微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)糖蜜含糖量的研究

周培華，劉 蘭，鐘文濤，楊 滔，周興旺，袁列江

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410017）

糖蜜是制糖過(guò)程中，糖液經(jīng)濃縮析出結(jié)晶糖后殘留的棕褐色黏稠液體。在我國(guó)的微生物發(fā)酵工業(yè)尚不成熟前，曾一直被當(dāng)作制糖業(yè)的廢棄物，給環(huán)境造成了較為嚴(yán)重的污染。糖蜜的成分復(fù)雜，其最主要的營(yíng)養(yǎng)成分是糖，含糖量在40%～80%，多為聚合度不等的多元糖和一定數(shù)量的單糖，此外還含有較豐富的維生素、植物蛋白氨基酸、果膠等[1-2]。

如今，糖蜜的廢物利用已形成較為完善的工業(yè)加工體系，作為一種重要的食品工業(yè)發(fā)酵原料進(jìn)入市場(chǎng)，并被廣泛應(yīng)用于釀酒酵母、面包酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、丁醇、氨基酸多肽、蝦青素和單細(xì)胞蛋白飼料等食品發(fā)酵相關(guān)行業(yè)[3-7]。由于其營(yíng)養(yǎng)較豐富且價(jià)格相對(duì)廉價(jià)，因此糖蜜作為食品工業(yè)原料常呈現(xiàn)供不應(yīng)求的狀態(tài)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年國(guó)內(nèi)全年糖蜜生產(chǎn)交易量為3863萬(wàn)t，此外還有進(jìn)口糖蜜1209萬(wàn)t， 價(jià)格從2015年的800元/t左右逐年上升，截止到2021年 9月平均價(jià)格為1100元/t[8]。

目前，在糖蜜市場(chǎng)的交易中用以衡量糖蜜品質(zhì)的核心指標(biāo)是其含糖量的多少。由于糖蜜交易極為頻繁，因此要求檢測(cè)過(guò)程快速、高效。但常規(guī)的含糖量檢測(cè)周期太長(zhǎng)，且由于糖蜜中的糖分多為混合糖類，聚合單元繁雜，不太適合使用常規(guī)的含糖量檢測(cè)方法，因此目前在糖蜜交易過(guò)程中依然采用最簡(jiǎn)單、粗放的折光儀檢測(cè)[9]。折光儀的本質(zhì)是檢測(cè)可溶性固形物含量，只適用于成分較為單一的糖液含糖量檢測(cè)評(píng)判，而糖蜜中的其他多種物質(zhì)對(duì)固形物含量都有影響，因此采用折光儀檢測(cè)含糖量偏差非常大。一些不規(guī)范的糖廠及中間商在糖蜜中加入非糖類的可溶性固形物，以次充好，極大地?cái)_亂了糖蜜市場(chǎng)，對(duì)下游的食品發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域造成較大的經(jīng)濟(jì)損失和工藝負(fù)擔(dān)。此外，食品發(fā)酵企業(yè)為了對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行工藝設(shè)計(jì)和計(jì)算，需準(zhǔn)確測(cè)量糖蜜的含糖量。目前，在以糖蜜為原料進(jìn)行生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的企業(yè)大都采用生物酶總糖檢測(cè)試劑盒，該試劑盒采用進(jìn)口酶制劑將聚合度不同的糖水解為葡萄糖，再用紫外吸光光度法檢測(cè)葡萄糖進(jìn)而得到糖蜜的含糖量。該方法檢測(cè)成本較高，生產(chǎn)企業(yè)一般無(wú)法承受對(duì)來(lái)源不同、批次不一的糖蜜進(jìn)行頻繁檢測(cè)，因此只能進(jìn)行代表性地抽檢，給發(fā)酵工業(yè)和工藝帶來(lái)了很多不確定性，給生產(chǎn)和品質(zhì)造成了很大影響。個(gè)別實(shí)驗(yàn)室依然采用傳統(tǒng)的硫酸蒽酮法檢測(cè)糖蜜含糖量，但是此方法的本質(zhì)是檢測(cè)總碳水化合物，在檢測(cè)糖蜜這種含有果膠成分的混合物時(shí)會(huì)出現(xiàn)較大偏差，且使用濃硫酸碳化樣本，全程需要在沸水和冰凍環(huán)境中切換操作，不僅危險(xiǎn)而且極為 煩瑣[10]。

