急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者外周血中髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞的表達(dá)水平研究

樂(lè)揚(yáng) 蘇浩

238000 合肥市第八人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(樂(lè)揚(yáng))；230001 合肥，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)心血管內(nèi)科(蘇浩)

急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是一種多因素導(dǎo)致的心血管疾病，免疫反應(yīng)可能在發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1]。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)，宿主的天然和獲得性免疫參與了ACS的各個(gè)階段[2]。盡管關(guān)于ACS的研究進(jìn)展促進(jìn)了對(duì)其發(fā)病機(jī)制的理解，但其潛在的分子機(jī)制仍未完全闡明。

髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是一群近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)具有免疫抑制作用的細(xì)胞亞群[3]。MDSC通過(guò)抑制宿主的先天和獲得性免疫功能，減弱宿主的免疫反應(yīng)[3]。MDSC根據(jù)免疫表型可以分為單核細(xì)胞型MDSC(M-MDSC)和粒細(xì)胞型MDSC(G-MDSC)。前期研究表明，MDSC在炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病中呈高表達(dá)狀態(tài)，并與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[4]。在炎癥等病理狀態(tài)下，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)等多種炎癥細(xì)胞因子可誘導(dǎo)MDSC在機(jī)體微環(huán)境中聚集[5]。MDSC通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用。有研究報(bào)道，MDSC主要通過(guò)分泌精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抑制宿主免疫反應(yīng)[6]。不過(guò)，關(guān)于MDSC在ACS患者中的作用鮮有報(bào)道。本研究旨在探討M-MDSC在ACS中的表達(dá)水平以及在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為前瞻性觀察性研究。選擇2020年1月至2021年1月中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)心血管內(nèi)科的62例初診ACS患者和33例穩(wěn)定性心絞痛(stable angina pectoris，SAP)患者為試驗(yàn)組，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《急性冠脈綜合征急診快速診治指南(2019)》[7]。ACS患者中包括急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)17例、急性非ST段抬高型心肌梗死(non-ST-segment elevation myocardial infarction，NSTEMI)10例和不穩(wěn)定性心絞痛(unstable angina，UA)35例。對(duì)照組(healthy control，HC)40例，為健康體檢中心志愿者。所有受試者均無(wú)腫瘤、傳染性疾病、自身免疫性疾病等。本研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：LL2019073)，所有受試者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 外周血CD14+HLA-DRlow/-MDSC測(cè)定

所有受試者均于清晨空腹抽取靜脈EDTA抗凝血2 ml，取出100 μl加入試管，加入CD14-FTTC、HLA-DR-PE和CD45-PC5單克隆抗體(美國(guó)Beckman Coulter公司)各20 μl，室溫下孵育15 min，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解6 min，離心棄上清，用PBS洗滌2次，加入500 μl染色緩沖液混勻，采用FC500 MPL流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)收集10 000細(xì)胞/管，F(xiàn)lowjo軟件獲取數(shù)據(jù)，以CD14+HLA-DRlow/-作為本研究中M-MDSC的免疫表型。分析M-MDSC細(xì)胞占CD14+細(xì)胞百分比。

1.3 GM-CSF、IL-6水平檢測(cè)

血漿細(xì)胞因子GM-CSF、IL-6水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定，試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 Arg-1 mRNA和iNOS mRNA水平檢測(cè)

使用Trizol法(Invitrogen公司)從上述全血中提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測(cè)。Arg-1引物序列：上游5’-GGCTGGTCTGCTTGAGAAAC-3’，下游5’-ATTGCCAAACTGTGGTCTCC-3’；iNOS引物序列：上游5’-CTTTCCAAGACACACTTCACCA-3’，下游5’-TATCTCCTTTGTTACCGCTTCC-3’；內(nèi)參基因β-actin序列：上游5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游5’-CTAAGTCATAGTCCGCTAGAAGCA-3’。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；隨后95℃ 15 s，60℃ 1 min 循環(huán)45次。讀取每個(gè)定量PCR反應(yīng)的閾循環(huán)(CT)值后，定量PCR結(jié)果計(jì)算公式為2-(CTtarget-CTcontrol)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 初診ACS組、SAP組和HC組的臨床資料

3組受試者的性別、年齡、糖尿病病史、吸煙史及高密度脂蛋白膽固醇水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；而高血壓患病率、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 初診ACS組、SAP組和HC組的臨床資料比較

2.2 初診ACS組、SAP組和HC組的M-MDSC表達(dá)水平

初診ACS組患者外周血中M-MDSC表達(dá)水平高于SAP組和HC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；而SAP組M-MDSC表達(dá)水平又高于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 初診ACS組、SAP組與HC組的M-MDSC水平比較

2.3 不同亞型ACS患者的M-MDSC表達(dá)水平

在ACS患者中，STEMI患者外周血中M-MDSC表達(dá)水平高于NSTEMI和UA患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 不同亞型ACS患者的M-MDSC水平比較

2.4 初診ACS患者外周血中M-MDSC相關(guān)細(xì)胞因子水平

本研究中，GM-CSF、IL-6和Arg-1 mRNA水平在HC組、SAP組和初診ACS組中，呈進(jìn)行性升高趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。而iNOSmRNA的表達(dá)水平在3組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 M-MDSC相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.5 初診ACS患者M(jìn)-MDSC與細(xì)胞因子相關(guān)性

