波爾山羊腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

唐云云，韓 瑞，張文波?， 楊 行，陳佳玲

（1.黔西南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院 562400；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 330045）

大腸桿菌是一類廣泛存在于自然界，也是人和動物腸道的常在菌群之一。大腸桿菌根據(jù)基因組學(xué)分析及臨床癥狀可分為3類：共生性大腸桿菌、腸道致病性大腸桿菌和腸外致病性大腸桿菌[1]。共生型大腸桿菌是腸道內(nèi)的正常菌群，也是腸內(nèi)有益菌之一；EPEC在健康動物體內(nèi)檢測不到，也不會引起腸外感染,但是動物的飼料和水被其污染后，會引起食用的動物發(fā)生嚴(yán)重腹瀉和胃腸炎等腸道疾病[2]；ExPEC是一類能引起人和動物腸外組織感染，能引起人或動物的泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和呼吸道感染，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟損失，同時也會危害人類健康，已引起廣泛關(guān)注。近年來，從雞[3-5]、豬[6,7]、羊[8]和狗[9]等家畜、家禽中的分離報道越來越多，該菌的致病性、致病機理、耐藥性等已成為目前大腸桿菌研究的熱點之一。

2017年2月初，南昌某養(yǎng)羊場從外地購進400只波爾山羊，3月初開始發(fā)病，出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽等癥狀，死亡率約為10%左右，懷疑為羊傳染性胸膜肺炎，使用土霉素、氟苯尼考等藥物治療，病情有所好轉(zhuǎn)。4月初，這批羊又開始發(fā)病，病羊后軀麻痹、運步失調(diào), 頭常彎向一側(cè)，無明顯腹瀉，后期臥地不起，繼而死亡。病死羊尸體極度消瘦、可視黏膜蒼白。解剖可見胸部皮下出血，腹腔積液，腸道有出血點，肝臟腫大、有大量針尖大小的出血點，脾臟呈紫黑色，腎臟呈土黃色，腎盂出血，肺臟出血、心臟出血。用多種抗生素治療無效。根據(jù)臨床癥狀、病理變化和治療情況，初步懷疑為大腸桿菌病。經(jīng)實驗室的細菌分離、生化和分子生物學(xué)鑒定，確診為腸外致病性大腸桿菌感染，并根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選用高敏藥物進行治療，控制了病情。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2頭病死羊的內(nèi)臟組織。

1.1.2 實驗動物及主要試劑 15±1g 昆明小鼠，購自南昌大學(xué)實驗動物中心；微量生化鑒定管及藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離純化 無菌采集病死羔羊的心、肝、脾和肺，分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板和TSA平板（含5%小牛血清），37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，挑單個菌落進行革蘭氏染色；并挑單個菌落接種于伊紅美蘭平板，37℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。

1.2.2 生化鑒定 按文獻所述方法[10]操作。

1.2.3 菌落PCR鑒定

1.2.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中公布的ExPEC的毒力基因iutA的核苷酸序列設(shè)計引物，引物為A1：5′－cag tat cag gaa tca ggt agt cca－3′，A2：5′－ctt tac ctc caa cca gat gtt ctt－3′，擴增片段大小為674 bp，引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3.2 菌落PCR 從純培養(yǎng)平板上挑單個菌落于50μL ddH2O中，99℃ 5min，然后12000r/min離心1 min，取上清作為PCR模板。反應(yīng)體系：10×PCR MIX 25 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板 5μL，加ddH2O至總體積50μL；94℃5min，94℃ 45sec，54℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)，最后72℃ 延伸8min，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.4 序列測定與比對分析 取PCR產(chǎn)物，送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進行序列測定。所測序列用在線BLAST進行比對。

1.2.5 小鼠致病性試驗 挑單個菌落于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 220rpm/min振蕩培養(yǎng)10h，稀釋到濃度為105CFU/mL，小鼠按0.2mL/只進行腹腔注射，同時用普通肉湯注射小鼠作正常對照，觀察小鼠的發(fā)病及死亡情況，并從死亡小鼠的肝臟和心臟中分離細菌。

