蘭州地區(qū)白三葉根瘤菌分離鑒定與篩選

蘭曉君，金艷麗，姚拓，周恒，張建貴，李昌寧，楊曉玫，陳建綱

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中?美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

白三葉（Trifolium repens）又名車軸草、白花三葉草、荷蘭翹搖等，原產(chǎn)于歐洲、北非和亞洲西部等，是豆科車軸草屬的重要牧草，因其建植成本低、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性強(qiáng)（抗熱抗寒性強(qiáng)，可在酸性土壤中旺盛生長，也可在砂質(zhì)土中生長，在我國各地均有種植。除飼用外，還廣泛用作城市綠化、綠肥、蜜源和藥材等［1］。蘭州地區(qū)白三葉主要用于城市綠化，綠期長達(dá)250 d［2］。

根瘤菌在氮限制條件下，與特定宿主植物形成共生關(guān)系，在宿主根部誘導(dǎo)根瘤的形成［3］。在根瘤中，來自大氣的氮轉(zhuǎn)化為氨，然后被氨化為氨基酸、核苷酸和其他細(xì)胞成分，宿主植物以根瘤菌固定的氨作為氮源，并為根瘤菌提供了碳源，因此根瘤菌與其宿主植物共生是互惠互利，在農(nóng)業(yè)以及地球氮循環(huán)中都具有重要意義。

早前研究報(bào)道從白三葉根瘤中分離到的根瘤菌種有豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）、安徽根瘤菌（R. anhuiense）、高盧根瘤菌（R. gallicum），葡萄牙根瘤菌（R. lusitanum）、蠶豆根瘤菌（R. fabae）、R.laguerreae、放射根瘤菌（R. radiobacter）、洪特拉根瘤菌（R. huantiense）、蒙古根瘤菌（R. mongolense）、R.phaseoli、苜蓿 中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、Burkholderia phytofirmans、Burkholderiales bacterium和中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）的菌種［4］，但有確切文獻(xiàn)報(bào)道能與白三葉結(jié)瘤固氮的只有豌豆根瘤菌（R. leguminosarum）的菌株［5-7］，因此有必要研究和發(fā)現(xiàn)新的誘發(fā)白三葉結(jié)瘤固氮的根瘤菌種類和結(jié)瘤固氮能力突出的菌株。

本研究從蘭州市黃河邊綠化帶種植的白三葉根瘤中分離出疑似根瘤菌菌株，通過形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA 序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹鑒定根瘤菌的種類，通過沙培法回接進(jìn)行結(jié)瘤試驗(yàn)，測定對照及接種不同根瘤菌株白三葉的結(jié)瘤情況、生物量及營養(yǎng)指標(biāo)，明確使蘭州白三葉結(jié)瘤固氮的根瘤菌種類，篩選高效的白三葉共生根瘤菌菌株，為制作白三葉根瘤菌菌肥收集菌種資源。

1 材料和方法

1.1 樣本的采集與處理

2016年9月從甘肅省蘭州市北濱河路邊綠化帶（N36°09'67.6" N，E 103°69'89.3"），選擇生長健壯的白三葉植株，從其根部收集粉色、飽滿的根瘤，裝入樣品袋內(nèi)，4 ℃運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)收集白三葉的種子，以供回接試驗(yàn)使用。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（YMA）：10 g 甘露醇，0.5 g 酵母粉，0.3 g 磷酸氫二鉀，0.2 g 無水硫酸鎂，0.1 g 氯化鈉，18 g 瓊脂粉，1 升雙蒸水，pH 值7.0［8］。

篩選培養(yǎng)基（YMA 剛果紅培養(yǎng)基）：YMA 培養(yǎng)基滅菌后，1 L 加入過濾滅菌的0.25%的剛果紅溶液10 mL，搖勻后倒平板。