針對(duì)目前尚沒(méi)有一種高效、準(zhǔn)確的糖蜜含糖量檢測(cè)方法，本文通過(guò)對(duì)糖蜜含糖量檢測(cè)的分析和研究，采用微生物發(fā)酵和折光儀聯(lián)用的方法檢測(cè)糖蜜的含糖量，準(zhǔn)確且高效，以期規(guī)范糖蜜的品質(zhì)衡量指標(biāo)，改變目前糖蜜市場(chǎng)的混亂局面，也為以糖蜜為原料的發(fā)酵生產(chǎn)企業(yè)降低檢測(cè)成本提供方法和思路，從而保證相關(guān)工藝優(yōu)化和產(chǎn)品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（高糖）（廣西丹寶利酵母有限公司）；嗜滲酵母CICC32788（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；PDA瓊脂培養(yǎng)基、BHI腦心肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖（北京陸橋）；多糖檢測(cè)試劑盒（德國(guó)拜發(fā)EnzyTECtm）；糖蜜（市購(gòu)樣品）；VINASE干 粉（市購(gòu)）。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1/2折光儀（日本ATAGO）；SPS401F電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；MIR-154-PC恒溫培養(yǎng)箱（日本Panasonic）；T9紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（北京普析）；101-3AB干燥箱（天津泰斯特）；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF）；HWS-28水浴鍋（上海一恒）；C-MAGHS7加熱磁力攪拌器（德國(guó)IKA）。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取適量葡萄糖，于100 ℃±2 ℃減壓干燥箱內(nèi)烘至恒重。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取烘干后的葡萄糖100.00 mg，置于10 mL容量瓶中，用純水溶解并稀釋至10 mL，搖勻，制成濃度為10.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃保存。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取10.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、 6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL至10 mL容量瓶并定容至10 mL，濃度依次為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、 4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL和 10.0 mg/mL，臨用新配。

1.3.2 菌株活化菌懸液制作

將釀酒酵母干粉0.0100 g使用無(wú)菌水10.0 mL溶解后劃線至PDA平板，挑取較大單菌落接種至BHI肉湯，36 ℃培養(yǎng)24 h，8000 r/min離心5 min去除上清液，加入30%（W/W）滅菌甘油溶液混勻，分裝并凍存。臨用時(shí)常溫解凍，8000 r/min離心2 min去除上清液，加入滅菌生理鹽水搖勻備用。

1.3.3 糖蜜前處理

稱取糖蜜原液5 g，加入純水45 mL稀釋搖勻，5000 r/min離心2 min除泥，留取上清液S作為糖蜜待檢樣。

1.3.4 試劑盒檢測(cè)糖蜜含糖量

取德國(guó)拜發(fā)EnzyTECtm多糖檢測(cè)試劑盒，每 5 mL待測(cè)樣品加入5 mL酶解液，65 ℃酶解6 h；加入著色試劑0.2 mL，85 ℃著色30 min，于505 nm處檢測(cè)吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算糖蜜含糖量。

1.3.5 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)糖蜜含糖量

分別選取市售釀酒酵母干粉和嗜滲酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株，活化后制作成即用型菌懸液；糖蜜10倍稀釋待測(cè)液，各取2管等量5 mL分別加入10 mL離心管，分別標(biāo)記為S0和S1，分別加入5 mL菌懸液，其中S0加入菌懸液后立即煮沸滅活，S1加入菌懸液，36 ℃ 培養(yǎng)2 h后，分別離心取上清液，折光儀檢測(cè)錘度，分別得到錘度S0、S1，兩者之差可換算得出糖蜜中的含糖量。同時(shí)采用德國(guó)拜發(fā)含糖量試劑盒檢測(cè)糖蜜含量，用以分析比較兩種方法檢測(cè)含糖量的準(zhǔn)確度。

1.3.6 對(duì)比分析統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法

微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)糖蜜含糖量的計(jì)算公式如下：

式中：S0為空白的糖錘度值，Bx；S1為酵母發(fā)酵后的糖錘度值，Bx；V為稀釋倍數(shù)；m為樣品取樣量，g。

多糖檢測(cè)試劑盒紫外可見(jiàn)光光度計(jì)含糖量的計(jì)算公式如下：

式中：axOD為測(cè)定曲線斜率；b為測(cè)定曲線截距：V為稀釋倍數(shù)；m為取樣量，g。

兩種方法含糖量檢測(cè)值偏差的計(jì)算公式如下：

1.3.7 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)糖蜜加標(biāo)回收及干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

（1）葡萄糖加標(biāo)回收。每份糖蜜待測(cè)樣品取3份，各取10 mL，其中2份分別加入葡萄糖0.5 g、2.0 g，1份作為本底對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，溶解完全后采用微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)其回收率。

（2）干擾實(shí)驗(yàn)。每份糖蜜待測(cè)樣品取3份，各取10 mL，其中2份分別加入酵母發(fā)酵廢液干粉（VINASE干粉）0.5 g、2.0 g，1份作為本底對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，溶解完全后采用微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)含糖量。考察添加非糖類可溶性固形物對(duì)該方法檢測(cè)糖蜜含糖量的干擾。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒法檢測(cè)葡萄糖標(biāo)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

試劑盒法檢測(cè)葡萄糖標(biāo)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 試劑盒法檢測(cè)葡萄糖標(biāo)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀法與試劑盒檢測(cè)糖蜜含糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)12個(gè)糖蜜樣品分別采用釀酒酵母發(fā)酵、嗜滲酵母聯(lián)用折光儀和多糖檢測(cè)試劑盒法檢測(cè)結(jié)果的分析比較，以釀酒酵母作為發(fā)酵菌株實(shí)驗(yàn)組，偏差范圍在-7.70%～2.32%，平均絕對(duì)偏差為2.28%。

