調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在干眼中的免疫調(diào)控作用相關(guān)研究

王慧鳳 綜述 阮慶國(guó) 謝立信 審校

1山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科研究所 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院，青島 266071；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科研究所 山東省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，青島 266071

干眼是以淚膜穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征并伴有眼部不適癥狀的多因素眼表疾病，淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透性升高、眼表炎癥與損傷及神經(jīng)感覺(jué)異常是其主要的病理機(jī)制[1]。近年來(lái)研究表明，免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在干眼的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]，淚液滲透壓升高或淚膜不穩(wěn)定會(huì)引起眼表炎癥反應(yīng)[3]，并伴有致病性的CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)和Th1，從而破壞免疫穩(wěn)態(tài)造成淚腺功能單位受損。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)能夠通過(guò)抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的功能，維持免疫穩(wěn)態(tài)[4],其通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用來(lái)抑制干眼的炎癥反應(yīng)，從而在干眼的發(fā)生和發(fā)展及治療中發(fā)揮重要作用。本文就Treg與干眼的相關(guān)性及其在干眼發(fā)病機(jī)制、治療等方面中的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 Treg概述

Treg作為免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)細(xì)胞，在維持免疫耐受和控制免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。根據(jù)Treg來(lái)源可分為胸腺來(lái)源的Treg(thymus Treg，tTreg)、外周體內(nèi)誘導(dǎo)的Treg(peripheral Treg，pTreg)和體外誘導(dǎo)的Treg(induced Treg，iTreg)。叉頭蛋白3(forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)是調(diào)控Treg功能和發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Treg發(fā)揮免疫抑制功能有不可或缺的作用。目前通常用Foxp3作為確定Treg存在的標(biāo)記蛋白，除此之外還可采用CD25、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)等。Treg可通過(guò)5種不同的機(jī)制來(lái)調(diào)控免疫應(yīng)答：(1)利用細(xì)胞表面分子如CTLA-4、IL-2受體發(fā)揮免疫抑制作用；(2)分泌IL-10、TGF-β等抑制效應(yīng)性T細(xì)胞(T effector cell，Teff)的生物學(xué)功能；(3)釋放穿孔素或顆粒酶等細(xì)胞毒性分子促進(jìn)Teff凋亡[5]；(4)裂解胞外ATP等物質(zhì)產(chǎn)生腺苷，促進(jìn)Teff的胞內(nèi)cAMP升高，進(jìn)而干擾其代謝、增生與生物學(xué)功能[6]；(5)誘導(dǎo)耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)或抑制抗原提呈細(xì)胞(antigen present cell，APC)的成熟等發(fā)揮免疫抑制作用[7]。

研究表明，Treg具有可塑性和不穩(wěn)定性。正常情況下，部分Foxp3+T細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)Foxp3失表達(dá)的情況，此時(shí)細(xì)胞不再具有免疫抑制功能卻表現(xiàn)出記憶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞的表型和特征，或者是轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)h17細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)疾病的發(fā)展[8]。當(dāng)其處于淋巴細(xì)胞增生或Th1、Th17細(xì)胞極化的狀態(tài)下，該轉(zhuǎn)化過(guò)程會(huì)更明顯[9]。具有免疫抑制功能的Foxp3+Treg向促炎性Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素[10]。

