細(xì)胞定位、代謝過程、蛋白定位、蛋白結(jié)合及酶結(jié)合等方面。對靶基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)48E9感染組與對照組相比，這些靶基因主要富集在P53信號通路、緊密連接、內(nèi)吞、DNA復(fù)制及細(xì)胞周期等方面；La Sota感染組與對照組相比，這些靶基因主要富集在RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、P53信號通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期及凋亡等方面；La Sota感染組與F48E9感染組相比，這些靶基因主要富集在RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、緊密連接、DNA復(fù)制等方面。經(jīng)預(yù)測分析，篩選與干擾素抗NDV 通路相關(guān)基因的miRNAs(圖3)，分別有g(shù)ga-miR-196-5p、gga-miR-203a、gga-miR-455-5p、gga-miR-128-1-5p、gga-miR-128-3p、gga-miR-133b、gga-miR-135a-2-3p、gga-miR-1779、gga-miR-140-3p、gga-miR-460a-5p、gga-miR-9-3p、gga-miR-458b-5p、gga-miR-155、gga-miR-124a-3p、gga-miR-135a-5p、gga-miR-3529等。

3 討論

MiRNAs是細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種重要的調(diào)節(jié)因子，在天然免疫反應(yīng)、獲得性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及病原微生物感染等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]，但是在NDV感染的雞胚組織中這些調(diào)節(jié)因子的變化仍然不清楚。近年來，隨著高通量測序低成本和通量分析等優(yōu)勢，RNA-Seq已成為研究病毒感染時(shí)鑒定miRNAs表達(dá)變化的有力工具[3,12]。新城疫病毒作為一種嚴(yán)重危害鳥類健康的重要病原，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此研究有效地防治NDV的新策略已顯得尤為重要。雞胚常被用于分離和鑒定NDV，在病毒學(xué)、神經(jīng)學(xué)、發(fā)育學(xué)、腫瘤學(xué)、疫苗研發(fā)及動物模型中具有重要作用[13]，但是卻不清楚其與病毒之間的相互作用，因此，本研究將利用雞胚而不是成體組織或細(xì)胞來研究NDV與宿主的關(guān)系。

目前關(guān)于NDV強(qiáng)弱毒株感染宿主組織miRNAs調(diào)控的研究比較少。在本研究中，發(fā)現(xiàn)F48E9感染后可引起64個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNAs，其中33個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)，31個(gè)miRNAs的表達(dá)量下調(diào)；La Sota可以引起61個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中36個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)，25個(gè)miRNAs的表達(dá)量下調(diào)；La Sota感染組與F48E9感染組相比，共有49個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中27個(gè)上調(diào)miRNAs，22個(gè)下調(diào)miRNAs。對靶基因進(jìn)行GO和KEGG Pathway生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)靶基因可能參與到細(xì)胞的代謝過程，也有少量基因參與了生物學(xué)調(diào)節(jié)過程。在這些差異基因中也有一些miRNAs在宿主免疫反應(yīng)中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，如miR-9、miR-203a、miR-375及miR-147等。miR-9可以通過靶向結(jié)合IRF2來抑制I型IFN的產(chǎn)生，從而負(fù)向調(diào)控宿主抗病毒免疫反應(yīng)[14]。miR-203a可以通過靶向結(jié)合TNF-α和IL24來抑制皮膚免疫反應(yīng)[15]。miR-375可以靶向調(diào)控Jak2-STAT3信號通路進(jìn)而介導(dǎo)調(diào)節(jié)幽門螺旋桿菌誘導(dǎo)的炎癥，隨后通過影響TWIST1和BCL-2的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)化[16]。本研究也篩選了多個(gè)參與抗NDV感染通路的miRNAs，如gga-miR-203a、gga-miR-455-5p、gga-miR-128-1-5p、gga-miR-128-3p、gga-miR-133b、gga-miR-135a-2-3p、gga-miR-1779等，這些miRNAs如何調(diào)控NDV的感染和復(fù)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)(圖3)。

圖3 抗NDV信號傳導(dǎo)通路中涉及的miRNAs

本研究利用small RNA測序技術(shù)研究了NDV F48E9、La Sota感染雞胚組織時(shí)miRNAs表達(dá)譜的變化，對差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)在NDV感染時(shí)共有98個(gè)差異表達(dá)miRNAs。對篩選的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測分析和生物信息學(xué)富集分析，預(yù)測發(fā)現(xiàn)NDV感染雞胚時(shí)miRNAs主要參與調(diào)控生長代謝、細(xì)胞周期及免疫反應(yīng)等通路上相關(guān)基因的表達(dá)，并篩選多個(gè)可以影響NDV感染相關(guān)基因的miRNAs。本研究不僅填補(bǔ)了NDV感染后miRNAs表達(dá)譜的研究，也為臨床ND防控研究提供了新的思路與數(shù)據(jù)支撐。