基于環(huán)境DNA方法的北京雁棲湖魚類調(diào)查

文/高婉茹 李雪健 席蕊 邢迎春* 趙亞輝

環(huán)境DNA（Environmental DNA，eDNA）指從土壤、水、冰川或沉積物等環(huán)境樣品中提取的DNA，可揭示過去和現(xiàn)今生物多樣性信息。eDNA發(fā)展初期主要用于對單一物種分布范圍和生物量的研究，隨著DNA宏條形碼和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，該方法已被應(yīng)用到河流、水庫和湖泊等水體的魚類調(diào)查中。傳統(tǒng)的魚類監(jiān)測往往依賴于網(wǎng)捕、電魚和誘捕等方法采集魚類樣品，利用形態(tài)學(xué)進(jìn)行物種鑒定，這在一定程度上給魚類資源帶來傷害，并對研究人員的分類學(xué)專業(yè)知識要求較高。eDNA方法是通過提取環(huán)境樣品中的DNA，利用特定引物對目標(biāo)片段進(jìn)行擴增，并利用高通量測序獲得的目標(biāo)片段序列進(jìn)行魚類物種鑒定。與傳統(tǒng)方法相比，具有非接觸性采樣、靈敏度高、檢出率高、成本較低和對生態(tài)環(huán)境破壞性較小等優(yōu)勢。湖泊相對于河流，流速更緩，其中的生物痕量DNA富集量更高，故更適合利用eDNA開展魚類檢測。

雁棲湖（又名北臺上水庫）是北京市雁棲湖生態(tài)發(fā)展示范區(qū)的核心區(qū)，2014年APEC會議和2017年“一帶一路”國際合作高峰論壇相繼在雁棲湖召開，使得雁棲湖具有較高的國際知名度。雁棲湖由東、西兩個湖（庫）區(qū)構(gòu)成，水面面積2.3km，總?cè)萘繛?830萬m，了解其魚類組成現(xiàn)狀有助于維持湖區(qū)水生生態(tài)，不僅對提升水體健康程度有重要意義，也有利于維護(hù)雁棲湖的知名度。目前，關(guān)于雁棲湖魚類的系統(tǒng)調(diào)查較少，同時受限于庫區(qū)管理要求和漁法限制，傳統(tǒng)調(diào)查方法恐很難完整呈現(xiàn)湖區(qū)魚類面貌。因此作者采取eDNA方法，結(jié)合以往積累的工作經(jīng)驗，對雁棲湖魚類組成進(jìn)行調(diào)查，并依據(jù)eDNA可取代物種數(shù)量，對魚類豐富度進(jìn)行評估。

一、材料與方法

（一）水樣品采集

分別于2021年4月和7月，在雁棲湖東、西湖區(qū)各選取9個和2個采樣點進(jìn)行水樣品采集，采樣點布設(shè)見圖1。在每個采樣點，使用采水器在水深1m處采集1L水樣品，重復(fù)采集3個樣品，共采集66個水樣品，低溫避光保存。為盡可能減少污染，在采樣前使用10%漂白劑對船只和采樣工具進(jìn)行清潔消毒，實驗操作人員在采樣過程中嚴(yán)格佩戴口罩和一次性手套，并在不同采樣點之間更換手套。

圖1 雁棲湖采樣點布設(shè)圖

（二）方法

對采集后的水樣品進(jìn)行eDNA富集、DNA提取、PCR擴增和高通量測序與數(shù)據(jù)分析等操作。使用直徑47mm、孔徑0.45μm的混合纖維素酯膜對水樣品進(jìn)行真空抽濾。將濾膜保存至2mL滅菌離心管，-10℃低溫冷凍保存。使用DNeasy Blood and Tissue DNA Extraction Kit試劑盒提取eDNA，并根據(jù)Renshaw提出的方法對試劑盒提供的DNA提取方案進(jìn)行改進(jìn)。使用分光光度計對提取的DNA樣品濃度進(jìn)行測定，保存于-20℃。

使用魚類線粒體1 2 S r R N A通用引物（正向序列：5’-A A A C T C G T G C C A G C C A C C-3’；反向序列：5’-GGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’）進(jìn)行PCR擴增，目標(biāo)片段長度為160bp～180bp。將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，根據(jù)濃度進(jìn)行等量混合，獲得濃度不低于20ng/μL的PCR產(chǎn)物混合物。將其送至北京華大基因科技有限公司進(jìn)行建庫和后續(xù)高通量測序，采用Illumina Novaseq高通量測序平臺進(jìn)行PE150雙端測序。原始測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析在Ubuntu操作環(huán)境下運行，使用Qiime2（版本2021.4）軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列拆分、拼接、去重和分子可操作分類單元（Molecular Operational Taxonomic Units，MOTUs）聚類等操作，以獲得MOTUs表。使用NCBI-BLAST軟件，將序列數(shù)≥10的MOTUs與NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中輻鰭魚綱序列進(jìn)行比對，完成物種注釋。

