血漿外泌體miR-214-3p作為葡萄膜黑色素瘤診斷及預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的研究

周文達(dá) 邵蕾 董力 史緒晗 張瑞恒 李赫妍 吳昊天 魏文斌

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 北京同仁眼科中心 眼內(nèi)腫瘤診治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 醫(yī)學(xué)人工智能研究與驗(yàn)證工信部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100730

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)是成人眼內(nèi)常見的惡性腫瘤，臨床工作中主要依靠有經(jīng)驗(yàn)的眼科醫(yī)生采用檢眼鏡聯(lián)合眼部超聲、頭顱MRI等影像學(xué)檢查來確診[1-2]，缺乏客觀量化指標(biāo)，術(shù)后組織病理學(xué)檢查仍然是診斷UM的金標(biāo)準(zhǔn)。雖然病理診斷的準(zhǔn)確性高，但需要摘除眼球，對(duì)患者創(chuàng)傷大，而且隨著鞏膜外放射敷貼等局部治療方法的出現(xiàn)，大多數(shù)患者已經(jīng)不需要行眼球摘除術(shù)，限制了病理學(xué)診斷方法的應(yīng)用。因此尋找一種無創(chuàng)、簡便并且可以量化的新型UM診斷指標(biāo)具有重要意義。UM有發(fā)生血源性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的傾向，即使對(duì)眼內(nèi)原發(fā)病灶進(jìn)行治療，也有超過50%的患者會(huì)發(fā)生全身轉(zhuǎn)移[3-4]，而已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的UM尚缺乏有效的治療方法[5]，盡早對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)的UM進(jìn)行治療可能會(huì)減少轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[6]，因此早期對(duì)UM的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其可促進(jìn)或抑制靶向mRNA的表達(dá)，在大多數(shù)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色[7]。許多分泌型miRNA在不同類型腫瘤患者的體液中被發(fā)現(xiàn)，如血漿、唾液、尿液、淚液等，腫瘤源性的miRNA可以穩(wěn)定存在于患者血液中，是一種理想的生物標(biāo)志物[8]。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)有望成為UM診斷及預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的miRNA，如血漿miR-199a-3p對(duì)UM診斷的效能最強(qiáng)，血漿miR-21-5p、miR-214-3p等具有成為UM診斷和預(yù)后評(píng)估分子標(biāo)志物的潛力[9]。MiRNA的分子生物學(xué)通路比較復(fù)雜，同一miRNA可以擁有多個(gè)靶標(biāo)，關(guān)于miR-21-5p的分子生物學(xué)機(jī)制研究比較全面，其在胃癌、肺癌和結(jié)腸癌中均發(fā)揮了促進(jìn)癌癥發(fā)生和發(fā)展的作用[10-12]。目前的研究顯示其在UM中也發(fā)揮促癌作用[13]，其分子通路可能是抑制p53基因表達(dá)，進(jìn)而增加LASP1蛋白表達(dá)，促進(jìn)UM的增生與侵襲[14]。與miR-21-5p不同，除本課題組外，目前尚無miR-214-3p在UM發(fā)生和發(fā)展中作用的研究，本課題組之前的研究顯示miR-214-3p在UM腫瘤組織中顯著下降[15]，血漿miR-214-3p在UM患者中也顯著下降，這提示miR-214-3p可能在UM中發(fā)揮抑癌作用。但我們比較不同類型UM患者的血漿miR-214-3p水平后發(fā)現(xiàn)，雖然梭形細(xì)胞型UM和類上皮細(xì)胞型UM患者的血漿miR-214-3p水平均顯著下降，但梭形細(xì)胞型UM患者下降更明顯，這似乎又對(duì)miR-214-3p在UM中的機(jī)制提出了新的疑問。外泌體是一種直徑為40～100 nm的細(xì)胞外囊泡，由真核細(xì)胞主動(dòng)分泌，其存在于包括血漿在內(nèi)的幾乎所有體液中[16-18]。本研究選擇miR-214-3p作為候選miRNA，測(cè)定其在UM患者血漿外泌體中的表達(dá)水平，擬探討其作為UM生物標(biāo)志物的潛力，并為其在UM中作用機(jī)制研究提供新思路。