NA 培養(yǎng)基購自BD Difco 公司。

1.3 根瘤菌分離純化與保存

用清水將根瘤表面雜質(zhì)沖洗干凈，無菌濾紙吸干水分。生物安全柜內(nèi)，將根瘤樣品先后浸入75%乙醇內(nèi)1 min，次氯酸鈉溶液（4%有效氯）1 min，75%乙醇1 min，無菌水沖洗6 次，第6 次沖洗后的水涂布在NA平板上進(jìn)行根瘤表面滅菌效果評估；根瘤在無菌濾紙上吸干水分，取0.5 g 放置在無菌研缽內(nèi)，加入4.5 mL無菌水研磨，梯度稀釋至10-3，在篩選培養(yǎng)基上涂布10-2和10-3稀釋液各20 μL；28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，從平板上選取沒有吸收剛果紅的圓形、凸起、質(zhì)黏、邊緣整齊、略透明或半透明的典型菌落，在YMA 培養(yǎng)基上四區(qū)劃線分純，純化后的菌株接入YMA 培養(yǎng)基斜面4 ℃短期保存，試驗(yàn)后有研究和應(yīng)用價(jià)值的菌株與滅菌的20% 甘油溶液混勻并分裝至凍存管中-80 ℃長期保存。

1.4 菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性檢測

純化后的菌株在YMA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)，使用Hucker 法檢測革蘭氏反應(yīng)［9］，光學(xué)顯微鏡放大1 000 倍觀察細(xì)胞形態(tài)，用壓滴法觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性。菌株接種在YMA 培養(yǎng)基上，分別在4、8、10、16、20、25、30、35、40、42、45 和50 ℃條件下培養(yǎng)10 d 以檢測菌株的溫度耐受范圍；調(diào)整YMA 液體培養(yǎng)基，使該培養(yǎng)基氯化鈉的含量分別為0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%和2%，接入100 μL待測菌液振蕩培養(yǎng)10 d（200 r/min，28 ℃），測定氯化鈉耐受范圍；pH 耐受試驗(yàn)是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入如下的緩沖液：pH 值5.0，HAC?NaAC；pH 值6.0，NaOH?KH2PO4；pH 值7.0，NaOH?KH2PO4；pH 值8.0，NaOH?KH2PO4；pH 值9.0，Borax?Boric acid；pH 值10.0，Bo?rax?NaOH；pH 值11.0，Na2HPO4?NaOH；28 ℃振蕩培養(yǎng)（200 r/min），每2 天觀察1 次［10］。氧化酶、接觸酶、淀粉水解、纖維素分解、需氧性測定、碳源利用、氮源利用和檸檬酸鹽利用等生化和生理指標(biāo)檢測參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》描述的方法［11］。

1.5 菌株16S rRNA 擴(kuò)增與系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（北京艾萊德生物科技有限公司）提取細(xì)菌基因組DNA，使用細(xì)菌16S rRNA 通 用 引 物：27F（5′?GAGTTTGATCCT GGCTCAG ? 3′）和1492r（5′-TACGGCTACCT TGTTACGACTT?3′）進(jìn) 行 擴(kuò) 增，PCR 擴(kuò) 增 條 件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃∞；擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測 序 結(jié) 果 在EzBioCloud 網(wǎng) 站（https：//www. ezbio?cloud.net/）與NCBI 的Genbank 數(shù)據(jù)庫中的模式菌株序列比對分析，并獲取序列相近模式菌株的16S rRNA 序列，使用MEGA7.0 軟件，鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值為1 000［12-15］。

1.6 根瘤菌回接試驗(yàn)

以石英砂（滅菌）為基質(zhì)裝入塑料杯后放入盛有Hoagland 無氮營養(yǎng)液的容器中，選取飽滿的白三葉種子用75%的乙醇和次氯酸鈉（4%有效氯）表面滅菌，將滅菌后的種子放置在底部鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，26 ℃培養(yǎng)至發(fā)芽，后移栽至塑料杯內(nèi)，每杯10 株。待長出3 片真葉后接種濃度為108cfu/mL 的根瘤菌菌液，以加無菌液為對照，45 d 后檢測植株結(jié)瘤情況。