以嗜滲酵母作為發(fā)酵菌株實(shí)驗(yàn)組，偏差范圍在-1.50%～2.00%，平均絕對(duì)偏差為0.46%，嗜滲酵母聯(lián)用折光儀檢測(cè)含糖量結(jié)果非常接近多糖檢測(cè)試劑盒法的檢測(cè)結(jié)果，詳見(jiàn)圖2。

圖2 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀法與試劑盒檢測(cè)結(jié)果

2.3 微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀法加標(biāo)回收及抗干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 葡萄糖加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用嗜滲酵母法作為發(fā)酵菌株，每份糖蜜待測(cè)樣品取3份，各取10 mL，其中2份分別加入葡萄糖0.5 g、2.0 g，1份作為本底對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，溶解完全后采用折光儀檢測(cè)其回收率，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。葡萄糖回收實(shí)驗(yàn)組中，加入量0.5 g實(shí)驗(yàn)組回收率在84.0%～106.0%，平均回收率高達(dá)90.8%；加入量 2.0 g實(shí)驗(yàn)組回收率在94.8%～105.2%，平均回收率高達(dá)100.5%。

表1 葡萄糖加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 非糖可溶性固形物對(duì)新建方法的干擾實(shí)驗(yàn)

采用嗜滲酵母法作為發(fā)酵菌株，每份糖蜜待測(cè)樣品取3份，各取10 mL，其中2份分別加入酵母發(fā)酵廢液干粉（市售VINASE干粉）0.5 g、2.0 g，1份作為本底對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，溶解完全后采用折光儀檢測(cè)含糖量，考察添加非糖類可溶性固形物對(duì)該方法檢測(cè)糖蜜含糖量的干擾，結(jié)果見(jiàn)表2。非糖可溶性固形物實(shí)驗(yàn)組中，加入量0.5 g實(shí)驗(yàn)組偏差在-2.4%～1.1%，平均絕對(duì)偏差僅為0.4%；加入量2.0 g實(shí)驗(yàn)組偏差在-3.5%～1.7%，平均絕對(duì)偏差僅為-1.1%。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，非糖固形物粉狀的加入對(duì)于微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)糖蜜的穩(wěn)定性無(wú)影響。

表2 非糖可溶性固形物對(duì)嗜滲酵母發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)糖蜜含糖量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)多糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)法的核心是使用微生物提取和純化一系列糖苷水解酶，將糖蜜中聚合度復(fù)雜的多聚糖水解成單糖，再利用著色劑顯色，于505 nm處檢測(cè)吸光度從而檢測(cè)其含糖量。本文研究初期選定酵母系列，正是基于該系列微生物的糖苷酶極為豐富，可水解消耗糖蜜中的多聚合度糖，最終產(chǎn)物是乙醇和二氧化碳，在加熱過(guò)程中揮發(fā)，在空白對(duì)照折光度扣除消耗組的折光度后即可得到糖蜜中的含糖量。

先以多糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果為對(duì)照值，微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀使用菌株同時(shí)考察釀酒酵母和嗜滲酵母，檢測(cè)糖蜜含糖量，兩種菌株的檢測(cè)結(jié)果均較理想，但嗜滲酵母實(shí)驗(yàn)組偏差范圍更小，平均絕對(duì)偏差僅為0.46%，可能是由于嗜滲酵母抗逆性效果更好，在組分較為復(fù)雜的糖蜜樣品中更能穩(wěn)定地發(fā)揮其糖苷酶活性，故最終選定嗜滲酵母CICC32788作為該方法的發(fā)酵菌株。

通過(guò)葡萄糖添加實(shí)驗(yàn)考察新建立方法的準(zhǔn)確度，在低糖加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中的平均回收高達(dá)90.8%，在高糖加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中更是高達(dá)100.5%，充分說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性較好；通過(guò)添加VINASE干粉（市售非糖性可溶性固形物）至糖蜜樣本，采用微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀檢測(cè)樣本的含糖量，檢測(cè)新建方法的抗干擾能力。結(jié)果顯示，偏差值均小于2.0%，平均絕對(duì)偏差均小于0.5%，說(shuō)明該方法的抗干擾能力較強(qiáng)，能解決目前糖蜜交易市場(chǎng)中普遍存在的不規(guī)范添加固形物的問(wèn)題，有效杜絕糖蜜交易過(guò)程中以次充好的現(xiàn)象。

此外，新建方法的檢測(cè)時(shí)間大幅縮短，不需要漫長(zhǎng)的酶解時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、OD值檢測(cè)時(shí)間，且只用到折光儀這類簡(jiǎn)單儀器。

綜上所述，微生物發(fā)酵聯(lián)用折光儀法是一種低成本、低門檻、高效率的糖蜜含糖量檢測(cè)方法，具有優(yōu)異的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，可被廣泛應(yīng)用于糖蜜生產(chǎn)、交易、加工行業(yè)。