淫羊藿苷聯(lián)合富血小板血漿對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨保護(hù)作用和分子機(jī)制研究Δ

劉 杰，史 超，劉 楊，趙 妍

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830000)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是全球中老年人群中的常見疾病[1]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，注射非甾體抗炎藥(NSAID)可緩解OA患者的疼痛癥狀，但對(duì)緩解關(guān)節(jié)軟骨變性的助益甚微[2]。近年來，注射富血小板血漿(PRP)是治療OA的新方法，能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)合成[3]。而且研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRP聯(lián)合藥物方案治療OA的改善效果更有效。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷(ICA)與PRP聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)兔肌腱愈合[4-5]。ICA是淫羊藿主要的天然黃酮類成分，有調(diào)節(jié)骨組織、骨細(xì)胞代謝的作用。近年來，關(guān)于ICA在骨與軟組織中應(yīng)用的機(jī)制研究越來越廣泛。ICA通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善股骨頭壞死，增強(qiáng)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞活力，促進(jìn)成骨分化[6]。且ICA具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用[7]。Deng等[8]的研究結(jié)果表明，ICA可以抑制炎癥因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)介導(dǎo)的纖維軟骨細(xì)胞凋亡。但是ICA聯(lián)合PRP對(duì)OA的作用和機(jī)制目前仍未知。本研究建立了OA細(xì)胞模型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，旨在確定ICA聯(lián)合PRP、單用ICA與單用PRP在體內(nèi)外治療OA是否具有相似的生物學(xué)作用，并進(jìn)一步驗(yàn)證ICA聯(lián)合PRP是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善OA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只雄性新西蘭白兔由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由我院倫理委員批準(zhǔn)通過(批準(zhǔn)號(hào)為IACUC20210101-12)。

1.1.2 儀器：TP 1210型脫水機(jī)、EG 1250 H型石蠟包埋機(jī)、RM 2019型石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；CX40型正置顯微鏡[舜宇光學(xué)科技(集團(tuán))有限公司]；Image J 2.0型灰度分析軟件(美國國家衛(wèi)生研究所)；170-3930型Western blot電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；KODAK Gel Logic 2200數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)(美國DL Naturegene Life Sciences公司)；LSETM通用離心機(jī)(美國Corning公司)；BPH-9082細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海恒一精密儀器有限公司)。Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Bio-Rad 680型分光光度酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；BD Accuri? C6 Plus型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；FV3000激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.1.3 藥品與試劑：胰蛋白酶、胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、低血清培養(yǎng)液和DMEM/F12培養(yǎng)基購于美國Gibco公司(貨號(hào)分別為15090046、10100147、15140122、31985062和A4192001)。anti-Col-Ⅱ、anti-ADAMTS-5購于英國Abcam公司(貨號(hào)分別為ab185430、ab182795)。山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G(H+L)第二抗體AlexaFluor488、山羊抗兔IgG(H+L)第二抗體購于美國Invitrogen公司(貨號(hào)分別為A16098、PA1-28555)。DAPI染液和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)購于上海Beyotime公司(貨號(hào)分別為C1002、C0038)。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)室購于美國Corning公司(貨號(hào)為CLS3396)。IL-1β、ICA(分子式為C33H40O15)購于美國Sigma公司(貨號(hào)分別為IL038、I1286)。BCA蛋白測(cè)定試劑盒、RIPA裂解緩沖液購于美國Pierce公司(貨號(hào)分別為23225、89900)。牛血清白蛋白購于生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號(hào)為AD0069)。anti-Wnt1、GSK-3β、β-catenin、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)及辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的第二抗體購于美國Cell Signaling Technology公司(貨號(hào)分別為XY-1739R、9832、37447、51332和7076)。ECL成像試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司(貨號(hào)為A38556)。