1.7 菌株接種效果測定

接種根瘤菌菌液45 d 后測定植株結(jié)瘤數(shù)、株高、每株地上部分鮮重和干重、粗蛋白、粗脂肪和粗纖維含量等指標(biāo)；粗蛋白含量采用凱氏定氮法，粗脂肪含量采用索氏脂肪提取器提取法，粗纖維含量采用酸性洗滌劑法［16-17］。

1.8 根瘤固氮酶活性測定

將剪下的根瘤稱重后置于10 mL 的西林瓶內(nèi)，硅膠塞封口后用注射器從瓶內(nèi)抽出1 mL 氣體再注入1 mL 純乙炔氣體，1 h 后采用乙炔還原法測定固氮酶活性［18］，每個(gè)樣本3 次重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對回接試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)與生理生化特征

本研究共分離到疑似根瘤菌菌株6 株，編號為GAU?00001~GAU?00006。6 株菌株之間形態(tài)學(xué)與生理生化特性差別不大。pH 耐受范圍：菌株GAU?00001 和GAU?00006 略寬于其余菌株；菌株GAU?00006 能夠利用D?果糖和丙酮酸鹽為唯一碳源，而其他菌株不能；所有菌株都表現(xiàn)出一定的耐鹽特性（能夠在氯化鈉含量≤1%的培養(yǎng)基中生長）。菌株具體特性見表1。

表1 菌株的形態(tài)學(xué)與生理生化特性Table 1 Morphological and physiological and biochemical characteristics of strains

2.2 菌株16S rRNA 序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

分離的6 株疑似根瘤菌16S rRNA 序列之間相似性大于99.9%，這些序列在EzBiocloud 網(wǎng)站中與NCBI 數(shù)據(jù)庫中模式菌株比對結(jié)果顯示與R. an?huiense、R. laguerreae、R. leguminosarum和R. sopho?rae的相似性最高（99.77%~99.92%），臨近法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）顯示6 株疑似根瘤菌聚類在一起與R. anhuiense、R. laguerreae、R. leguminosarum和R. so?phorae構(gòu)成一個(gè)分支，表明這6 株疑似根瘤菌是根瘤菌屬的成員。

圖1 6 個(gè)菌株與其相關(guān)根瘤菌屬模式菌株16S rRNA 序列基于鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16SrRNA gene sequences showing the relationships among six strains and closely related species of the genusRhizobium

2.3 回接試驗(yàn)

接種菌株GAU?00001、GAU?00002、GAU?00005和GAU?00006 的白三葉根系結(jié)瘤，對照（CK）及接種菌株GAU?00005 和GAU?00006 的植株根系沒有結(jié)瘤（表2）。

2.4 菌株接種效果測定

接種菌株GAU?00001、GAU?00002、GAU?00005和GAU?00006 的白三葉根系根瘤檢測出固氮酶活性，4 個(gè)菌株接種后形成的根瘤數(shù)量沒有明顯差異，但根瘤的固氮酶活性表現(xiàn)為接種GAU?00001 和GAU?00006 的明顯高于接種GAU?00002 和GAU?00005；接種 菌 株GAU?00001、GAU?00002、GAU?00005 和GAU?00006 的植株其株高、鮮重、干重、粗纖維和粗脂肪含量之間沒有明顯差異，但優(yōu)于對照和接種GAU?00003 和GAU?00004 的植株；接種菌株GAU?00001 和GAU?00006 的植株粗蛋白含量明顯高于對照組接種其他根瘤菌株（表2）。

表2 根瘤菌回接試驗(yàn)測定指標(biāo)Table 2 Experimental data of the white clove inoculated the stains GAU-00001 to GAU-00006