2 Treg與干眼

2.1 Treg與干眼的相關(guān)性

Treg與多種自身免疫性疾病相關(guān)，如自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，此外與干眼的發(fā)生和發(fā)展也有密切的關(guān)系[11]。研究表明，采用干燥應(yīng)力環(huán)境誘導(dǎo)小鼠發(fā)生干眼，并將該小鼠中的CD4+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至免疫缺陷的裸鼠，裸鼠則會(huì)出現(xiàn)干眼癥狀，而當(dāng)過(guò)繼轉(zhuǎn)移至正常小鼠時(shí)則不會(huì)出現(xiàn)干眼癥狀；如果將上述正常受體小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Foxp3+Treg抑制后，小鼠會(huì)出現(xiàn)干眼癥狀，若補(bǔ)充CD4+CD25+Foxp3+Treg，則可抑制干眼的發(fā)生[12]。由此說(shuō)明，CD4+CD25+Foxp3+Treg具有抑制干眼發(fā)生的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，干眼中Treg的功能和數(shù)量存在異常。Chauhan等[2]對(duì)干眼小鼠與非干眼小鼠中Treg進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)干眼小鼠中Treg抑制T細(xì)胞增生、活化能力減弱，而Treg數(shù)量未見(jiàn)明顯變化；同樣在原發(fā)性干燥綜合征(Sj?gren syndrome，SS)患者中CD4+CD25high細(xì)胞的百分比也沒(méi)有明顯改變[13]，但是該研究中對(duì)患者的臨床特征及細(xì)胞功能未作描述。然而Li等[14]發(fā)現(xiàn)干眼患者眼表組織中Treg數(shù)量減少；在SS中，研究者同樣發(fā)現(xiàn)患者外周血中常規(guī)CD25highTreg細(xì)胞數(shù)量降低[15]。此外Alunno等[16]發(fā)現(xiàn)，在SS患者中雖然常規(guī)的CD4+CD25highTreg減少，但是CD4+CD25lowGITR+細(xì)胞在外周血中擴(kuò)增，并且通過(guò)表型分析，該類(lèi)型的細(xì)胞顯示Treg的標(biāo)志物對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞具有抑制作用。因此在T細(xì)胞活化的特定條件下，CD25并不是鑒定Treg很好的標(biāo)志物，非Treg也可以表達(dá)CD25，所以這可能是導(dǎo)致上述結(jié)果存在差異的原因。

Treg與干眼患者的年齡、性別等危險(xiǎn)因素存在一定關(guān)系。干眼發(fā)病率會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，在50歲以上人群中，干眼患病率為11.3%，而80歲以上人群發(fā)病率可接近20%[17]。研究表明，Treg功能受損是導(dǎo)致該現(xiàn)象出現(xiàn)的主要原因[18]。與老年干眼患者相比，年輕人的眼表中駐留大量的Treg，可以抑制Th1/Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而有助于維持眼表穩(wěn)態(tài)[19]。在老年小鼠中，Treg能夠抑制產(chǎn)生干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的CD4+T細(xì)胞，但是抑制產(chǎn)生IL-17的CD4+T細(xì)胞功能受損[20]。此外隨著年齡增長(zhǎng)，CD4+CD25+Foxp3+Treg可轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生IL-17的效應(yīng)細(xì)胞[21-22]。Coursey等[23]應(yīng)用NOD.B10.H2b小鼠進(jìn)行相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，在頸部淋巴結(jié)、淚腺中觀察到Treg的百分比增加，但是這些細(xì)胞喪失了免疫抑制功能，雖然仍表達(dá)Foxp3，但是卻分泌促炎因子IL-17和IFN-γ。在Treg過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了來(lái)自老年個(gè)體的Treg可以導(dǎo)致干眼，而來(lái)自年輕的Treg沒(méi)有出現(xiàn)，由此證明產(chǎn)生促炎因子的Treg具有致病性[23]。因此Treg的可塑性可能是導(dǎo)致干眼發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加的重要因素之一。

在干眼患者性別分析研究中發(fā)現(xiàn)，基于女性健康研究的標(biāo)準(zhǔn)，女性干眼患病率高于男性[24-25]。通過(guò)對(duì)干燥應(yīng)力環(huán)境誘導(dǎo)的干眼小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在雌性小鼠淋巴結(jié)中Treg數(shù)量少于雄性小鼠，且干眼癥狀更嚴(yán)重[26]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在雌性干眼小鼠引流淋巴結(jié)中，多形核中性粒細(xì)胞和脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)形成顯著減少，并且這2種物質(zhì)處于功能抑制狀態(tài)，這會(huì)導(dǎo)致淋巴結(jié)中Treg減少，而效應(yīng)T細(xì)胞增加，進(jìn)而導(dǎo)致雌性小鼠干眼更嚴(yán)重。當(dāng)給予LXA4時(shí)，F(xiàn)oxp3+Treg數(shù)量會(huì)恢復(fù)，從而顯著抑制Th1細(xì)胞、部分抑制Th17細(xì)胞的促炎作用，減輕干眼體征。