1.2 方法

1.2.1 兔PRP的制備：新西蘭大白兔全血經(jīng)耳廓中央動(dòng)脈穿刺取血，以9∶ 1(V血液/V檸檬酸葡萄糖溶液A抗凝劑)的比例加入檸檬酸葡萄糖溶液A抗凝劑中。將樣品輕輕攪拌至混合。將10 mL的混合物在15 mL離心管中以1 500 r/min (離心半徑為10 cm)離心10 min。然后，血液從上到下被分成血漿、血小板、白細(xì)胞(“緩沖層”)和紅細(xì)胞。頂部兩層包含血小板，被轉(zhuǎn)移到新的離心管二次離心，3 000 r/min (離心半徑為10 cm)離心10 min。棄掉上層血清和下層的紅細(xì)胞沉淀，，中間層即為血小板，重懸獲得PRP 1 mL[9]。

1.2.2 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：軟骨來自新西蘭大白兔終端脛骨和股骨，無菌條件下切成碎塊，用PBS洗3次，添加0.25%胰蛋白酶消化1～2 h，然后用0.2%Ⅱ型膠原(COL-Ⅱ)酶消化，37 ℃孵化器，5%二氧化碳。過夜消化后，整個(gè)混合物用200目濾網(wǎng)過濾，濾液在1 300 r/min(離心半徑為10 cm)離心5 min，棄去上清液。將殘留物重懸于剩余培養(yǎng)基中，置于含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。P1(細(xì)胞傳代1次)軟骨細(xì)胞用于細(xì)胞鑒定，P2(細(xì)胞傳代2次)軟骨細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 軟骨細(xì)胞的阿利新藍(lán)染色及免疫細(xì)胞化學(xué)研究：(1)將P1軟骨細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后轉(zhuǎn)移至玻片上。4%多聚甲醛固定30 min后，軟骨細(xì)胞在阿爾新酸化液浸泡3 min，孵育阿爾新藍(lán)染色液30 min，PBS沖洗2次后再與阿爾新藍(lán)染色液孵育5 min，額外PBS清洗1 min。然后，切片在不同梯度的無水乙醇中脫水，二甲苯中沖洗10 min，顯微鏡下觀察。(2)收集P2軟骨細(xì)胞，在4%(W/V)的多聚甲醛緩沖溶液中固定15 min，然后用0.2%(W/V)TritonX-100滲透10 min。用小鼠anti-ColⅡ(1∶ 100)和兔anti-ADAMTS-5(1∶ 100)一抗添加至固定后的軟骨細(xì)胞中，并在4 ℃下孵育過夜。然后用PBS清洗細(xì)胞3次。相應(yīng)的山羊抗小鼠IgG(H+L)交叉吸附二抗AlexaFluor488(1∶ 250)和山羊抗兔IgG(H+L)交叉吸附二抗AlexaFluor555(1∶ 250)加至上述細(xì)胞中孵育2 h。隨后用DAPI(1∶ 500)染色15 min，并用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：在體外實(shí)驗(yàn)中，以IL-1β(10 ng/mL)作為對(duì)照。采用ICA、PRP和ICA+PRP分別聯(lián)合IL-1β(10 ng/mL)刺激軟骨細(xì)胞24 h，作為ICA組、PRP組和ICA+PRP組。將細(xì)胞上清液保存在-80 ℃中，用于分析。腫瘤壞死因子α(TNF-α)由eBioscience公司的ELISA試劑盒根據(jù)制造商的協(xié)議進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 軟骨細(xì)胞的增殖：使用CCK-8觀察軟骨細(xì)胞增殖情況。第二代軟骨細(xì)胞的初始密度為3 000個(gè)/100 μL。以IL-1β(10 ng/mL)作為對(duì)照，ICA組、PRP組和ICA+PRP組分別聯(lián)合IL-1β(10 ng/mL)刺激軟骨細(xì)胞24 h。在各孔中加入CCK-8溶液10 μL和新鮮培養(yǎng)基100 μL，避免氣泡，37 ℃孵育4 h。最后，用分光光度酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定OD值。軟骨細(xì)胞的增殖活性用檢測(cè)孔的OD減去空白孔的OD表示。