表1 各組受檢者基線資料比較Table 1 Comparison of demographic characteristics among different groups組別樣本量年齡#(x±s,歲)性別*(男/女,n)腫瘤直徑#(x±s,mm)腫瘤高度#(x±s,mm)不同部位腫瘤眼數(shù)*脈絡(luò)膜睫狀體健康對(duì)照組1041.0±5.2a5/5----原位梭形細(xì)胞型UM組1044.7±4.5a5/510.9±6.28.2±3.391原位類上皮細(xì)胞型UM組1040.9±7.8a5/510.7±6.89.4±5.782轉(zhuǎn)移型UM組552.8±12.64/115.3±3.711.7±2.050F/t值3.70-1.121.13-P值0.021.000.350.341.00 注:與轉(zhuǎn)移型UM組比較,aP<0.05(#:單因素方差分析,LSD- t檢驗(yàn);*:Fisher精確概率法) UM:葡萄膜黑色素瘤 Note:Compared with metastatic UM group,aP<0.05(#:One-way ANOVA,LSD- t test;*:Fisher exact test) UM:uveal melanoma

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用橫斷面研究方法，收集2015年12月至2019年10月于北京同仁醫(yī)院行眼球摘除術(shù)并確診為UM的患者25例，其中原位梭形細(xì)胞型UM組和原位類上皮細(xì)胞型UM組各10例，轉(zhuǎn)移型UM組5例(包括1例梭形細(xì)胞型UM患者和4例類上皮細(xì)胞型UM患者)；同期收集10名健康對(duì)照者作為健康對(duì)照組。所有健康對(duì)照者均確認(rèn)無腫瘤病史及長期服用藥物史。4個(gè)組患者年齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.70，P<0.05)，其中轉(zhuǎn)移型UM組年齡明顯大于其他3個(gè)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。4個(gè)組間患者性別比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)；原位梭形細(xì)胞型UM組、原位類上皮細(xì)胞型UM組和轉(zhuǎn)移型UM組腫瘤直徑、腫瘤高度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.12，P=0.35；F=1.13，P=0.34)；多數(shù)病例腫瘤均位于脈絡(luò)膜，3個(gè)組間不同部位腫瘤的眼數(shù)分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)；3個(gè)組腫瘤均未侵犯到鞏膜外(表1)。所有腫瘤患者及健康對(duì)照者均知曉研究目的和方法并自愿簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批文號(hào)：TRECKY2018-056)。

1.2 方法

1.2.1血漿標(biāo)本采集及處理 UM患者所有血液樣本均在確診后未行任何治療時(shí)采集。抽取患者和健康對(duì)照者空腹靜脈血，將血液樣本置于真空管中，常溫下靜置30 min，臺(tái)式低速離心機(jī)(80-2型，上海醫(yī)療器械股份有限公司)離心半徑10 cm，4 ℃下1 200 r/min離心15 min，收集血漿樣本置于-80 ℃保存供后續(xù)試驗(yàn)使用。納入患者抽取血液樣本后均于北京同仁醫(yī)院行眼球摘除術(shù)，摘除眼球樣本由北京同仁醫(yī)院眼科病理室行組織病理學(xué)檢查，明確腫瘤的組織病理學(xué)類型、位置、腫瘤高度、最大直徑及局部侵襲范圍。