在ACS患者中，M-MDSC水平與GM-CSF、IL-6和Arg-1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(R=0.632、0.582和0.493，均為P<0.01)；而M-MDSC與iNOS mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)明顯相關(guān)性(R=0.32，P>0.05)。

2.6 初診ACS患者治療前后M-MDSC及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

在62例初診ACS患者中，16例行急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)，46例行抗凝等保守治療1個(gè)月，定期至我院門(mén)診隨診，臨床資料保存完整。與治療前相比，ACS患者治療后外周血中M-MDSC、GM-CSF、IL-6和Arg-1 mRNA表達(dá)水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，見(jiàn)表5。

表5 初診ACS患者治療前后M-MDSC及相關(guān)細(xì)胞因子水平變化

3 討論

炎癥過(guò)程在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。ACS的發(fā)生是冠狀動(dòng)脈斑塊侵蝕或破裂的結(jié)果，嚴(yán)重的全身炎癥在其中具有重要作用[8]。MDSC以其髓樣來(lái)源、未成熟狀態(tài)和強(qiáng)大的抑制T細(xì)胞的能力為特征，并因其在炎癥介導(dǎo)的疾病中的作用，在腫瘤及自身免疫性疾病中被廣泛研究[9-10]。然而，關(guān)于MDSC在ACS患者中的作用鮮有報(bào)道。因此，探究MDSC在ACS疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，可能有助于調(diào)控MDSC對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的抑制作用，為ACS的免疫治療提供新思路和策略。

本研究選取初診ACS患者為研究對(duì)象，檢測(cè)M-MDSC及相關(guān)細(xì)胞因子在外周血中的表達(dá)水平。

首先，與HC組相比，M-MDSC表達(dá)水平在ACS和SAP患者中呈異常高表達(dá)狀態(tài)，且在ACS患者中表達(dá)水平更高。這與ACS患者異常的免疫系統(tǒng)激活密切相關(guān)[11]。高表達(dá)狀態(tài)的M-MDSC可能抑制了ACS患者的炎癥免疫反應(yīng)，從而具有保護(hù)心肌細(xì)胞免受炎癥細(xì)胞因子損傷的作用。進(jìn)一步對(duì)ACS亞型分析發(fā)現(xiàn)，M-MDSC在STEMI患者中表達(dá)水平相比NSTEMI和UA患者顯著升高，這表明STEMI的發(fā)生伴隨有機(jī)體免疫系統(tǒng)更深度地激活。

前期研究表明，GM-CSF和IL-6可通過(guò)激活P-STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)MDSC在微環(huán)境中的擴(kuò)增和聚集[12-13]。本研究中，ACS患者的GM-CSF、IL-6和Arg-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，并且與高表達(dá)狀態(tài)的M-MDSC呈正相關(guān)。這表明在病理?xiàng)l件下，ACS患者嚴(yán)重的全身性炎癥反應(yīng)、GM-CSF和IL-6等炎癥因子的釋放以及局部微環(huán)境的改變可能是誘導(dǎo)MDSC擴(kuò)增的基礎(chǔ)。ACS患者冠狀動(dòng)脈斑塊破裂時(shí)的全身性炎癥反應(yīng)刺激骨髓向外周血釋放更多的MDSC。提示ACS患者M(jìn)DSC的擴(kuò)增與其免疫異常激活及多種炎癥細(xì)胞因子分泌相關(guān)。MDSC通過(guò)細(xì)胞之間直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用[14]。本研究中，初診ACS患者外周血中Arg-1 mRNA水平明顯升高。因此，MDSC可能通過(guò)Arg-1介導(dǎo)的免疫抑制增強(qiáng)機(jī)制，從而負(fù)向調(diào)控ACS患者異常炎癥激活狀態(tài)，延緩全身炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)展。

經(jīng)治療后，初診ACS患者外周血中M-MDSC、GM-CSF、IL-6和Arg-1 mRNA表達(dá)水平較治療前均明顯下降。這表明，隨著ACS患者機(jī)體炎癥狀態(tài)的減輕，GM-CSF和IL-6等炎癥細(xì)胞因子的分泌減少，誘導(dǎo)產(chǎn)生M-MDSC能力下降，M-MDSC的表達(dá)水平亦顯著下降。因此，M-MDSC可能作為評(píng)估ACS患者療效的新指標(biāo)。本研究也存在一定的局限性，一是樣本量有限，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以證實(shí)該結(jié)論的可靠性；二是雖然我們證實(shí)M-MDSC在ACS患者中顯著升高，參與疾病的免疫調(diào)控，但距離臨床應(yīng)用尚需更深入地明確其作用機(jī)制。

本研究表明，ACS患者存在異常的免疫系統(tǒng)激活，誘導(dǎo)了M-MDSC的擴(kuò)增和聚集，以維持免疫穩(wěn)態(tài)。M-MDSC在ACS發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用，或許有望能成為ACS治療的新靶點(diǎn)。

利益沖突：無(wú)