1.2.6 軟骨細(xì)胞的凋亡：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞體外凋亡。處理方法如前所述，1 300 r/min(離心半徑為15 cm)離心5 min后收集軟骨細(xì)胞，在4 ℃用PBS洗2次。然后在1 300 r/min(離心半徑為15 cm)離心5 min，重懸后，將1×106個(gè)/mL的軟骨細(xì)胞100 μL與AnnexinV/PE 5 μL和7-AAD 10 μL混勻。4 ℃暗處理15 min后，加入1×Binding Buffer 400 μL中，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 動(dòng)物模型和分組：取雄性新西蘭白兔24只(4周齡，2～3 kg)，建立OA模型，隨機(jī)分為模型組、ICA+PRP組、ICA組和PRP組。新西蘭白兔采用10%水合氯醛麻醉(4 mL/kg)，切斷手術(shù)側(cè)的(左)膝蓋內(nèi)側(cè)副韌帶和前交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板[10]。術(shù)后采用8 000 000 U/kg的青霉素鉀肌內(nèi)注射7 d(1日1次)預(yù)防感染。所有兔都在手術(shù)結(jié)束后根據(jù)不同分組于關(guān)節(jié)內(nèi)注射不同藥物治療，隨后在(21±0.5)℃的條件下單獨(dú)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)6周。6周后注射過量空氣處死所有新西蘭大白兔，采集左膝軟骨標(biāo)本，評(píng)估軟骨退行性變并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。模型組于關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液，1周1次；ICA+PRP組關(guān)節(jié)內(nèi)注射ICA+PRP，1周1次；ICA組關(guān)節(jié)內(nèi)注射ICA，1周1次；PRP組關(guān)節(jié)內(nèi)注射PRP，1周1次。另取6只正常新西蘭白兔作為正常組。

1.2.8 組織染色、免疫組化和國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)(OARSI)評(píng)分：標(biāo)本采集后，將兔關(guān)節(jié)用4%緩沖多聚甲醛固定24 h，用10%(W/V)EDTA(pH7.4)在4 ℃條件下脫鈣3 d，石蠟包埋。采用5 μm厚度的矢狀關(guān)節(jié)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。免疫組化檢測(cè)COL-Ⅱ和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá)。采用國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)(OARSI)評(píng)分系統(tǒng)[11]對(duì)HE染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，0分為關(guān)節(jié)軟骨正常，無結(jié)構(gòu)變化；15分及以上為軟骨處有垂直皸裂/侵蝕，延伸至>75%的關(guān)節(jié)面；評(píng)分越高關(guān)節(jié)軟骨破壞越嚴(yán)重。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)：取股骨內(nèi)髁軟骨，以PBS溶液進(jìn)行沖洗3次，用眼科微型剪將軟骨剪成碎末狀，隨后使用Trizol法分離提取總RNA。并反轉(zhuǎn)為cDNA，將得到的cDNA進(jìn)行Wnt1、GSK-3β及β-catenin擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為，預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s；退火Wnt1 51.5 ℃、GSK-3β 35 ℃、β-catenin 57 ℃，30 s；延伸72 ℃，45 s；終末延伸72 ℃，10 min，4 ℃保存。最后，通過SYBR Green PCR試劑盒在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行RT-PCR。引物如下，Wnt1-正向引物 5′-CTGCGCCAACACAGA AATTATTGTA-3′；Wnt1-反向引物 5′-TTCACTGGCATCTTCA CTGATTCTT-3′；GSK-3β-正向引物 5′-GCGTGAGGAGGGATA AGG-3′；GSK-3β-反向引物 5′-CAGTTGGTGGAAATAATAA AGG-3′；β-catenin-正向引物 5′-GGAAATCGTG CGTGACATTA-3′；β-catenin-反向引物 5′-GGAGCAATGATC TTGATCTTC-3′。mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，以GAPDH為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增后，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)分析結(jié)果，計(jì)算公式為ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，記為ΔCt對(duì)照，用各組的ΔCt分別減去平均ΔCt對(duì)照，求得ΔΔCt值，再計(jì)算各組2-ΔΔCT值，即為各組中基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.10 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)軟骨組織Wnt/β-catenin的表達(dá)：以RIPA裂解緩沖液提取模型組、PRP組、ICA組和ICA+PRP組的軟骨組織蛋白，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。將提取的30 μg蛋白在沸水中變性5 min，經(jīng)10%(W/V)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫(25 ℃)下用5%(W/V)牛血清白蛋白封閉1 h。隨后用Wnt1(1∶ 1 000)、GSK-3β(1∶ 800)、β-catenin(1∶ 1 000)一抗在4 ℃條件下孵育過夜。在含有Tween-20的Tris緩沖鹽水(TBST)中洗滌3次后，用相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗體(1∶ 3 000)在室溫下處理1 h。以TBST洗掉多余的二抗體，采用ECL成像試劑盒激發(fā)化學(xué)發(fā)光信號(hào)。GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兔軟骨細(xì)胞的分離與鑒定