2.2 Treg調(diào)控干眼的發(fā)病機(jī)制

干眼作為一種多因素導(dǎo)致眼表紊亂的慢性疾病，雖然其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在干眼的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[27]。Treg作為一類(lèi)免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞，可參與調(diào)控干眼的炎癥反應(yīng)。

雖然Treg可通過(guò)多種機(jī)制抑制炎癥反應(yīng)，但根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)其主要是通過(guò)以下2種機(jī)制在干眼中發(fā)揮作用(圖1):(1)Treg直接分泌免疫抑制因子TGF-β、IL-10來(lái)抑制效應(yīng)T細(xì)胞[12]。(2)通過(guò)作用于APC間接發(fā)揮抑制效應(yīng)T細(xì)胞的作用。當(dāng)環(huán)境或微生物的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致眼表的微環(huán)境受到破壞，細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、趨化因子等會(huì)隨之產(chǎn)生，促進(jìn)APC的成熟并向引流淋巴結(jié)遷移。遷移到引流淋巴結(jié)的APC能夠激活na?ve T細(xì)胞使其成為效應(yīng)T細(xì)胞，隨后該細(xì)胞獲得趨化因子受體(如CCR5、CXCR3)并遷移至眼表引起炎癥反應(yīng)[28]。正常情況下，Treg能夠調(diào)控該過(guò)程。tTreg離開(kāi)胸腺時(shí)，趨化因子受體CCR7、CD62L表達(dá)上調(diào)，促使其向次級(jí)淋巴結(jié)遷移，Treg可與攜帶抗原的DCs產(chǎn)生相互作用從而阻滯效應(yīng)T細(xì)胞的激活[29]；此外，Treg可通過(guò)下調(diào)共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)降低DCs激活效應(yīng)T細(xì)胞的能力；還可以通過(guò)誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生促凋亡分子促進(jìn)T細(xì)胞凋亡[29-30]。

Treg介導(dǎo)的黏膜免疫耐受在預(yù)防干眼發(fā)病的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而當(dāng)膜免疫耐受被打破時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor，NF)-κB信號(hào)激活并引起免疫炎癥反應(yīng)[31]。激活的NF-κB信號(hào)會(huì)引起Treg活性降低，而Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞活性增強(qiáng)(圖1)。Treg活性降低導(dǎo)致其對(duì)干眼的炎癥抑制作用減弱，Th1和Th17的活性增強(qiáng)則會(huì)加重干眼的發(fā)生和發(fā)展，Th1可通過(guò)產(chǎn)生IFN-γ導(dǎo)致結(jié)膜鱗狀化生和誘導(dǎo)結(jié)膜細(xì)胞凋亡，同時(shí)也會(huì)損害結(jié)膜中的杯狀細(xì)胞；Th17通過(guò)分泌IL-17誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-3和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的產(chǎn)生，導(dǎo)致角膜上皮屏障破壞[32]。當(dāng)局部應(yīng)用NF-κB抑制劑時(shí)可降低眼部角膜上皮損傷和IL-1β、IL-6水平，研究表明該作用是由增強(qiáng)的Treg免疫應(yīng)答所介導(dǎo)[31]。

圖1 Treg調(diào)控干眼的發(fā)病機(jī)制 Treg：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；IL：白細(xì)胞介素；TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；APC：抗原提呈細(xì)胞；Th：輔助性T細(xì)胞

3 Treg在干眼治療中的應(yīng)用

通過(guò)對(duì)干眼病理過(guò)程、影響因素、臨床癥狀等多方面的深入研究，干眼的治療手段也在不斷完善和發(fā)展，但目前臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)不一，療效也存在一定差距[33-34]。因此基于Treg在干眼中的作用，靶向Treg將為干眼的治療帶來(lái)新的希望。