1.2.2血漿外泌體的提取 37 ℃速融血漿樣本并移至新的離心管，用超速離心機(jī)CP100MX(日本日立有限公司)在4 ℃下2 000×g離心30 min；將上清液移至新的離心管，10 000×g再次離心45 min，以去除較大囊泡，取上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，收集過濾液。將過濾液移至新的離心管，選擇超速轉(zhuǎn)子，100 000×g離心70 min，去除上清，用10 ml預(yù)冷的1倍磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸后，再次離心70 min，去除上清，用150 μl預(yù)冷1倍PBS重懸。外泌體于-80 ℃保存。

1.2.3透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài) 從健康對(duì)照組、原位梭形細(xì)胞型UM組、原位類上皮細(xì)胞型UM組以及轉(zhuǎn)移型UM組中隨機(jī)抽取1例受試者的外泌體樣本行透射電子顯微鏡(HT-7700型，日本日立有限公司)觀察。吸取樣品10 μl滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液。醋酸雙氧鈾10 μl滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液。常溫干燥數(shù)分鐘。100 kV進(jìn)行電子顯微鏡檢測(cè)成像。

1.2.4外泌體粒徑分析 從健康對(duì)照組、原位梭形細(xì)胞型UM組、原位類上皮細(xì)胞型UM組以及轉(zhuǎn)移型UM組中隨機(jī)抽取2例受試者，取外泌體樣本10 μl，用PBS稀釋至30 μl，采用粒徑分析儀N30E(廈門福流生物科技有限公司)進(jìn)行外泌體粒徑分析。在外泌體樣品上樣前，先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器性能測(cè)試，合格后上樣，獲得儀器檢測(cè)外泌體的粒徑和濃度信息。

1.2.5Western blot法鑒定外泌體標(biāo)記蛋白 從健康對(duì)照組、原位梭形細(xì)胞型UM組、原位類上皮細(xì)胞型UM組以及轉(zhuǎn)移型UM組中隨機(jī)抽取2例受試者，提取外泌體蛋白，在37 ℃中速融外泌體，并迅速加入6倍RIPA裂解液，混勻后在冰上裂解30 min，期間混勻，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性，SDS PAGE凝膠電泳，80 V跑膠至樣品跑出濃縮膠，轉(zhuǎn)100 V跑膠至溴酚藍(lán)至膠底部，電泳完畢后取出電泳膠，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，將膜按蛋白面朝上浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %脫脂牛奶TBST中封閉1 h。將膜浸泡于配制好的TSG101(ab125011)及Calnexin(ab22595)一抗溶液[抗體稀釋比例均為1∶ 1 000，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]中，4 ℃孵育過夜，洗膜后在相應(yīng)二抗(稀釋比例1∶ 5 000)溶液中室溫孵育約1 h，洗膜后將ECL發(fā)光液滴加到膜上避光反應(yīng)5 min，采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)ChemiScope 3000mini(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)曝光，保存圖片。

1.2.6血漿外泌體RNA的提取 取各組受試者血漿外泌體于EP管中，加入900 μl裂解液MZA，劇烈振蕩30 s，室溫放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；加入氯仿0.2 ml，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min，離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，將水相轉(zhuǎn)移至新管，加入2倍體積無水乙醇，混勻后加入吸附柱，靜置2 min，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加700 μl MRD去蛋白液于吸附柱中，靜置2 min，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；向吸附柱中加入500 μl漂洗液RW，靜置2 min，12 000 r/min離心1 min，棄廢液，重復(fù)上述步驟；12 000 r/min離心2 min，棄掉收集管，放置吸附柱10 min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除；將吸附柱放入新管中，向膜中央滴加15 μl RNase Free ddH2O，室溫放置5 min，12 000 r/min，離心2 min，得到RNA。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血漿外泌體miR-214-3p表達(dá)水平 以11 μl模板RNA為基礎(chǔ)，以U6作為內(nèi)參基因，配置15 μl殘存基因組DNA去除體系孵育后使用通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(11141ES60)[中國翊圣生物科技(上海)股份有限公司]獲取模板cDNA，隨后配置實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，包括實(shí)時(shí)PCR熒光定量試劑盒(11201ES08)[中國翊圣生物科技(上海)股份有限公司]試劑10 μl，引物1 μl，模板cDNA 5 μl，加無菌超純水至20 μl。引物序列見表2。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀MA-6000(蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司)，95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)分樣進(jìn)行3次。采用2-ΔΔct法計(jì)算miRNAs相對(duì)表達(dá)水平。