P2兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h后呈三角形、多邊形和梭形，細(xì)胞逐漸整合。軟骨細(xì)胞中蛋白多糖的沉積，呈藍(lán)色。免疫組化染色Col-Ⅱ蛋白，確認(rèn)提取的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。染色顯示了軟骨細(xì)胞的形態(tài)特征，見圖1。

A.軟骨細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡×40，標(biāo)尺=100 μm)；B.軟骨細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡×200，標(biāo)尺=100 μm)；C.軟骨細(xì)胞鑒定(阿爾新藍(lán)染色)；D.Col-Ⅱ細(xì)胞(免疫組化染色，標(biāo)尺=50 μm)A. chondrocyte morphology (inverted microscope ×40, he bar =100 μm); B. chondrocyte morphology (inverted microscope ×200, he bar =100 μm); C. chondrocyte identification (Alcian blue staining); D. Col-Ⅱ cells (cellular immunohistochemical staining, bar=50 μm)

2.2 ICA聯(lián)合PRP抑制TNF-α的釋放

與IL-1β組比較，ICA組、PRP組和ICA+PRP組TNF-α水平均顯著降低，且ICA+PRP組TNF-α水平最低，其次為ICA組和PRP組；ICA組、PRP組TNF-α水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ICA+PRP組對(duì)TNF-α釋放的抑制效果優(yōu)于ICA組及PRP組，見圖2。

與IL-1β組比較，*P<0.05；與PRP組比較，#P<0.05；與ICA組比較，&P<0.05vs. IL-1β group, *P<0.05; vs. PRP group, #P<0.05; vs. ICA group, &P<0.05

2.3 ICA聯(lián)合PRP促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖活性

與IL-1β組比較，ICA組、PRP組和ICA+PRP組處理24 h的軟骨細(xì)胞增殖活性均顯著增加，且ICA+PRP組的細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，其次為ICA組，隨后為PRP組；ICA+PRP組軟骨細(xì)胞增殖活性優(yōu)于ICA組、PRP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

與IL-1β組比較，*P<0.05；與PRP組比較，#P<0.05；與ICA組比較，&P<0.05vs. IL-1β group, *P<0.05; vs. PRP group, #P<0.05; vs. ICA group, &P<0.05

2.4 ICA聯(lián)合PRP抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡

ICA+PRP組、ICA組和PRP組的處理均可抑制IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡作用；此外，與ICA組、PRP組比較，經(jīng)ICA+PRP組處理的軟骨細(xì)胞凋亡率更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