二、結(jié)果

（一）eDNA測序結(jié)果

雁棲湖eDNA樣品高通量測序獲得原始序列34.2G，序列數(shù)量為92668000條。經(jīng)點位拆分，共保留序列33145258條。對正反向序列進(jìn)行拼接和篩選，共保留序列14044492條，保留長度為160bp～180bp的序列并去除嵌合體，共獲得有效序列13989807條，每一個樣品的有效序列范圍為275614條～1320099條。按照100%聚類并保留≥10條序列數(shù)的MOTUs，共獲得1014個MOTUs。將匹配到同一物種的MOTUs序列進(jìn)行合并，共保留26個魚類MOTUs，其中陰性對照中未檢測到任何物種。

（二）基于eDNA的魚類物種組成

基于eDNA共檢測到魚類26種，隸屬于5目8科25屬（見表1）。其中土著魚類23種，占魚類物種總數(shù)的88.46%，隸屬于4目7科22屬；其他3種為外來物種，占總數(shù)的11.54%，包括大鱗副泥鰍、池沼公魚和河川沙塘鱧。從不同采樣點的魚類物種數(shù)量來看，1號、7號和11號采樣點的物種數(shù)最多，各24種，占檢測到物種總數(shù)的92.31%；其次是4號和10號采樣點，各檢測到21種，占檢測到物種總數(shù)的80.77%。所有采樣點檢測到的物種數(shù)量均超過總物種數(shù)的50%。從不同季節(jié)看，雁棲湖春季調(diào)查到魚類24種，隸屬于4目7科23屬；夏季調(diào)查到20種，隸屬于5目8科20屬。春、夏季均調(diào)查到的魚類共18種；僅于春季檢測到的魚類有6種，包括達(dá)氏紅鰭鲌、鳙、拉氏大吻鱥、東北頜須鮈、小黃黝魚和花鰍科sp.；僅夏季檢測到的魚類有2種，包括大鱗副泥鰍和青鳉。春季除3號、4號和5號采樣點外，其他采樣點檢測到的物種數(shù)均高于夏季。雁棲湖春、夏季所有采樣點均檢測到的魚類共9種，包括鯉、鯽、草魚、麥穗魚、紅鰭原鲌、鰱、寬鰭鱲、馬口魚和池沼公魚。

表1 雁棲湖魚類物種名錄

（三）魚類生態(tài)類型

根據(jù)生態(tài)習(xí)性，雁棲湖主要以定居型魚類為主。根據(jù)體型大小分析，小型魚類最多，為21種，占物種總數(shù)的80.77%；大型魚類共5種，占19.23%。根據(jù)棲息水層分析，雁棲湖內(nèi)中上層魚類最多，共10種，占物種總數(shù)的38.46%；其次是中下層魚類，共9種，占34.62%；底層魚類最少，共7種，占26.92%。根據(jù)攝食類型分析，雜食性魚類最多，共15種，占57.69%；其次是肉食性魚類10種，占38.46%；植食性魚類最少，僅1種。

（四）eDNA相對序列豐度

通過比較各魚類物種的eDNA序列相對豐度，池沼公魚的相對序列豐度最高，達(dá)34.12%；其次是鯽和鯉，分別占25.72%和15.22%，其他魚類均低于10%，這三種魚類在所有采樣點均被檢測到。根據(jù)春、夏季各物種eDNA相對序列豐度結(jié)果，春季魚類序列相對豐度超過10%的物種包括池沼公魚（36.27%）、鯉（24.26%）、鯽（20.69%）和鰱（11.17%）；夏季魚類序列相對豐度超過10%的物種包括鯽（32.16%）、池沼公魚（31.35%）和子陵吻蝦虎魚（17.13%）。根據(jù)雁棲湖春、夏季各采樣點魚類物種序列相對豐度（見圖2），11號采樣點是春、

圖2 雁棲湖春、夏季各采樣點魚類物種序列相對豐度

夏兩季魚類組成變化最明顯的樣點，春季以池沼公魚為主，夏季以子陵吻蝦虎魚為主。

三、分析與討論

（一）雁棲湖魚類組成分析

基于eDNA方法，雁棲湖魚類以鯉形目鯉科為主。從魚類區(qū)系組成看，目級水平上，鯉形目共19種，占魚類物種總數(shù)的73.08%；其次是鱸形目3種，占11.54%；鲇形目2種，占7.69%；頜針魚目和胡瓜魚目物種數(shù)量最少，各包括1種，分別占3.85%（見圖3a）?？萍壦缴?，鯉科魚類物種數(shù)最多，共17種，占總物種數(shù)的65.38%；其次是沙塘鱧科和花鰍科各2種，分別占7.69%；青鳉科、胡瓜魚科、蝦虎魚科、鲇科和鲿科各1種，分別占3.85%（見圖3b）。