表2 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for reverse transcription andreal-time fluorescence quantitative PCR引物引物序列逆轉(zhuǎn)錄 miR-214-3p5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACTGCCTG-3' U65'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'實(shí)時(shí)熒光定量PCR miR-214-3p正向:5'-ACAGCAGGCACAGACAGG-3'反向:5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3' U6正向:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'反向:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);miR:微小RNA Note:PCR:polymerase chain reaction;miR:microRNA

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體的鑒定

透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，所提取外泌體外形呈一側(cè)凹陷的半球形結(jié)構(gòu)，直徑約100 nm。所有樣本的囊泡粒徑分布符合外泌體粒徑范圍，所有樣本平均粒徑大小為(82.0±2.7)nm。Western blot結(jié)果顯示，外泌體特異性標(biāo)記蛋白TSG101條帶均為陽性，陰性標(biāo)記蛋白Calnexin均呈陰性(圖1)。

圖1 血漿外泌體的鑒定 A：透射電子顯微鏡觀察(×60 000,標(biāo)盡=100 nm) 可見4個(gè)樣本囊泡形態(tài)均完整，呈一側(cè)凹陷的半球形外觀，直徑約100 nm B：粒徑分析 8個(gè)樣本囊泡的平均粒徑均在79～84 nm C：Western blot檢測(cè) 所有樣本中外泌體標(biāo)志蛋白TSG101顯示條帶，外泌體陰性標(biāo)志蛋白Calnexin均未顯示條帶 1：健康對(duì)照組；2：原位梭形細(xì)胞型UM組；3：原位類上皮細(xì)胞型UM組；4：轉(zhuǎn)移型UM組

2.2 各組血漿外泌體miR-214-3p相對(duì)表達(dá)量比較

健康對(duì)照組、原位梭形細(xì)胞型UM組、原位類上皮細(xì)胞型UM組和轉(zhuǎn)移型UM組血漿外泌體miR-214-3p相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.93，P=0.02)，其中健康對(duì)照組miR-214-3p相對(duì)表達(dá)量均高于其他3個(gè)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表3)。

表3 各組血漿外泌體miR-214-3p相對(duì)表達(dá)量比較[M(Q1,Q3)]Table 3 Comparison of the relative expression level of plasmaexosome miR-214-3p among different groups (M[Q1,Q3])組別樣本量miR-214-3p相對(duì)表達(dá)量健康對(duì)照組100.86(0.57,1.49)原位梭形細(xì)胞型UM組100.11(0.07,0.64)a原位類上皮細(xì)胞型UM組100.46(0.14,0.91)a轉(zhuǎn)移型UM組50.43(0.23,0.56)aH值9.93P值0.02 注:與健康對(duì)照組比較,aP<0.05(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),Mann-Whitney U檢驗(yàn)) miR:微小RNA;UM:葡萄膜黑色素瘤 Note:Compared with healthy control group,aP<0.05 (Kruskal-Wallis H test,Mann-Whitney U test) miR:microRNA;UM:uveal melanoma

2.2.1血漿外泌體miR-214-3p對(duì)UM的診斷效能 原位UM組(包括原位梭形細(xì)胞型UM組和原位類上皮細(xì)胞型UM組患者)血漿外泌體中miR-214-3p相對(duì)表達(dá)水平為0.24(0.10，0.67)，較健康對(duì)照組的0.86(0.57，1.49)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.62，P<0.01)。使用ROC曲線對(duì)血漿外泌體miR-214-3p的診斷效能進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示血漿外泌體miR-214-3p的AUC為0.795(圖2)。進(jìn)一步比較結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移型UM組血漿外泌體miR-214-3p的相對(duì)表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.08，P<0.05)。

