北方黑土地花生根際叢枝菌根菌（AMF）分離鑒定及應用

王雪霏，曹哲，楊鑰，周馨瞳，王子郡，邵文杰，周子愷，徐佳璐，孟令波，鄭苗苗

北方黑土地花生根際叢枝菌根菌（AMF）分離鑒定及應用

王雪霏1，曹哲1，楊鑰1，周馨瞳1，王子郡1，邵文杰1，周子愷1，徐佳璐2，孟令波1，鄭苗苗1

（1. 哈爾濱學院 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150001；2. 哈爾濱醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院，黑龍江 哈爾濱 150001）

采集黑龍江省種植花生區(qū)域的黑土土樣，通過濕篩法從花生根際土樣中分離純化出AMF菌孢子，根據(jù)形態(tài)學特征和分子生物學進行鑒定，獲得一株AMF菌，為株幼套球囊霉（），通過Single spore isolating方法完成AMF菌培養(yǎng)繁殖，孢子量350個/g，將獲得的純凈孢子接種到以花生為宿主植物的盆缽中，進行擴大繁殖．AMF菌能夠促進花生根系伸長生長，提高根系對N，P，K無機鹽離子的吸收，而且還具有抗倒伏作用，提高了花生產量，同時提高花生的油脂含量，能使花生中油脂含量提高2.3%～2.7％．

AMF菌；東北四粒紅花生；油脂

Arbuscular Mycorrhizal Fungi（AMF）菌是一種與植物根際共生關系的叢枝菌根真菌，主要包括木霉、球囊霉、地管囊霉等，能夠促進植物根對N，P，K的吸收，對病毒、細菌均有抑制作用，對植物產生殺菌、抗菌、抗病、抗旱、抗寒、抗鹽堿等作用[1-4]．

AMF菌的主要作用是可改善植物的礦質營養(yǎng)，尤其是磷素營養(yǎng)；可提高植物在極端環(huán)境中的抗逆性；有助于植物抵御病原菌的侵害；能改善土壤團粒結構；促進作物的高產穩(wěn)產、優(yōu)質、高效．AMF菌在農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及生態(tài)保護等方面具有重要意義[5-6]．AMF菌可以侵染植物根部與根部共生，進而發(fā)揮其主要作用．AMF優(yōu)良菌株的分離篩選是AMF應用技術中的基礎環(huán)節(jié)，一個優(yōu)良的菌種需要有遺傳方面的穩(wěn)定性，能有效侵染目標植物，改善植物的營養(yǎng)狀況或品質；在與土著菌和病原菌等其它微生物的生存競爭中占優(yōu)勢，而且要具備適應或抵抗不利和極端環(huán)境的能力[7-9]．

花生營養(yǎng)價值豐富，富含油脂、各種維生素、亞油酸等，伴隨我國花生制品加工企業(yè)的快速發(fā)展，花生原料已經不能滿足現(xiàn)有市場需求[10]．要解決當務之急，就要從本質上擴大生產規(guī)模，提高花生產量和營養(yǎng)物質的含量．其中最重要的是提高花生營養(yǎng)物質含量，解決這一問題的重要手段就是提高肥料功能和質量[11-14]．

由于花生的各種營養(yǎng)成分含量對花生加工企業(yè)的效益指標影響甚大，因此，以花生作為原材料加工企業(yè)在收購花生時一直都把營養(yǎng)物質含量作為最主要的定價指標，花生營養(yǎng)物質含量低，使加工企業(yè)和花生種植戶的利益都受到了嚴重的沖擊[15]．不僅挫傷了農民種花生的積極性，也造成了加工企業(yè)因缺少原料而導致開工不足[7]109．因此，AMF菌能夠有效提高花生中營養(yǎng)物質含量是解決目前花生種植加工領域困境的主要辦法．本研究從花生根際土樣中分離純化出AMF菌孢子，根據(jù)形態(tài)學特征和分子生物學進行鑒定，獲得AMF菌株，通過Single spore isolating方法完成AMF菌擴大繁殖．