與IL-1β組比較，*P<0.05；與PRP組比較，#P<0.05；與ICA組比較，&P<0.05vs. IL-1β group, *P<0.05; vs. PRP group, #P<0.05; vs. ICA group, &P<0.05

2.5 體內(nèi)ICA聯(lián)合PRP治療OA的效果

本實(shí)驗(yàn)中，兔沒有發(fā)生明顯的不良事件。正常組兔的關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，結(jié)構(gòu)完整，無缺損，軟骨細(xì)胞排列有序，邊界明確，潮線清晰。模型組兔的關(guān)節(jié)軟骨表面局灶性增生，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，邊界模糊。PRP組兔的關(guān)節(jié)軟骨表面局灶性增生依然存在，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，邊界模糊。ICA組兔的關(guān)節(jié)軟骨表面增生輕微減少，但軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，邊界模糊程度減少。ICA+PRP組兔的關(guān)節(jié)軟骨表面增生減少，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則和邊界模糊程度都減少。

OASRI評(píng)分結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、PRP組、ICA組和ICA+PRP組評(píng)分均顯著升高；與模型組比較，PRP組、ICA組和ICA+PRP組評(píng)分顯著降低；與ICA組、PRP組比較，ICA+PRP組評(píng)分均顯著降低；與PRP組比較，ICA組評(píng)分顯著降低，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

另外，ICA+PRP組、ICA組和PRP組逆轉(zhuǎn)了骨關(guān)節(jié)炎引起的COL-Ⅱ表達(dá)降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ICA+PRP組的COL-Ⅱ表達(dá)高于ICA組、PRP組，ICA組高于PRP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

A.股骨髁片的HE染色和COL-Ⅱ表達(dá)的免疫組化染色(×200，比例尺=100 μm，n=6)；B.OARSI評(píng)分；C.COL-Ⅱ表達(dá)量(用平均OD值表示)；與正常組比較，*P<0.05；與Model組比較，#P<0.05；與PRP組比較，&P<0.05；與ICA組比較，$P<0.05A. HE staining of femoral condyles and immunohistochemical staining of COL-Ⅱ expression (×200, bar=100 μm, n=6); B.OARSI score; C. expression of COL-Ⅱ (mean OD value); vs. normal group, *P<0.05; vs. model group, #P<0.05; vs. ICA group, &P<0.05; vs. PRP group, $P<0.05

2.6 ICA和PRP對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路基因的mRNA水平的影響

與模型組比較，ICA組Wnt、β-catenin的mRNA表達(dá)顯著降低，GSK-3β的mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，PRP組β-catenin的mRNA表達(dá)顯著降低，GSK-3β的mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而PRP組中Wnt的mRNA表達(dá)與模型組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ICA組比較，ICA+PRP組Wnt、β-catenin的mRNA表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GSK-3β的mRNA表達(dá)組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與PRP組比較，ICA+PRP組Wnt、β-catenin的mRNA表達(dá)顯著降低，GSK-3β的mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，ICA+PRP組Wnt、β-catenin的mRNA表達(dá)顯著降低，GSK-3β的mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與ICA 組比，&P<0.05；與PRP 組比，$P<0.05vs. normal group, *P<0.05; vs. model group, #P<0.05; vs. ICA group, &P<0.05; vs. PRP group, $P<0.05

2.7 ICA和PRP對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路基因的蛋白表達(dá)水平的影響

與模型組比較，ICA組和PRP組Wnt、β-catenin的蛋白表達(dá)顯著降低，GSK-3β的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ICA組比較，ICA+PRP組Wnt、β-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GSK-3β的蛋白表達(dá)水平組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與PRP組比較，ICA+PRP組Wnt、β-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著降低，GSK-3β的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，ICA+PRP組Wnt、β-catenin的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，GSK-3β的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與ICA組比較，&P<0.05；與PRP組比較，$P<0.05vs. normal group, *P<0.05; vs. model group, #P<0.05; vs. ICA group, &P<0.05; vs. PRP group, $P<0.05