圖2 ROC曲線評(píng)估血漿外泌體miR-214-3p對(duì)UM的診斷效能 AUC：曲線下面積

2.2.2血漿外泌體miR-214-3p對(duì)UM的預(yù)后評(píng)估效能 原位梭形細(xì)胞型UM組和原位類上皮細(xì)胞型UM組血漿外泌體miR-214-3p的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.66，P=0.09)。進(jìn)一步對(duì)比轉(zhuǎn)移型UM組和原位類上皮細(xì)胞型UM組血漿外泌體miR-214-3p表達(dá)水平，結(jié)果顯示2個(gè)組間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.84，P=0.80)。

3 討論

MiRNA作為一種非編碼RNA，通過負(fù)向調(diào)節(jié)特定mRNA來發(fā)揮生物學(xué)作用，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[19]。MiRNA除了存在于細(xì)胞質(zhì)中，還分布于包括血液在內(nèi)的所有體液中，這種存在于血液中的miRNA稱為循環(huán)miRNA，其能夠穩(wěn)定存在于血漿中，是一種極具潛力的生物標(biāo)志物[20]。循環(huán)miRNA存在的形式主要包括與蛋白結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合體，與脂蛋白結(jié)合形成脂蛋白核酸復(fù)合體以及存在于以外泌體為代表的細(xì)胞外囊泡中[21-23]。外泌體中的miRNA由囊膜包裹，可以穩(wěn)定存在于血液中，避免被核酸酶分解，有望成為一種新型、無創(chuàng)、可以量化的腫瘤生物標(biāo)志物。此外，外泌體由腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分裝并分泌，參與細(xì)胞間信息傳導(dǎo)，影響腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境，對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到重要作用[18]。研究外泌體miRNA的差異表達(dá)對(duì)腫瘤的分子生物機(jī)制研究同樣有重要價(jià)值。

在先前的研究中，miR-214-3p含量在梭形細(xì)胞型和原位類上皮細(xì)胞型UM腫瘤組織中較正常葡萄膜組織均顯著下降，但在不同類型的UM腫瘤組織間無顯著差異[15]。但miR-214-3p在UM患者的血漿中顯著下降，其對(duì)UM的診斷效能為0.775，原位梭形細(xì)胞型UM患者血漿中miR-214-3p下降較原位類上皮細(xì)胞型UM患者更加明顯，血漿miR-214-3p對(duì)UM病理類型的鑒別效能可達(dá)0.930[9]。本研究基于課題組先前的研究，選定miR-214-3p作為候選miRNA，進(jìn)一步驗(yàn)證了其在血漿外泌體中的表達(dá)水平。

本研究結(jié)果顯示，miR-214-3p在UM患者的血漿外泌體中顯著下降，而且血漿外泌體miR-214-3p的診斷效能高于血漿miR-214-3p，這與我們先前的研究結(jié)果相符[9]。相比于血漿miRNA，外泌體miRNA能夠更好地抵抗核酸酶的分解，穩(wěn)定性更強(qiáng)，此外由于其為細(xì)胞主動(dòng)分泌，可以防止來自人體其他細(xì)胞裂解過程中被動(dòng)進(jìn)入循環(huán)的miRNA混淆。因此，外泌體miRNA是一種更加理想的生物標(biāo)志物。本研究也證實(shí)了外泌體miR-214-3p具有更好的診斷效能，為循環(huán)miR-214-3p在UM臨床診斷上的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

UM的組織病理學(xué)主要分為梭形細(xì)胞型、混合細(xì)胞型及類上皮細(xì)胞型3種，本研究根據(jù)病理類型分組，分為預(yù)后較好的梭形細(xì)胞型UM及預(yù)后較差的類上皮細(xì)胞型UM，探討了外泌體miR-214-3p與預(yù)后的關(guān)系。