1　材料與方法

1.1　實驗材料

花生根圍土樣15份，花生根系20根（黑龍江省雙城市杏山鎮(zhèn)農田）．

Fungi Genomic DNA Extraction Kit基因組DNA提取試劑盒（Solarbio公司）；Qiagen凝膠回收試劑盒（Qiagen公司）；rTaq DNA聚合酶（寶日醫(yī)生物技術有限公司）；dNTP，無水乙醇（天根生化科技有限公司）；蔗糖，維生素B6，維生素B1（哈爾濱邁科麥科技有限公司）；乙酰丁香酮（上海振品化工有限公司）；羧芐青霉素，磷酸二氫鉀（河北鵬與生物科技有限公司）；硫酸鉀，硫酸鋅，硫酸銅，硫酸錳，硫酸鐵（山東騰飛生物科技有限公司）；肌醇（哈爾濱邁科麥科技有限公司）；煙酸（上海優(yōu)選生物科技有限公司）；甘氨酸（上海優(yōu)選生物科技有限公司）；Tris（北京博奧拓科技有限公司）；Agar（北京蘭杰柯科技有限公司）；氫氧化鈉（滄州劉氏化工有限公司）；冰醋酸（山東旭晨化工科技有限公司）；溴化乙錠（江蘇西格瑪電器有限公司）.以上試劑均為分析純．

1.2　實驗方法

1.2.1土壤采集用鐵鍬除去土壤表層大塊顆粒，在近花生根際附近向下挖15～20 cm，將整株花生根系挖出，放入無菌自封袋中，用干冰保存，帶回實驗室保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2AMF培養(yǎng)取保存土樣30 g，采用濕篩法從中篩選AMF菌孢子，在電子顯微鏡下觀察孢子數(shù)量，采用Single spore isolating方法挑選形態(tài)一致的孢子接種于花生植株根部，培養(yǎng)10～14周，獲得大量純凈AMF菌孢子．

1.2.3AMF菌擴繁選取1～2 mm粒徑碎石和建筑河砂，按體積比1∶1混合，通過高壓蒸汽滅菌2～3h，冷卻，裝入消毒花盆中，取AMF菌孢子撒在花盆中，上面鋪一層碎石河砂，將已經消毒的花生種子播種到花盆中，最后覆蓋一層碎石河砂，將盆栽置于溫室培養(yǎng)，定期澆灌，培養(yǎng)3～4個月，將收集的AMF菌攪拌到黑土和蛭石混合均勻的基質中，種植花生，待花生成熟后，收集盆中土壤樣品，完成AMF菌的大量擴繁．

1.3　AMF菌鑒定

采用徒手切片將花生的根用堿解離-酸性孔雀綠染色法處理，利用光學顯微鏡觀察侵染后的菌絲和孢囊．通過觀察孢子的形狀、大小、顏色等特征，并參照《真菌鑒定手冊》確定AMF菌的種屬[14]830．通過提取AMF菌孢子基因組DNA，進行PCR擴增18SrRNA基因片段，上游引物：5′-GTAGTTACATCGTTGACTC-3′，下游引物：5′-CTTGCGTCTACTCCGTTCAG-3′，得到的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程股份有限公司進行測序，將測序結果進行序列比對．

2　結果與分析

2.1　AMF菌形態(tài)觀察

花生根部橫切結果見圖1．由圖1可見，在花生根系中存在菌絲和孢囊結構，且菌絲體侵染根外層細胞后還引起根系表面明顯隆起．因此，可以確定花生根際附近土壤中存在AMF菌．

圖1　花生根部橫切

2.2　AMF菌分子鑒定

AMF菌基因組DNA見圖2．由圖2可見，基因組DNA條帶清晰．在PCR擴增中，獲得產物約1 300 bp DNA片段，條帶清晰且無其它雜質存在，可以進行測序（見圖3）．由生工生物工程股份有限公司測序得出有效序列長度為890 bp．將測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫中相關序列進行比對，結果顯示，AMF菌株與同源性最高，相似度為98%，并結合菌株AMF的形態(tài)觀察，可初步鑒定菌株AMF為叢枝菌根真菌．

圖2　AMF菌基因組DNA

圖3　PCR擴增結果

2.3　AMF菌對花生根系形態(tài)及干物質積累的影響

使用市售普通化肥（150 kg磷酸二氫鉀 + 75 kg尿素）按當?shù)亓晳T施肥，作為對照1．施加液體肥，稀釋150倍后澆灌至土壤，作為對照2．將制備的AMF菌顆粒與對照2混合，作為實驗組．在不同處理下，花生的根系形態(tài)指標方差分析結果見表1．由表1可見，在花生不同的生長發(fā)育時期中，總根長度、根平均直徑、根表面積、根體積使用不同肥料處理，表現(xiàn)出不同程度的差異，且差異顯著（＜0.05），說明花生根系受不同肥料影響較大．其中實驗組在結莢期和成熟期總根長度、根平均直徑、根表面積、根體積提高較明顯，促進了植株的生長發(fā)育，提高干物質累積量，增加產量．