3 討論

本研究觀察了ICA聯(lián)合PRP對(duì)OA兔模型軟骨損傷的修復(fù)作用，結(jié)果表明，ICA聯(lián)合PRP是極具潛力的OA治療藥物和軟骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)阻斷劑，ICA與PRP聯(lián)合干預(yù)的效果優(yōu)于兩種藥物單獨(dú)干預(yù)。

PRP能夠調(diào)整Wnt/β-catenin通路信號(hào)強(qiáng)度，抑制IL-1β和TNF-α等的過度募集，切斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等惡性循環(huán)，炎癥急性期之后可有效阻斷炎癥細(xì)胞-炎癥介質(zhì)之間的效應(yīng)放大環(huán)。PRP還可調(diào)控膠原纖維的合成，抑制膠原裂解酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶)的分泌，因此將PRP用于改善骨關(guān)節(jié)炎癥和軟骨降解的前景較為理想。目前，PRP聯(lián)合藥物的OA治療方案也有了更多實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[12]。本研究將ICA與PRP聯(lián)合干預(yù)兔的OA，發(fā)現(xiàn)ICA與PRP聯(lián)合治療或者ICA和PRP分別單獨(dú)治療均逆轉(zhuǎn)了模型中的有害變化，修復(fù)了兔的軟骨損傷，減少了軟骨細(xì)胞的凋亡，而聯(lián)合治療的優(yōu)勢(shì)明顯大于ICA或PRP單獨(dú)治療。本研究結(jié)果證明，PRP聯(lián)合藥物治療可能是一種更有價(jià)值的OA治療策略。

本研究將軟骨細(xì)胞暴露于IL-1β在體外模擬OA模型。軟骨細(xì)胞受到IL-1β的作用，增殖能力下降，凋亡增加，且IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞TNF-α表達(dá)顯著升高。炎癥與骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的進(jìn)展有關(guān)，不同的介質(zhì)協(xié)同放大和延續(xù)這一過程。本研究結(jié)果表明，ICA聯(lián)合PRP的抗炎作用與PRP類似，可以下調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α的水平，且效果更優(yōu)。

本研究結(jié)果表明，ICA組、PRP組和ICA+PRP組可以減輕OA的炎癥反應(yīng)、軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨損傷。而OA中炎癥反應(yīng)、軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨損傷的分子機(jī)制尚不完全清楚[13]。研究結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過控制軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡在抗炎作用中發(fā)揮重要作用[14]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)軟骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用依賴于下游關(guān)鍵絲氨酸激酶蛋白GSK-3β的表達(dá)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組軟骨組織中β-catenin和Wnt1的表達(dá)水平升高，但GSK-3β和COL-Ⅱ的表達(dá)水平降低，表明OA中Wnt/β-catenin對(duì)軟骨細(xì)胞的分化作用被阻斷，抑制了膠原合成，而ICA+PRP組、ICA組和PRP組逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，ICA+PRP組對(duì)GSK-3β和COL-Ⅱ的逆轉(zhuǎn)作用優(yōu)于ICA組和PRP組，而ICA+PRP組對(duì)Wnt1和β-catenin的抑制作用也明顯強(qiáng)于ICA組和PRP組。一些研究得出了類似的結(jié)論，如Ⅰ期臨床試驗(yàn)觀察到特異性抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以有效治療重度OA[16]。本研究中，ICA聯(lián)合PRP是抑制Wnt/β-catenin通路的有效藥物，可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善OA。

綜上所述，ICA聯(lián)合PRP可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、抑制炎癥損傷和細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗OA的作用，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切參與此過程。本研究結(jié)果為ICA和PRP在OA臨床治療中的聯(lián)合應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為ICA聯(lián)合PRP關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射技術(shù)的應(yīng)用提供了指導(dǎo)依據(jù)。