3.1 增加Treg數(shù)量

研究者提出可以通過(guò)從外周血中獲取Treg，然后進(jìn)行體外擴(kuò)增并過(guò)繼轉(zhuǎn)移至患者體內(nèi)，增加循環(huán)系統(tǒng)中Treg的數(shù)量，從而減輕或消除炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的損傷[35]。Siemasko等[12]證明了通過(guò)體外擴(kuò)增Treg并注入干眼小鼠體內(nèi)的方式，可達(dá)到抑制眼表炎癥反應(yīng)的目的。雖然這種過(guò)繼轉(zhuǎn)移方式效率高，不良反應(yīng)小，具有很好的潛力，但是應(yīng)用到臨床中還存在一定的問(wèn)題，例如如何在體外擴(kuò)增足量的Treg是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題，而且需要標(biāo)準(zhǔn)化的擴(kuò)增過(guò)程且確保細(xì)胞沒(méi)有受到污染；同時(shí)，Treg的可塑性可導(dǎo)致其分化為效應(yīng)T細(xì)胞，這也是需要解決的問(wèn)題。此外，可以通過(guò)招募體內(nèi)Treg的方式來(lái)達(dá)到治療干眼的效果[36]。該方法是基于生物可降解聚合物制成的緩釋系統(tǒng)技術(shù)，可以維持趨化因子CCL22的梯度，有效地將Treg招募至緩釋系統(tǒng)的植入點(diǎn)，從而緩解干眼體征，如增加杯狀細(xì)胞密度、促進(jìn)角膜上皮完整性、增加淚液生成量。

3.2 促進(jìn)Treg分化

Ratay等[37]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用可降解聚合物微球(TRI microspheres)局部緩釋系統(tǒng)可以促進(jìn)Treg的分化以減輕干眼癥狀，該微球是由TGF-β1、雷帕霉素、IL-2組成的。雷帕霉素是一種mTOR抑制劑，可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的產(chǎn)生和增生，而且既往研究證明，使用可降解微球維持TGF-β、雷帕霉素和IL-2的濃度能夠增加在體外誘導(dǎo)na?ve CD4+T細(xì)胞向Foxp3+Treg分化的效率[38]。在應(yīng)用該微球治療干眼的過(guò)程中可以觀察到，淚腺中Foxp3+Treg的比例增加，IFN-γ、IL-6、IL-2等炎性因子表達(dá)降低，干眼相關(guān)癥狀減輕。因此，該研究通過(guò)利用Treg來(lái)恢復(fù)眼部的局部免疫穩(wěn)態(tài)為干眼的抗炎治療提供了一種潛在策略。

此外，還可通過(guò)局部應(yīng)用瑞巴派特促進(jìn)Treg的分化來(lái)治療干眼。瑞巴派特因具有抗炎、抗氧化和促進(jìn)胃粘膜分泌的作用被廣泛應(yīng)用于胃炎和胃潰瘍的治療。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，該藥也可用于干眼的治療。Fu等[39]將2%的瑞巴派特滴眼液用于干眼小鼠，每日4次，持續(xù)2周，結(jié)果顯示該藥可以恢復(fù)干眼引起的結(jié)膜和淚腺組織病理學(xué)的變化，延長(zhǎng)干眼小鼠的淚膜破裂時(shí)間及增加淚液產(chǎn)生，并且應(yīng)用該藥治療的小鼠淚腺及角膜組織中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17及IL-23含量減少，這是通過(guò)促進(jìn)Treg分化并抑制Th17細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞與Treg的平衡來(lái)抑制干眼的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，Treg可通過(guò)發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用減輕干眼的炎癥反應(yīng)從而在其發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。通過(guò)靶向Treg來(lái)治療干眼具有良好的臨床應(yīng)用前景。但是由于Treg在體內(nèi)的數(shù)量較少，而體外擴(kuò)增卻面臨著細(xì)胞穩(wěn)定性、可塑性、純度等多方面的問(wèn)題，所以在治療方面的應(yīng)用仍要開(kāi)展進(jìn)一步的研究。此外，雖然目前對(duì)于Treg在干眼中維持免疫穩(wěn)態(tài)及調(diào)控方面有較多的研究，但是對(duì)于干眼患者眼表的炎癥微環(huán)境通過(guò)何種分子機(jī)制調(diào)控Treg功能的研究還相對(duì)欠缺，因此通過(guò)對(duì)此方面深入研究，可以加深與拓展對(duì)干眼等眼科相關(guān)免疫炎癥性疾病病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)和理解，從而為疾病的臨床診療提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突