表1　不同處理花生根部形態(tài)指標方差分析

注：*表示在0.05水平顯著；**表示在0.01水平顯著．

不同處理花生在各生長階段總根長度、根平均直徑、根表面積、根體積、干物質量情況見表2．由表2可見，不同生長發(fā)育期總根長度、根平均直徑、根表面積、根體積因使用不同的肥料而具有一定的差異，從苗期到結莢期不斷增加，總根長度、根表面積在結莢期值最大，到了成熟期有下降；根平均直徑、根體積在成熟期還會繼續(xù)增加，在成熟期達到最大值．從實驗數(shù)據(jù)得到，加入AMF菌的有機液體肥后，根體積增加較大，對花生植株抗倒伏能力的提高和固氮能力的增強具有重要作用．隨著不同生長發(fā)育期干物質積累也在緩慢增加，開花期至結莢期增加顯著，呈上升趨勢，成熟期時達到積累最高峰．

表2　不同處理花生在各生長階段總根長度、根平均直徑、根表面積、根體積、干物質量

注：數(shù)據(jù)為3次重復的平均值，小寫字母表示0.05水平上差異顯著性．

數(shù)據(jù)表明，加入AMF菌的有機液體肥能夠促進根系伸長生長，提高根系對無機鹽離子的吸收，而且還具有抗倒伏作用，提高了花生產量．

2.4　AMF菌對花生根系吸收營養(yǎng)物質的影響

2.4.1AMF菌對花生根系吸收N的影響不同處理花生在各生長階段對N的吸收量見表3．由表3可見，花生從出苗到開花期，對養(yǎng)分N的吸收較少，隨著花生生長發(fā)育的進行，對N的吸收量逐漸增加，在成熟期達到高峰，占總量40%以上．從不同處理間的差異上看，苗期對N吸收總量：實驗組>對照1>對照2，結莢期和成熟期對N吸收總量：實驗組>對照2>對照1．結果表明，加入AMF菌液體肥比當?shù)亓晳T施肥、未加入AMF菌液體肥提高了花生根系對N的吸收量，AMF菌在施加一定量含N液體肥的基礎上促進了花生的生長，但施N量過高也會影響AMF菌的侵染．AMF菌促進花生根系生長，發(fā)達的根系與AMF菌形成共生關系，土壤中的AMF菌絲能夠促進對液體肥中氨基酸的吸收，加速有機N的礦化，AMF的菌絲與花生的根系形成菌絲網(wǎng)絡，有效提高花生根部對N的吸收．

表3　不同處理花生在各生長階段對N，P，K的吸收量

2.4.2AMF菌對花生根系吸收P的影響不同處理花生在各生長階段對P的吸收量見表3．由表3可見，花生從出苗到開花期，對養(yǎng)分P的吸收較少，隨著花生生長發(fā)育的進行，對P的吸收量逐漸增加，在成熟期達到高峰，占總量42%以上．從不同處理間的差異上看，苗期、開花期和成熟期對P吸收總量：實驗組>對照2>對照1．結果表明，加入AMF菌液體肥比當?shù)亓晳T施肥、未加入AMF菌液體肥提高了花生根系對P的吸收量，AMF菌能夠促進花生根對液體肥中P的吸收，提高花生產量．AMF菌在施加一定量含P液體肥的基礎上促進花生的生長，但施P量過高也會影響AMF菌的侵染．

2.4.3AMF菌對花生根系吸收K的影響不同處理花生在各生長階段對K的吸收量見表3．由表3可見，花生在苗期對養(yǎng)分K的吸收量較少，不同處理下對K的吸收量僅占總吸收量的5.93%～6.53%．在進入開花下針期，對K的吸收量迅速增加，整個開花下針期對K吸收量占總量的50.16%～54.94%，為花生吸收K的最高峰時期．在結莢期和成熟期，吸收K的量逐漸減少，不同處理對K的吸收沒有明顯影響．加入AMF菌液體肥，能夠促進花生根對液體肥中K的吸收，增加氣孔導度，提高花生的光合速率，顯著增加花生產量，尤其是花生中油脂的含量．