本課題組先前的研究顯示，血漿miR-214-3p在類上皮細(xì)胞型UM患者中表達(dá)水平顯著高于梭形細(xì)胞型UM患者[9]。有研究認(rèn)為，在細(xì)胞中起到抑癌作用的miRNA會(huì)被選擇性地分泌到腫瘤細(xì)胞外，以抑制腫瘤細(xì)胞增生[24]?；趍iR-214-3p在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到抑癌作用[25-26]，推測(cè)類上皮細(xì)胞型UM細(xì)胞主動(dòng)分泌miR-214-3p的能力強(qiáng)于梭形細(xì)胞型UM細(xì)胞，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增生發(fā)育。本研究結(jié)果顯示，外泌體miR-214-3p的表達(dá)水平在2種不同病理類型UM患者的血液中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果與本課題組先前在腫瘤組織中的驗(yàn)證結(jié)果一致，即不同病理類型間miR-214-3p的表達(dá)水平無明顯差異。實(shí)際上循環(huán)miRNA的主要來源是血細(xì)胞，而且在腫瘤患者的血液中，免疫系統(tǒng)來源的miRNA也占很大比例，其不一定完全反映腫瘤組織miRNA的表達(dá)水平[24]，但外泌體由細(xì)胞主動(dòng)分泌，理論上其特異性要高于血漿miRNA[27]。同一miRNA作用的靶標(biāo)mRNA通常有上百個(gè)，miR-214-3p不僅參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，也參與炎癥等其他病理生理過程[28-29]，血漿miRNA中的差異可能是由于其他細(xì)胞來源的miR-214-3p干擾導(dǎo)致，循環(huán)miR-214-3p與UM預(yù)后可能無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移型UM患者的血漿外泌體miR-21-5p表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著下降，但與原位類上皮細(xì)胞型UM間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再次證明循環(huán)外泌體miR-21-5p可能對(duì)UM患者的預(yù)后缺乏評(píng)估能力。需要明確的是，除了外泌體miRNA，細(xì)胞也能主動(dòng)分泌以蛋白核酸復(fù)合物和脂蛋白核酸復(fù)合物形式存在的miRNA，參與生理病理過程的調(diào)節(jié)[21-22]，本研究結(jié)果并不能完全否定血漿miR-214-3p對(duì)UM預(yù)后的評(píng)估能力。

本研究測(cè)定了不同病理類型UM患者的循環(huán)miR-214-3p表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其具有成為UM早期診斷分子生物學(xué)標(biāo)志物的潛力，但其對(duì)UM的預(yù)后評(píng)估能力仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，循環(huán)miRNA作為重要的細(xì)胞間通訊手段，對(duì)于UM發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的研究也具有重要意義。現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-214-3p在多種腫瘤中具有抑癌作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[25-26,30-32]。基于本研究結(jié)果，miR-214-3p可能在UM中發(fā)揮抑癌作用，其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外的降低可能是UM發(fā)生的機(jī)制之一，這也為UM的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。本研究主要收集患者的血漿樣本，未對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行長期隨訪，有限的隨訪時(shí)間內(nèi)無患者出現(xiàn)終點(diǎn)事件，無法進(jìn)一步進(jìn)行生存分析。此外，未對(duì)患者治療后的循環(huán)miR-214-3p表達(dá)水平進(jìn)一步分析，且納入樣本量相對(duì)較小，未來仍需要在多樣本、多中心、包含不同種族的隊(duì)列中進(jìn)一步研究驗(yàn)證循環(huán)miR-214-3p對(duì)UM診斷及預(yù)后的評(píng)估能力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明周文達(dá)：直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章；邵蕾、董力：直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)；史緒晗、張瑞恒、李赫妍、吳昊天：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)；魏文斌：直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)、對(duì)文章知識(shí)性內(nèi)容的審閱和智力性內(nèi)容的修改及定稿