3 討論

本研究從白三葉根瘤內(nèi)所分離的6 株菌，菌落形態(tài)表現(xiàn)為凸起、質(zhì)黏、乳白色、半透明、在YMA 剛果紅培養(yǎng)基上生長不吸收剛果紅，符合典型根瘤菌的菌落特征；另外16S rRNA 測序結(jié)果與根瘤菌屬的模式菌株相似性最高，且與R. anhuiense、R. laguerreae、R. le?guminosarum和R.sophorae共同構(gòu)成一個(gè)分支（圖1），說明6 株菌株屬于根瘤菌屬，但由于6 株菌株和4 株模式菌的任何一株都沒有形成單獨(dú)的分支，因此不能確定這6 株菌是4 個(gè)模式菌株中的哪一個(gè)種；以系統(tǒng)進(jìn)化分析而言，這6 株菌株更可能構(gòu)成一個(gè)單獨(dú)的分類單元。16S rRNA 雖然是細(xì)菌進(jìn)化的分子鐘，但畢竟信息量有限（1 600 bp），對于部分細(xì)菌分類無法明確到種的水平，雖然有研究表明一些看家基因（RecN，GyrB，rpoB，SodA，ThrC，DnaK和GroEL等）能夠?qū)ΨN水平的鑒定有所幫助，但精準(zhǔn)的鑒定更有賴于全基因組雜交來證實(shí)。

4 種模式根瘤菌中，只有R.leguminosarum能使白三葉結(jié)瘤固氮［19］，沒有R. sophorae與R. anhuiense不能使白三葉結(jié)瘤［20-21］，R. laguerreae能否使白三葉結(jié)瘤固氮的報(bào)道，因此根瘤菌與宿主結(jié)瘤固氮的專一性是某種根瘤菌自身的重要特性但不是鑒別根瘤菌種的必要特性；此外文獻(xiàn)報(bào)道R. sophorae能使菜豆（Phaseolus vulgaris）和苦參（Sophoraflavescens）結(jié)瘤固氮［20］，R. laguerreae被證實(shí)能使蠶豆（Vicia faba）結(jié)瘤固氮［22］，R. anhuiense能使豌豆（Pisumsativum）和蠶豆結(jié)瘤固氮［21］，因此本研究所分離的菌株有使菜豆、苦參、蠶豆和豌豆這4 種豆科植物結(jié)瘤的可能，有必要進(jìn)一步的研究以確定這6 株根瘤菌的宿主范圍。

菌 株GAU?00001、GAU?00002、GAU?00005 和GAU?00006 使白三葉結(jié)瘤且所結(jié)根瘤檢測出固氮酶活性，對應(yīng)植株的生理特征、生物量和營養(yǎng)成分含量也優(yōu)于對照和接種GAU?00003 和GAU?00004 的植株；菌株GAU?00001 和GAU?00006 所誘導(dǎo)產(chǎn)生的根瘤固氮酶活性高于菌株GAU?00002 和GAU?00005，對應(yīng)植株的粗蛋白含量也表現(xiàn)出同樣的特點(diǎn)。因此菌株GAU?00001 和GAU?00006 表現(xiàn)出優(yōu)良根瘤菌的特性。從接種的總體效果來看，本研究中接種根瘤菌的植株與CK 相比，株高、鮮重、干重和部分營養(yǎng)指標(biāo)差異顯著，與前人的研究一致［5］。對于菌株GAU?00003 和GAU?00004 沒有與白三葉識(shí)別并結(jié)瘤固氮，可能的原因是這兩株根瘤菌缺失相關(guān)的共生基因或者共生基因發(fā)生突變而導(dǎo)致無法合成或分泌結(jié)瘤因子與白三葉根部分泌的信號分子相互識(shí)別，但這一推測有待于進(jìn)一步的研究論證。

4 結(jié)論

（1）從蘭州白三葉根瘤內(nèi)分離的6 株根瘤菌均鑒定為Rhizobiumsp.

（2）菌株GAU?00001 和GAU?00006 為可使白三葉結(jié)瘤固氮的優(yōu)良高效根瘤菌菌株，可用于白三葉菌肥的生產(chǎn)。