采用索式提取法測定對照1、對照2、實驗組中花生油脂含量分別為18.35%，18.43%，18.85%．結果表明，加入AMF菌液體肥的油脂含量比當?shù)亓晳T施肥油脂含量提高了2.7%，加入AMF菌液體肥的油脂含量比未加入AMF菌液體肥油脂含量提高了2.3%．因此，加入AMF菌液體肥能夠顯著提高花生中油脂含量，進而提高花生出油率．

3　結語

自發(fā)現(xiàn)AMF菌以來，人們對其分離篩選、形態(tài)、作用機理等領域進行了深入研究，證實叢枝菌根真菌已經與植物形成共生關系[15-16]，這些共生體對植物的生長發(fā)育、維持物質循環(huán)和綠色生態(tài)農業(yè)具有深遠意義．Alistair[17]等于2002年發(fā)現(xiàn)幾種新的菌株，自然界中被人們發(fā)現(xiàn)的AMF菌數(shù)量較少，大多數(shù)AMF菌的分類地位和生理特性尚不明確．

本研究在花生根系中發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌結構，通過對花生根際附近土壤篩選，獲得AMF菌孢子，進行培養(yǎng)和大量擴繁；通過形態(tài)學鑒定發(fā)現(xiàn)AMF菌菌絲和孢子特征與特征相似；通過對18S rRNA基因測序發(fā)現(xiàn)AMF是．此外，有研究發(fā)現(xiàn)可以促進植物對萜類化合物（甾醇、類胡蘿卜素、葉綠素、赤霉素、脫落酸、細胞分裂素）的積累，參與植物呼吸作用、光合作用并調節(jié)植物生長發(fā)育，在植物生命活動中具有重要作用[18]．

AMF菌與液體肥混合施用時，可以與微量元素形成螯合物，增加微量元素向花生根部、葉部和其它部位運轉的數(shù)量．調節(jié)常量元素與微量元素的比例，加強酶對糖分、營養(yǎng)物質、脂肪及各種維生素的合成運轉[9]35．促進酶的活性，使多糖轉化成可溶性單糖，使淀粉、營養(yǎng)物質、脂肪的合成積累增加，加速各種代謝初級產物從花生莖葉向根系輸送，提高花生塊根的產量，從而能夠使花生增產40%～70％的同時，改善花生的品質．AMF菌還能減少無機化肥使用量，保護生態(tài)環(huán)境，可保護土壤水穩(wěn)性團核結構的形成，調節(jié)土壤pH、水、肥、氣、熱狀況，提高土壤的交換容量，增加花生對農藥的抗藥性．AMF菌加入肥料中，比一般肥料利用率高，可以減少化肥用量，降低肥料投入，減少施用化肥對環(huán)境造成的污染，有利于保護生態(tài)環(huán)境．

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Isolation identification and application of inter-rhizosphere mycorrhizal fungi（AMF）from peanut in northern blackland

WANG Xuefei1，CAO Zhe1，YANG Yue1，ZHOU Xintong1，WANG Zijun1，SHAO Wenjie1，ZHOU Zikai1，XU Jialu2，MENG Lingbo1，ZHENG Miaomiao1

（1. School of Food Engineering，Harbin Institute，Harbin 150001，China；2. School of Dentistry，Harbin Medical University，Harbin 150001，China）

Black soil samples were collected from peanut growing areas in Heilongjiang Province，and AMF spores were isolated and purified from peanut inter-root soil samples by wet sieving method．According to morphological characteristics and molecular biology identification，one AMF strain was obtained as．The culture and reproduction of AMF was completed by single pore isolating method，and the spore amount was 350 pieces/g．The pure spores obtained were inoculated into a potted bowl with peanut as the host plant for expanded propagation．AMF can promote the elongation growth of peanut roots and improve the uptake of N，P and K inorganic salt ions by the roots．Moreover，it also has lodging resistance and improves peanut yield，at the same time，increasing the oil content of peanut can increase the oil content of peanut by 2.3%～2.7%．

AMF fungus；northeast four-grain red phlox；oil

1007-9831（2022）08-0071-06

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.08.014

2022-04-18

黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202210234053）；哈爾濱學院青年博士科研啟動基金項目（HUDF2019103）；黑龍江省博士后資助經費項目（LBH-Z18028）

王雪霏（2002-）女，黑龍江大慶人，在讀本科生．E-mail：2479435077@qq.com

鄭苗苗（1982-），女，黑龍江哈爾濱人，教授，博土，從事應用微生物研究．E-mail：miaomiao_0000@126.com