1.2.6 藥敏試驗 從7株分離菌中挑4株分離菌進行藥敏試驗，操作方法及判定標(biāo)準(zhǔn)均參照文獻[11]進行。

1.2.7 臨床治療 使用藥敏試驗篩選的高度敏感藥物進行治療，并采取消毒等綜合防控措施，觀察治療效果。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

2頭羊的內(nèi)臟器官中共分離到7株細菌（心臟2株、肺臟2株、肝臟2株、脾臟1株）,分別命名為X1、X2，F(xiàn)1、F2，G1、G2，P1。各分離菌在固體培養(yǎng)基上生物特性基本一致。在TSA平板上形成圓形、邊緣整齊、灰白色、光滑而不透明的菌落；普通培養(yǎng)基上形成中等大小、濕潤、灰白色半透明、邊緣整齊的菌落；麥康凱培養(yǎng)基上形成紅色、圓形隆起、濕潤和邊緣整齊的菌落。革蘭染色均為陰性，散在或成對排列、兩端鈍圓的短桿菌。在伊紅美蘭平板上，可形成紫黑色帶金屬光澤的菌落。

2.2 生化試驗結(jié)果

7株分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖和阿拉伯糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；ONPG、尿素、淀粉、鳥氨酸脫羧酶、MR和硝酸鹽還原陽性；不發(fā)酵赤蘚糖、蔗糖、乳糖；賴氨酸脫羧酶、吲哚、H2S和枸櫞酸鹽為陰性；可液化明膠；符合致病性大腸桿菌的生化特征。結(jié)合分離菌的生物學(xué)特性，確定分離菌均為大腸桿菌。

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果

2.3 菌落PCR及PCR產(chǎn)物序列測定、BLAST結(jié)果

通過菌落PCR，從分離菌中均擴增到大小約為670bp的基因片段（圖1），與預(yù)期大小一致。序列測定結(jié)果，7株分離菌的PCR產(chǎn)物核苷酸序列長均為674bp，將所測序列與GenBank中的ExPEC iutA核苷酸序列進行比對分析，結(jié)果分離菌的序列與GenBank中登錄的ExPEC相應(yīng)序列的相似性在99～100%之間（圖略）。說明7株分離菌均為ExPEC。

圖1 分離菌的菌落PCR結(jié)果

2.4 致病性試驗結(jié)果

分離菌均在12h內(nèi)致小鼠死亡，小鼠的心臟和腸道出血嚴(yán)重、肝上有針尖大小出血點，肺有出血點。從死亡小鼠的心臟、肝臟以及腹水中均可分離到革蘭氏陰性的短桿菌。普通肉湯對照組則全部存活。說明分離菌的致病性較強。

表2 動物試驗結(jié)果

2.5 藥物敏感試驗結(jié)果

4株分離的ExPEC均呈多重耐藥，對阿米卡星、壯觀霉素和痢菌凈較敏感，左氧氟沙星和多粘菌素為中度敏感，對其他10種藥物為低敏或耐藥（見表3）。

表3 分離菌的藥敏試驗結(jié)果(抑菌圈直徑：mm)

2.6 臨床治療

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選用阿米卡星對發(fā)病羊進行肌肉注射治療，鹽酸壯觀霉素、多維全群拌料，3d后癥狀明顯減輕，連續(xù)用藥7d，基本恢復(fù)正常，治療后15d和30d回訪均正常。

3 討論

近年來，隨著抗生素的濫用，大腸桿菌的耐藥性也不斷增強，給防控該病帶來了非常大的麻煩。羊大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起羔羊及幼齡羊的一種嚴(yán)重腹瀉和敗血癥的急性傳染病，具有發(fā)病急、死亡快的特點，是危害我國養(yǎng)羊業(yè)的重要傳染病之一。近年隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和病原的變異，羊大腸桿菌的防控難題日益突出，分離致病菌，篩選敏感藥物，對防控該病有著重要的實際意義。