圖3 雁棲湖目級和科級水平魚類物種組成（a.目級水平；b.科級水平）

雁棲湖屬于海河水系潮白河流域，歷史上在潮白河流域自然分布的土著魚類約有48種，現(xiàn)狀調(diào)查尚可發(fā)現(xiàn)39種，本研究調(diào)查到的雁棲湖土著魚類占到潮白河流域的58.97%。一些主要分布于山區(qū)溪流生境的種類未在雁棲湖發(fā)現(xiàn)，例如唇?、花?、棒花鮈等，這與雁棲湖典型的水庫靜水生境有很大關(guān)系，因此，紅鰭原鲌、達(dá)氏紅鰭鲌、鰱、鳙、?等成為雁棲湖魚類組成的主體。與地理位置且水體環(huán)境較近的懷柔水庫相比，魚類物種數(shù)量較為接近，在兩個水庫均有分布的物種共18種。

根據(jù)本研究的調(diào)查結(jié)果，雁棲湖共有3種外來魚類。大鱗副泥鰍和池沼公魚為發(fā)展?jié)O業(yè)養(yǎng)殖引進(jìn)的。根據(jù)相關(guān)記錄，湖區(qū)在1985年即從日本引進(jìn)池沼公魚推廣養(yǎng)殖，根據(jù)優(yōu)勢種分析，池沼公魚在雁棲湖已廣泛分布且生物量較高，該物種在所有采樣點均被檢測到，其中8個采樣點春、夏季序列相對豐度均超過20%。池沼公魚會吞食土著魚類的魚卵，導(dǎo)致土著魚類數(shù)量下降，甚至可能會導(dǎo)致一些魚類瀕臨滅絕。河川沙塘鱧原產(chǎn)于長江中下游地區(qū)，約2009年在北京發(fā)現(xiàn)，2013年以前其在北京地區(qū)為偶見種，種群數(shù)量稀少，然而近年來該物種已在北京多個水體暴發(fā)，本研究在8個采樣點均檢測到，說明其目前也是雁棲湖的主要外來魚類之一。河川沙塘鱧為肉食性魚類，其在雁棲湖的廣泛分布可能對同水域分布的小型魚類等具有巨大威脅。

（二）基于eDNA的雁棲湖魚類季節(jié)性差異

根據(jù)本研究結(jié)果，春季檢測到的魚類數(shù)量略高于夏季。對春、夏兩季的魚類豐富度進(jìn)行比較，雁棲湖超80%的采樣點物種豐富度表現(xiàn)為春季高于夏季，這與春季多為魚類的繁殖期有關(guān)，即春季魚類因為繁殖需要，往往產(chǎn)生聚群現(xiàn)象，因此檢測到的魚類數(shù)量更多。

（三）eDNA方法可以作為雁棲湖魚類多樣性長期監(jiān)測的首選方案

魚類傳統(tǒng)調(diào)查需依賴網(wǎng)捕或電魚等方式，在北京等地愈加嚴(yán)格的禁漁措施下，采用傳統(tǒng)方式進(jìn)行魚類多樣性調(diào)查的難度不斷增加，很難使用拖網(wǎng)和電魚等對生境破壞性較大的方式進(jìn)行調(diào)查，且魚類物種的形態(tài)學(xué)鑒定往往依賴于科研人員的分類學(xué)經(jīng)驗和水平。本研究團(tuán)隊近兩年在雁棲湖利用地籠進(jìn)行調(diào)查，僅捕獲到8種魚類，明顯低于利用eDNA方法。一些體型較大的魚類，如草魚、鰱等則需要采用大型網(wǎng)具才能捕獲。從調(diào)查所得物種數(shù)量來看，兩種調(diào)查方法的優(yōu)勢種都包括鯽和池沼公魚，這也反映了本研究基于序列豐度進(jìn)行的優(yōu)勢種篩選結(jié)果具有一定的可信度和準(zhǔn)確性。因此eDNA方法可以作為類似水體進(jìn)行長期魚類監(jiān)測的首選方法。

eDNA參考數(shù)據(jù)庫是保證eDNA監(jiān)測結(jié)果質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一，僅依賴于NCBI （National Center for Biotechnology Information）參考數(shù)據(jù)庫會導(dǎo)致部分本地物種無法識別，目前迫切需要建立北京乃至海河流域魚類eDNA參考序列數(shù)據(jù)庫，一方面可以提高魚類物種鑒定的準(zhǔn)確性，另一方面也為eDNA方法的推廣提供基礎(chǔ)。