ExPEC是一種重要的人獸共患病病原，可通過其特有的毒力因子侵襲、定植于腸外組織，并誘發(fā)腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎和手術(shù)后感染等。國外學(xué)者已從人、牛、雞、狗、貓體內(nèi)分離到ExPEC，對該類致病菌的種系發(fā)育群、毒力基因型、耐藥性、致病性等進行了比較分析，結(jié)果顯示，ExPEC對人類和動物造成的病理變化差異不大、宿主特異性不強。Moulin- Schouleur M通過血清分型、多位點序列分型技術(shù)，對人ExPEC和家禽APEC進行比較，結(jié)果顯示人ExPEC可能來源于APEC[12]；唐志軍等用血清分型和脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術(shù)，對227株臨床分離的ExPEC進行分析研究，結(jié)果腸內(nèi)致病大腸桿菌血清型能引起臨床腸外感染，且主要為ETEC和EPEC血清型，敗血癥患者的ExPEC可能來源于腸道致病大腸桿菌的移位[13]。因此，分離、鑒定羊ExPEC，分析其來源、致病性和防控新方法，對公共衛(wèi)生具有重要的意義。

對羊EPEC的研究報道較少。Cortés C等從西班牙某養(yǎng)羊場的病死山羊中分離到腸外致病性大腸桿菌，并對其血清型和毒力因子進行了詳細的研究[14]。目前國外的研究主要集中在羊腸外致病性大腸桿菌的血清型及其與人類ExPEC的關(guān)系。國內(nèi)劉正明等對羊源性大腸桿菌藥物敏感研究表明，分離株耐7種以上藥物的比率達到94.4%[15]；曾博等研究發(fā)現(xiàn)，西南地區(qū)豬源ExPEC對頭孢噻吩和頭孢氨芐有很高的耐藥水平[16]；郭強強等分離10株ExPEC進行2藥敏試驗和毒力因子基因檢測，結(jié)果呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，表明多種毒力因子綜合作用可能是ExPEC高致病性的主要原因[17]。

本研究從病死羊的內(nèi)臟器官中分離到7株細菌，經(jīng)生物學(xué)特性、生化鑒定，確定為大腸桿菌；小白鼠致病性試驗結(jié)果，小鼠在接種后12h內(nèi)全部死亡，且出現(xiàn)明顯的敗血癥，表明分離菌具有強致病性；通過PCR方法檢測到ExPEC特有的毒力基因iutA，表明本次分離菌為腸外致病性大腸桿菌。臨床使用經(jīng)藥敏篩選的藥物，治療效果較好。

大腸桿菌作為腸道正常菌群的共生菌，在治療或預(yù)防而使用抗菌藥物的選擇性壓力作用下，其耐藥性不斷增強、耐藥譜也日趨擴大[18]；因飼料等原因使腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，促進了耐藥基因的傳遞。共生型大腸桿菌作為一個可能的耐藥基因儲存庫，在耐藥基因的傳播擴散中發(fā)揮了重要作用。國內(nèi)外的研究表明，ExPEC的耐藥性要強于腸內(nèi)和共生型大腸桿菌[19-21]。本次實驗結(jié)果也表明，羊ExPEC的耐藥性出較強，因羊ExPEC的報道較少，且本次只分離到7株ExPEC，代表性有限。下一步將對羊ExPEC的來源、羊群中的流行現(xiàn)狀和分子特性、羊肉食品中的流行及存在現(xiàn)狀、耐藥譜、毒力和公共衛(wèi)生學(xué)意義等進行研究，以期為我國羊ExPEC的防控提供依據(jù)。

4 結(jié)論

從病死羊的內(nèi)臟組織中分離到7株細菌，通過對分離菌的培養(yǎng)特性、生理生化、PCR和序列測定分析、動物試驗等，確定分離的細菌為腸外致病性大腸桿菌；藥敏試驗結(jié)果，分離菌對常用的抗生素耐藥性較強，僅對3種抗生素中度敏感；使用篩選的藥物進行治療，有效控制了疫情。